張凱倫，羅祖良，郭玉華，石宏武，馬小軍,2*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100)

·綜述·

bHLH轉錄因子調控藥用植物萜類化合物生物合成的研究進展△

張凱倫1，羅祖良1，郭玉華1，石宏武1，馬小軍1,2*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100)

萜類是種類最多的植物次生代謝產物，具有廣泛的藥理活性，但含量低是普遍存在的問題。轉錄因子(transcription factor，TFs)能在轉錄水平上調控次生代謝合成途徑中多個基因的協(xié)同表達，與植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、次生代謝、抗逆反應和激素信號有著密切的關系，其中bHLH類轉錄因子是最大的轉錄因子家族之一。隨著bHLH轉錄因子在不同藥用植物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如何在基因工程和代謝工程中應用，提高萜類化合物的產量，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產，滿足廣大患者的需要成為研究的熱點。本文主要總結了近年來bHLH轉錄因子對萜類合成途徑的調控作用。

bHLH轉錄因子；萜類化合物；調控；合成途徑

轉錄因子(transcription factors，TFs)即反式作用分子，在細胞核內能夠特異性識別并結合基因啟動子上的順式作用元件(cis-acting element)，調控基因的時空表達。典型的植物轉錄因子是由核定位信號區(qū)(nuclear localization signal，NLS)、DNA結合區(qū)(DNA binding domain，DBD)、轉錄調控區(qū)(transcription regulation domain，TRD)和寡聚化位點(oligomerization site，OS)組成。根據(jù)其中DNA結合區(qū)氨基酸序列的不同，可分為bHLH結構域、MYB結構域、bZIP結構域、鋅指結構域、MADS結構域、AP2/EREBP結構域、Homeo結構域等，其中一些結構域又可根據(jù)氨基酸殘基的數(shù)量和位置劃分為幾個亞類[1]。本文對含有bHLH結構域的植物bHLH家族轉錄因子進行綜述。

bHLH(basic helix-loop-helix，bHLH)類轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一。近幾年，已鑒定的bHLH轉錄因子的數(shù)量大量增加，在植物的生長發(fā)育、抗逆性、信號轉導及次生代謝調控等方面有重要作用[2-6]。至今在植物中已發(fā)現(xiàn)600多種bHLH轉錄因子，已經完成系統(tǒng)性鑒定和分類的有擬南芥Arabidopsisthaliana、楊樹Populustrichocarpa、水稻Oryzasativa、番茄Solanumlycopersicum、大白菜Brassicarapassp.pekinensis等高等植物[7-9]。

1 bHLH轉錄因子的結構

bHLH轉錄因子結構域由兩個相連的基本亞區(qū)構成(約60個氨基酸殘基)，即堿性氨基酸區(qū)域(basic region)和α螺旋1-環(huán)-α螺旋2區(qū)域(HLH region)。堿性區(qū)對基因的轉錄有調控作用，負責與DNA上的順式作用元件E-box(5′-CANNTG-3′)結合，其中81%的順式作用元件為其亞型G-box(5′-CACGTG-3′)。HLH區(qū)域主要負責蛋白與蛋白間的相互作用，形成同型或異型二聚體。例如，擬南芥中bHLH轉錄因子PIF3(phytochrome interacting factor3)不僅能自身形成同型二聚體，還能與HFR1(long hypocotyl in far-red)蛋白結合形成異型二聚體，參與光敏色素A的信號轉導[10-11]。bHLH還可以與其他轉錄因子家族，如MYB類轉錄因子形成二聚體或三聚體發(fā)揮作用。例如，參與花青素合成的MBW(MYB-bHLH-WD40)三聚體轉錄因子復合物[12]。還有一些缺少堿性區(qū)的bHLH蛋白，能通過與其他bHLH蛋白形成二聚體，抑制目標基因的表達[9]。此外，轉錄因子還可以形成非DNA結合二聚體。例如，擬南芥中的 bHLH類轉錄因子MYC2與bZIP類轉錄因子GBF1在植物體內并不直接結合形成異型二聚體，而是分別與基因啟動子區(qū)鄰近但堿基種類不同的E-box結合而產生相互拮抗作用[13]。

2 bHLH轉錄因子的分類

目前，已利用全基因組測序從擬南芥Arabidopsisthaliana、水稻Oryzasativa、煙草Nicotianatabacum、葡萄(Vitisvinfera、番茄Solanumlycopersicum等模式植物中分別獲得164個、180個、190個、至少191個、159個bHLH轉錄因子[7，14]。對這些bHLH轉錄因子主要采用的分類方法與相結合的基因啟動子上順式作用元件的序列有關。有研究者[15-16]根據(jù)bHLH的堿性DNA結合模式，將bHLH分為A、B、C、D、E共5個組。A組bHLH蛋白可以與E-box(5′-CANNTG-3′)保守序列結合；B組能與G-box(5′-CACGTG-3′)基序特異性結合；C組由B組進化而來，具有1～2個PAS結構域(DrosophilaPeriod-human Arnt-DrosophilaSingle-minded domains)；D組沒有堿性DNA結合區(qū)，不能結合DNA，可能通過與其他能夠結合DNA的bHLH蛋白形成二聚體而產生負調控作用；E組堿性區(qū)富含脯氨酸或甘氨酸，能夠特異性結合N-box(5′-CACGNG-3′)。植物的bHLH轉錄因子大多屬于B組。由于擬南芥和水稻的全基因組測序完成較早，很多研究者對這兩種植物中的bHLH家族進行了分類。Heim等[17]和Toeldo-Oritz等[11]分別將擬南芥bHLH基因分為12個主要組和21個家族，Lee等[18]將水稻bHLH基因分為22個家族。然而，隨著越來越多擬南芥中非典型bHLH轉錄因子的發(fā)現(xiàn)，具有很大差異的bHLH蛋白無法根據(jù)分類中的保守序列進行預測，如At163KDR、At164PRE5、At165PAR1、At166PAR2等[18-20]，它們的堿性區(qū)有很大的不同，且與DNA結合的序列特征性不強。2010年，Lorenzo等[7]將含有新發(fā)現(xiàn)的非典型bHLH轉錄因子的擬南芥、楊樹、水稻、小立碗蘚和5種藻類的638個bHLH基因根據(jù)已有的擬南芥和水稻bHLH基因家族中與二聚化區(qū)域一致的INTERPRO 001092結構域，重新分成了32個亞家族。然而，由于已知植物bHLH基因序列和bHLH蛋白功能研究開展較少，至今對植物中bHLH的分類仍沒有定論，需待更多植物中bHLH基因序列的發(fā)現(xiàn)和蛋白分析，從中找到規(guī)律進行分類。

3 bHLH轉錄因子對植物萜類次生代謝產物合成的調控

bHLH轉錄因子通過在轉錄水平與相關基因啟動子區(qū)的順式作用元件結合，激活或抑制相關基因的表達，在植物的生長發(fā)育[21]、抗逆反應[22]、次生代謝[23]等過程中起著重要的作用。次生代謝產物萜類化合物是以異戊二烯為結構單元的天然化合物，其在抗腫瘤[24]、抗HIV[25]、防治心腦血管疾病[26]等方面的多種生物活性使得對萜類化合物合成途徑及其調控的研究具有重大意義。

目前，已報道的參與萜類化合物生物合成調控的轉錄因子主要為AP2/ERF和WRKY類型。bHLH轉錄因子主要在黃酮類花青素及生物堿類尼古丁等化合物的合成中發(fā)揮作用，對萜類化合物的調控作用研究相對較少，對已分離出的bHLH轉錄因子的功能鑒定更少。萜類產物代謝合成途徑在長春花Catharanthusroseus和紫杉Taxuscuspidata中的研究最為透徹。以下總結了近年來從藥用植物中發(fā)現(xiàn)的與萜類代謝合成有關的bHLH轉錄因子，其中對轉錄因子的篩選和功能驗證方法值得分析和借鑒。

文獻分析發(fā)現(xiàn)，MYC類轉錄因子是分離數(shù)目最多、研究最徹底的bHLH轉錄因子，同時它也是茉莉素信號途徑的調控因子，已證明其能夠參與長春花、紫杉、擬南芥和西紅柿等植物中萜類生物合成基因的調控。Zhang等[27]在長春花中利用酵母單雜法，以參與萜類吲哚生物堿生物合成的異胡豆苷合成酶(strictosidine synthase，STR)基因啟動子區(qū)G-box的四聚體為誘餌，分離得到5個MYC類轉錄因子CrMYC1-5[28]，其中CrMYC1和CrMYC2證明可能參與長春花中萜類吲哚生物堿的生物合成過程。CrMYC1可以與G-box特異性結合，且在長春花懸浮培養(yǎng)細胞中受真菌誘導子和茉莉酸甲酯的誘導后，CrMYC1和STR基因的mRNA水平均上調，表明CrMYC1可能通過響應這些信號分子來調控STR基因的表達[29]。另外，EMSA(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實驗表明，CrMYC2蛋白能與ORCA3(octadecanoid-derivative responsive Catharanthus AP2-domain protein3，ORCA3)基因啟動子中含有類G-box序列(AACGTG)的JRE序列(jasmonate-responsive element，JRE)結合，且CrMYC2的過表達和敲除能分別提高和降低ORCA的mRNA水平，說明CrMYC2對ORCA基因有激活作用。實驗同時觀察到，CrMYC2對生物堿早期合成基因的表達量無影響，但能調控下游合成基因的表達。為了篩選上游基因的調控因子，Van等[30]結合多個轉錄組數(shù)據(jù)，通過分析長春花中與萜類吲哚生物堿合成途徑上游基因(位于LAMT基因上游)表達模式相同的轉錄因子，鑒定了長春花中另一個非MYC類轉錄因子BIS1(bHLH iridoid synthesis 1)，它能調控生物堿早期合成基因(包括從牻牛兒基焦磷酸到番木鱉酸合成途徑中的所有基因)的轉錄水平，且在懸浮培養(yǎng)細胞中過表達BIS1可以提高環(huán)烯醚萜和單萜吲哚生物堿的積累，至此能夠調控整條合成途徑的轉錄因子已經找到，為長春花中萜類吲哚生物堿的合成生物學研究奠定了理論基礎。

在紫杉中也發(fā)現(xiàn)了4個MYC類轉錄因子。李書濤[31]采用酵母單雜交技術，以二萜紫杉醇合成途徑中的前期步驟基因紫杉二烯合酶基因ts(taxadiene synthase，ts)啟動子中一段響應茉莉酸甲酯的片段(-239/-131)為誘餌，篩選到轉錄因子基因TcMYC，它在中國紅豆杉細胞中的過表達可激活ts基因的表達。酵母單雜交法是最常用的分離轉錄因子的方法，此外，還有利用轉錄組數(shù)據(jù)或突變體等對比有表達差異變化的基因序列，從而篩選候選bHLH轉錄因子再進行驗證的方法。Lenka等[32]通過設計簡并引物及篩選轉錄組數(shù)據(jù)，在紫杉中鑒定了3個受茉莉酸甲酯誘導的MYC轉錄因子TcJAMYC1、TcJAMYC2、TcJAMYC4。EMSA實驗證明，TcJAMYC1可以在體外結合E-box；與一般轉錄因子激活靶基因的作用不同，它們均負調控大多數(shù)參與紫杉醇生物合成基因的表達。在紫杉中僅分析了這4個轉錄因子對基因表達的調控，它們對終產物紫杉醇含量的影響還需進一步驗證。

在擬南芥和番茄中也發(fā)現(xiàn)了MYC類轉錄因子。Hong等[33]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)1個MYC2轉錄因子能與倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的啟動子區(qū)結合，激活兩者的表達，使以(E)-β-石竹烯為主的倍半萜烯的釋放量增加，且能夠與擬南芥中的一個赤霉素信號抑制蛋白RGA(REPRESSOR OF GA1-3，RGA)結合，參與并調控赤霉素和茉莉素信號通路。Spyropoulou等[34]利用番茄莖毛狀體轉錄組數(shù)據(jù)及茉莉酸甲酯處理前后的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選出1個SIMYC1轉錄因子，它在煙草葉片中能瞬時激活4個萜烯合酶基因SlTPS3、SlTPS5、SlTPS7、SlTPS9的啟動子。

除MYC類轉錄因子外，也發(fā)現(xiàn)一些其他類型的bHLH轉錄因子。青蒿素是公認的抗瘧疾良藥，因此尋找調控合成途徑的轉錄因子具有重大的意義。Ji等[35]在黃花蒿轉錄組數(shù)據(jù)庫的3個候選bHLH轉錄因子中利用RACE技術及EMSA和酵母單雜驗證方法分離了1個轉錄因子基因AabHLH1，它在黃花蒿葉片中的過表達能夠強烈激活倍半萜類化合物青蒿素合成途徑中關鍵酶基因ADS和CYP71AV1的表達。植物抗毒素能夠幫助植物對抗外界不良環(huán)境，bHLH也證明能夠參與植物抗毒素合成的調控。Yamamura等[36]在水稻中鑒定了1個能調控二萜類抗毒素(diterpenoid phytoalexins，DPs)合成的bHLH轉錄因子DPF(diterpenoid phytoalexin factor)，它能夠通過結合抗毒素合成途徑酶基因CPS2和CYP99A2啟動子區(qū)的N-box，上調這些基因的轉錄水平，從而促進抗毒素的積累。Mannen等[37]在擬南芥中通過轉錄組數(shù)據(jù)中MEP途徑基因與轉錄因子之間的共表達分析以及觀察轉錄因子對這些基因表達的調控作用，最終篩選出了1個bHLH轉錄因子PIF5(phytochrome-interacting factor 5)，它可能以同源二聚體的形式發(fā)揮作用，在擬南芥T87懸浮培養(yǎng)細胞中的過表達可以促進四萜類化合物類胡蘿卜素的積累。Shang等[38]通過對黃瓜Cucumissativus自然形成的突變體和乙基甲磺酸(ethylmethane sulfonate，EMS)誘導的突變體進行篩選，得到2個分別在黃瓜葉子和果實中特異性表達的bHLH轉錄因子Bl(Bitter leaf)和Bt(Bitter fruit)，這兩個轉錄因子均可與參與黃瓜中三萜類化合物苦味素C(cucurbitacin C，CuC)合成的1個氧化鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase，OSC)、1個脂肪酰轉移酶(acyltransferase，ACT)和7個細胞色素P450(cytochrome P-450 enzymes，P450s)基因的啟動子結合，通過激活這9個基因的轉錄調控黃瓜葉子和果實中苦味素的含量。

羅漢果Siraitiagrosuenorii與黃瓜均屬于葫蘆科植物，親緣關系較近。羅漢果和黃瓜中主要成分均為三萜類化合物，其中羅漢果中參與三萜合成途徑的氧化鯊烯環(huán)化酶基因CS(登陸號：HQ128567.1)與黃瓜中的氧化鯊烯環(huán)化酶基因Bi(登陸號：KM655855.1)有86%的同源性。不同生長時期的羅漢果果實中含有的甜苷V含量差別較大，據(jù)此得到的羅漢果轉錄組數(shù)據(jù)[39]顯示，表達差異較大的轉錄因子為bHLH家族，在轉錄因子家族中數(shù)量最多。并且對羅漢果CS基因啟動子的克隆發(fā)現(xiàn)，其啟動子區(qū)含有G-box(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在黃瓜中發(fā)現(xiàn)了能與Bi基因啟動子E-box結合的轉錄因子，預測羅漢果中可能也有能與CS基因啟動子區(qū)G-box結合的bHLH轉錄因子。由于羅漢果甜苷V是重要的非糖甜味劑，利用轉錄因子的調控作用增加甜苷V的產量必定會給糖尿病患者帶來福音。此外，在紫外輻射下的葡萄漿果果皮轉錄組數(shù)據(jù)中也篩選到了3個候選bHLH轉錄因子，它們可能參與單萜類化合物的生物合成[40]。這些候選bHLH轉錄因子需要我們設計相關實驗進行進一步的篩選和驗證。

除了直接研究參與萜類合成途徑調控的轉錄因子以期促進萜類化合物的積累，還可以通過促進萜類化合物的分泌來提高其含量。很多植物中含有的萜類為揮發(fā)性物質，其分泌與腺毛的分布密度和數(shù)量有關，如薄荷中的精油等[41]。研究表明，腺毛的發(fā)育受bHLH轉錄因子的調控[42]。擬南芥中bHLH類轉錄因子基因GL3的過表達可使腺毛的數(shù)目增加[43]。因此，通過調控與腺毛相關的轉錄因子來促進腺毛的發(fā)育和分泌是另一種可能提高藥用植物中萜類化合物產量的有效手段。

4 展望

近年來，隨著植物全基因組和轉錄組測序的相繼展開，植物中參與萜類化合物代謝途徑的基因也被相繼克隆和功能分析，通過在植物組織或細胞中導入同源或異源基因，能提高代謝產物的含量，但受關鍵限速酶基因難定位、底物或中間產物量少，往往需要導入多個基因共表達等多個因素的限制，研究者的主要關注點轉移到了這些基因表達的初期階段，使從轉錄水平上調控基因表達的轉錄因子成為研究的熱點。以下是圍繞bHLH轉錄因子可以繼續(xù)深入研究的三個方面。

bHLH家族易與其他家族成員轉錄因子結合形成二聚體或三聚體發(fā)揮作用，可以響應多種植物激素及環(huán)境脅迫，也可以參與植物次生代謝產物的調控。為研究轉錄因子各家族之間、轉錄因子與多種信號通路之間、轉錄因子與多個合成途徑之間的聯(lián)系和調控網絡提供可能的分子機制。另外，隨著越來越多的bHLH家族轉錄因子的克隆和結構解析，其分類及進化演變過程有望得到解決。

已克隆的轉錄因子表明，其能不同強度地使基因在不同時空特異性表達。因此可以將分離出的bHLH轉錄因子導入其他植物中，提高植物的抗性，如在檸檬中異源表達枳(Poncirustrifoliata)bHLH類轉錄因子ICE1(Inducer of CBF Expression 1)能提高檸檬在寒冷溫度下的耐受性[44]；或提高其調控的代謝途徑基因的表達量和終產物的含量，如將玉米中的MYC類轉錄因子LC和MYB類轉錄因子C1在番茄果肉中表達，激活其中參與黃酮類成分合成酶基因的表達，從而促進果肉(原本幾乎不生成黃酮類成分)中黃酮類成分含量的積累[45]。植物的性狀也會因為轉錄因子而改變，如水稻中bHLH轉錄因子基因Kala4啟動子區(qū)結構的改變導致花青素合成酶基因表達的上調，花青素的沉淀使稻米種皮顏色變黑，從而促進了黑稻的產生[46]。因此，轉錄因子的應用可以為農作物及花卉等植物的性狀改良和新品種的培育提供廣闊的前景。

藥用植物中次級代謝產物具有良好的藥理活性，但含量普遍較低，因此研究者和工業(yè)生產的主要目標為獲得高產量的次生代謝產物。合成生物學通過在底盤細胞中導入相應生物原件，通過再現(xiàn)植物體中代謝途徑實現(xiàn)活性物質的定向、異源合成，為提高藥用植物次生代謝產物含量提供了新途徑。鑒于萜類化合物的合成途徑已為研究者們所熟知，酵母表達體系培養(yǎng)成本低且發(fā)酵工藝成熟，通過篩選最優(yōu)表達的酵母底盤菌、加入底物并轉化合成酶基因、尋找酵母菌最適的培養(yǎng)條件、從酵母培養(yǎng)液中分離獲得目標產物，已經成為工業(yè)上合成次生代謝產物的趨勢。轉錄因子能夠同時誘導一個或多個基因的協(xié)同表達，是除了尋找強啟動子外另一個可能大幅度提高合成酶基因的表達及活性物質產量的可能方法。然而關于bHLH轉錄因子在合成生物學方面的應用還鮮有報道，對于這方面的研究或許可以作為未來一個新的研究方向，為利用基因工程、發(fā)酵工程和合成生物學技術實現(xiàn)藥用植物中紫杉醇、青蒿素等重要萜類化合物大規(guī)模工業(yè)化生產提供理論基礎，為我國中醫(yī)藥的發(fā)展做出貢獻。

[1] 劉強，張貴友，陳受宜.植物轉錄因子的結構與調控作用[J].科學通報，2000，45(14)：1465-1474.

[2] Dong Y，Wang C P，Han X，et al.A novel bHLH transcription factorPebHLH35 fromPopuluseuphraticaconfers drought tolerance through regulating stomatal development，photosynthesis and growth inArabidopsis[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，450(1)：453-458.

[3] Liu Z J，Zhang Y Q，Wang J F，et al.Phytochrome-interacting factors PIF4 and PIF5 negatively regulate anthocyanin biosynthesis under red light inArabidopsisseedlings[J].Plant Sci，2015，238(2015)：64-72.

[4] Pabon-Mora N，Wong G K，Ambrose B A.Evolution of fruit development genes in flowering plants[J].Front Plant Sci，2014，5：300.

[5] Song Y，Yang C W，Gao S，et al.Age-triggered and dark-induced leaf senescence require the bHLH transcription factors PIF3，4，and 5[J].Mol Plant，2014，7(12)：1776-1787.

[6] Xu W R，Zhang N B，Jiao Y T，et al.The grapevine basic helix-loop-helix(bHLH)transcription factor positively modulatesCBF-pathway and confers tolerance to cold-stress inArabidopsis[J].Mol Biol Rep，2014，41(8)：5329-5342.

[7] Carretero Paulet L，Galstyan A，Roig Villanova I，et al.Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLH family of transcription factors in Arabidopsis，poplar，rice，moss，and algae[J].Plant Physiol，2010，153(3)：1398-1412.

[8] Song X M，Huang Z N，Duan W K，et al.Genome-wide analysis of the bHLH transcription factor family in Chinese cabbage(Brassicarapassp.pekinensis)[J].Mol Genet Genomics，2014，289(1)：77-91.

[9] Sun H，F(xiàn)an H J，Ling H Q.Genome-wide identification and characterization of thebHLHgene family in tomato[J].BMC Genomics，2015，16：9.

[10]Fairchild C D，Schumaker M A，Quail P H.HFR1 encodes an atypical bHLH protein that acts in phytochrome A signal transduction[J].Genes Dev，2000，14(18)：2377-2391.

[11]Toledo-Ortiz G，Huq E，Quail P H.The Arabidopsis Basic/Helix-Loop-Helix Transcription Factor Family[J].The Plant Cell，2003，15(8)：1749-1770.

[12]Shin D H，Cho M，Choi M G，et al.Identification of genes that may regulate the expression of the transcription factor production of anthocyanin pigment 1(PAP1)/MYB75 involved in Arabidopsis anthocyanin biosynthesis[J].Plant Cell Rep，2015，34(5)：805-815.

[13]Maurya J P，Sethi V，Gangappa S N，et al.Interaction of MYC2 and GBF1 results in functional antagonism in blue light-mediated Arabidopsis seedling development[J].Plant J，2015，83(3)：439-450.

[14]張鑫，宋經元，胡鳶雷，等.bHLH轉錄因子調控植物活性成分生物合成的研究進展[J].藥學學報，2014，49(4)：435-442.

[15]Atchley W R，F(xiàn)itch W M.A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors[J].Pro Nati Acad Sci U S A，1997，94(10)：5172-5176.

[16]Ledent V，Vervoort M.The Basic Helix-Loop-Helix Protein Family：Comparative Genomics and Phylogenetic Analysis[J].Genome Res，2001，11(5)：754-770.

[17]Heim M A，Jakoby M，Werber M，et al.The Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor Family in Plants：A Genome-Wide Study of Protein Structure and Functional Diversity[J].Mol Biol Evol，2003，20(5)：735-747.

[18]Lee S，Lee S，Yang K Y，et al.Overexpression ofPRE1 and its Homologous Genes Activates Gibberellin-dependent Responses inArabidopsisthaliana[J].Plant Cell Physiol，2006，47(5)：591-600.

[19]Roig Villanova I，Bou Torrent J，Galstyan A，et al.Interaction of shade avoidance and auxin responses：a role for two novel atypical bHLH proteins[J].EMBO J，2007，26(22)：4756-4767.

[20]Hyun Y，Lee I.KIDARI，encoding a non-DNA Binding bHLH protein，represses light signal transduction inArabidopsisthaliana[J].Plant Mol Biol，2006，61(1/2)：283-296.

[21]Kosugi S，Ohashi Y.PCF1 and PCF2 Specifically Bind tocisElements in the Rice Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene[J].Plant Cell，1997，9(9)：1607-1619.

[22]Zarka D G，Vogel J T，Cook D，et al.Cold Induction of ArabidopsisCBFGenes Involves Multiple ICE(Inducer ofCBFExpression)Promoter Elements and a Cold-Regulatory Circuit That Is Desensitized by Low Temperature[J].Plant Physiol，2003，133(2)：910-918.

[23]Zhang H B，Bokowiec M T，Rushton P J，et al.Tobacco Transcription Factors NtMYC2a and NtMYC2b Form Nuclear Complexes with the NtJAZ1 Repressor and Regulate Multiple Jasmonate-Inducible Steps in Nicotine Biosynthesis[J].Mol Plant，2012，5(1)：73-84.

[24]Shanmugam M K，Dai X Y，Kumar A P，et al.Oleanolic acid and its synthetic derivatives for the prevention and therapy of cancer：Preclinical and clinical evidence[J].Cancer Lett，2014，364(2)：206-216.

[25]Linag C Q，Shi Y M，Luo R H，et al.Kadcoccitones A and B，Two New 6/6/5/5-Fused Tetracyclic Triterpenoids fromKadsuracoccinea[J].Org Lett，2012，14(24)：6362-6365.

[26]Augustin J M，Kuzina V，Andersen S B，et al.Molecular activities，biosynthesis and evolution of triterpenoid saponins[J].Phytochemistry，2011，72(6)：435-457.

[27]Zhang H T，Hedhili S，Montiel G，et al.The basic helix-loop-helix transcription factor CrMYC2 controls the jasmonate-responsive expression of theORCAgenes that regulate alkaloid biosynthesis inCatharanthusroseus[J].Plant J，2011，67(1)：61-71.

[28]Pre M，Siberil Y，Memelink J，et al.Isolation by the Yeast One-Hybrid System of cDNAs Encoding Transcription Factors that Bind to the G-Box Element of the Strictosidine Synthase Gene Promoter fromCatharanthusroseus[J].Int J Bio-Chromatogr，2000，5(3)：229-244.

[29]Chatel G，Montiel G，Pre M，et al.CrMYC1，aCatharanthusreseuselicitor-and jasmonate-responsive bHLH transcription factor that binds the G-box element of the strictosidine synthase gene promoter[J].J Exp Bot，2003，54(392)：2587-2588.

[30]Van Moerkercke A，Steensma P，Schweizer F，et al.The bHLH transcription factor BIS1 controls the iridoid branch of the monoterpenoid indole alkaloid pathway inCatharanthusroseus[J].Proc Nati Acad Sci U S A，2015，112(26)：8130-8135.

[31]李書濤.調控紫杉醇合成轉錄因子TcMYC和TcWRKY1的克隆及功能研究[D].武漢：華中科技大學，2012.

[32]Lenka S K，Nims N E，Vongpaseuth K，et al.Jasmonate-responsive expression of paclitaxel biosynthesis genes inTaxuscuspidatacultured cells is negatively regulated by the bHLH transcription factors TcJAMYC1，TcJAMYC2，and TcJAMYC4[J].Front Plant Sci，2015，6：115.

[33]Hong G J，Xue X Y，Mao Y B，et al.ArabidopsisMYC2 Interacts with DELLA Proteins in Regulating Sesquiterpene Synthase Gene Expression[J].Plant Cell，2012，24(6)：2635-2648.

[34]Spyropoulou E A，Haring M A，Schuurink R C.RNA sequencing onSolanumlycopersicumtrichomes identifies transcription factors that activate terpene synthase promoters[J].BMC genomics，2014，15：402.

[35]Ji Y P，Xiao J W，Shen Y L，et al.Cloning and Characterization of AabHLH1，a bHLH Transcription Factor that Positively Regulates Artemisinin Biosynthesis inArtemisiaannua[J].Plant Cell Physiol，2014，55(9)：1592-1604.

[36]Yamamura C，Mizutani E，Okada K，et al.Diterpenoid Phytoalexin Factor，a bHLH Transcription Factor，Plays a Central Role in the Biosynthesis of Diterpenoid Phytoalexins in Rice[J].Plant J，2015，84(6)：1100-1113.

[37]Mannen K，Matsumoto T，Takahashi S，et al.Coordinated transcriptional regulation of isopentenyl diphosphate biosynthetic pathway enzymes in plastids by phytochrome-interacting factor 5[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，443(2)：768-774.

[38]Shang Y，Ma Y S，Zhou Y，et al.Plant science.Biosynthesis，regulation，and domestication of bitterness in cucumber[J].Science，2014，346(6213)：1084-1088.

[39]Tang Q，Ma X J，Mo C M，et al.An efficient approach to findingSiraitiagrosvenoriitriterpene biosynthetic genes by RNA-seq and digital gene expression analysis[J].BMC genomics，2011，12：343.

[40]Carbonell-Bejerano P，Diago M P，Martínez-Abaigar J，et al.Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses[J].BMC Plant Biol，2014，14：183.

[41]Champagne A，Boutry M.Proteomic snapshot of spearmint(MenthaspicataL.)leaf trichomes：A genuine terpenoid factory[J].Proteomics，2013，13(22)：3327-3332.

[42]Matias-Hernandez L，Aguilar-Jaramillo A E，Cigliano R A，et al.Flowering and trichome development share hormonal and transcription factor regulation[J].J Exp Bot，2016，67(5)：1209-1219.

[43]Payne C T，Zhang F，Lloyd A M.GL3 Encodes a bHLH Protein That Regulates Trichome Development in Arabidopsis Through Interaction With GL1 and TTG1[J].Genetics，2000，156(3)：1349-1362.

[44]Huang X S，Zhang Q H，Zhu D X，et al.ICE1 ofPoncirustrifoliatafunctions in cold tolerance by modulating polyamine levels through interacting with arginine decarboxylase[J].J Exp Bot，2015，66(11)：3259-3274.

[45]Bovy A，de Vos R，Kemper M，et al.High-Flavonol Tomatoes Resulting from the Heterologous Expression of the Maize Transcription Factor GenesLCandC1[J].Plant Cell，2002，14(10)：2509-2526.

[46]Oikawa T，Maeda H，Oguchi T，et al.The Birth of a Black Rice Gene and Its Local Spread by Introgression[J].Plant Cell，2015，27(9)：2401-2414.

Research Progress on Regulation of bHLH Transcription Factors on Biosynthetic Pathway of Terpenoids in Medicinal Plants

ZHANG Kailun1，LUO Zuliang1，GUO Yuhua1，SHI Hongwu1，MA Xiaojun1,2*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing100193，China；2.Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Jinghong 666100，China)

Terpenoids are the most diverse family among plant secondary metabolites，and they exhibit a wide range of pharmacological properties；however，their low content is a common problem.Transcription factors (TFs) are responsible for the regulation of coordinated expression of several genes involved in the synthetic pathway of secondary metabolites.They are in close relation to plant growth and development，morphogenesis，secondary metabolism，stress response and phytohormone signaling.As the discovery of bHLH TFs in various medicinal plants，how to use them in genetic and metabolic engineering to increase the productivity of terpenoids，realize large-scale industrial production and meet the needs of a great deal of patients have been a hot research topic.This review mainly summarizes the regulatory effect of bHLH TFs on terpenoids synthetic pathway in recent years.

bHLH transcription factor；terpenoids；regulation；synthetic pathway

國家自然科學基金(81373914，81573521)

] 馬小軍，研究員，研究方向：分子生物學研究；E-mail：mayixuan10@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.028

2016-04-13)

*[