賈原博,趙曉峰,賀 敏,顧 悅,賀銀鳳,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古包頭市疾病控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014030)

?

耐受重金屬鉛乳酸菌的分離篩選及鑒定

賈原博1,趙曉峰1,賀 敏2,顧 悅1,賀銀鳳1,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古包頭市疾病控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014030)

通過對包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染嚴重區(qū)域土壤樣品中的乳酸菌進行分離、篩選,共得到62株乳酸菌,并對分離得到的乳酸菌進行耐受鉛離子的測定,62株乳酸菌對鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對鉛離子的耐受能力有所不同;鉛離子濃度為1200～9600 mg/L時,隨著培養(yǎng)時間的增長,菌株對耐受鉛離子的修復能力逐漸增強;30 ℃下分離得到的菌株對鉛離子的修復能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株;菌株BY-Fa4、BG-5b3、BG-8b2等13株菌可在鉛離子濃度為7200 mg/L的環(huán)境下生長,菌株BY-Fa1、BY-Fc2、BG-6b1可在鉛離子濃度為8400 mg/L的環(huán)境下生長。實驗結(jié)果得出篩選得到的13株乳酸菌對鉛離子不僅具有較強的耐受能力,而且還具有較強的修復能力。對篩選出13株高耐受鉛離子的菌株進行16S rRNA序列分析,鑒定結(jié)果為戊糖片球菌2株、清酒乳桿菌1株、食竇魏斯氏菌5株、戊糖乳桿菌2株、植物乳桿菌3株。

尾礦區(qū),乳酸菌,耐受重金屬鉛,篩選與鑒定

生物修復作為近年來研究投入關(guān)注度較多的新興修復、治理重金屬污染的方法,由于其原材料廣泛、修復效果好、成本低廉、操作簡單、對環(huán)境不會產(chǎn)生次生危害等特點,成為現(xiàn)階段研究的熱點。水生生物如部分魚類、貝殼類、藻類,陸生生物如部分植物、大型真菌[1-3],以及很多的微生物如霉菌[4]、酵母菌[5]、芽孢桿菌[6]等均可用來作為修復重金屬污染。微生物具有個體小、數(shù)量龐大、繁殖速度快、吸附效率高等特點,作為生物吸附劑修復重金屬污染具有很大的潛力。隨著研究的不斷深入,有研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌對重金屬有著良好的抗性和吸附性能,并且乳酸菌作為人體腸道內(nèi)的有益菌群,對人體健康也有很好的保健作用[7-8]。國內(nèi)外對將乳酸菌作為生物吸附劑的研究還是比較少的,這些研究報道為本研究開發(fā)應(yīng)用于人體、動物體的新型生物吸附劑提供了思路。

內(nèi)蒙古地區(qū)礦產(chǎn)資源豐富,在礦產(chǎn)資源開采和利用的過程中會對環(huán)境造成一定的污染,據(jù)資料顯示包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染指數(shù)比背景值高出9倍,人們的健康安全受到了極大的威脅。本研究通過對包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染嚴重區(qū)域的土壤樣品中的乳酸菌進行分離、篩選,對其分離特性、耐受程度進行探討,并對能夠耐受較高鉛離子濃度菌株進行鑒定,從而為后期對吸附機理、開發(fā)新型生物吸附劑,以及將優(yōu)良菌種應(yīng)用到飼料或食品中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

實驗樣品 采集自內(nèi)蒙古包頭市包頭鋼鐵廠尾礦庫區(qū)(BG1～BG10)、白云鄂博稀土礦礦區(qū)(BY-A～BY-F)周邊土壤及污水處理廠淤泥,共計17個樣品;鉛儲備液[9];MRS 固體培養(yǎng)基(DifcoTM Lactobacilli MRS Agar) 用于培養(yǎng)乳酸菌;MRS半固體培養(yǎng)基 用于保藏乳酸菌;MRS(Man Rogosa Sharpe broth)液體培養(yǎng)基 用于種子發(fā)酵培養(yǎng)[10-11];細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;2×Easy Taq Super Mix TRANS公司;溶菌酶-306A046 Solarbio公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer 寶生物工程有限公司;瓊脂糖 Sigma公司;核酸染料 TaKaRa公司;生理生化鑒定培養(yǎng)管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

OHAUS型電子天平 上海OHAUS有限公司;SX-500型高壓滅菌鍋 日本TOMY公司;FLC-3型超凈工作臺 哈爾濱市東聯(lián)公司;HPS-250型生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;OLYMPOS BX50型光學顯微鏡 OLYMPOS公司;pHS-25 型數(shù)顯酸度計 雷磁分析儀器廠;HH.S-Ni電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;BG-Power3500電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;Veriti 96孔PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 實驗選取重金屬污染相對嚴重的包頭鋼鐵廠、包頭尾礦庫和白云鄂博稀土礦區(qū)土壤及污水處理廠淤泥進行實驗。選擇地勢平坦的區(qū)域,去掉土壤表層雜物和浮土,在距離地表5～20 cm深處使用土壤采集器取樣,采用梅花五點法進行打孔采樣,將五點樣品(每五點為一個樣)混合均勻后裝入塑料封口袋,封好袋口,在封口袋上做好標記,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐受鉛離子乳酸菌的分離純化 將保存的土壤樣品取出適量,恢復至室溫,混合均勻后,稱取1 g溶解于生理鹽水中,使菌群均勻分布,接種至MRS液體培養(yǎng)基中,分別置于30 ℃有氧、30 ℃厭氧和37 ℃有氧、37 ℃厭氧環(huán)境靜置培養(yǎng)7 d以富集LAB菌群[12]。將富集培養(yǎng)基劃線至含100 mg/L鉛離子濃度和CaCO3的MRS固體平板培養(yǎng)基上,分別置于30 ℃有氧、30 ℃厭氧和37 ℃有氧、37 ℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h。

挑取有透明圈的、具有金屬抗性的LAB菌落,接種至MRS液體培養(yǎng)基中,觀察記錄菌落形態(tài),觀察各菌株的形態(tài)及革蘭氏染色,對革蘭氏陽性菌株進行過氧化氫酶實驗,用3%過氧化氫溶液滴加一滴至單個菌落,如果有氣泡產(chǎn)生表明細菌中存在過氧化氫酶,棄掉過氧化氫酶陽性的菌落。將分離篩選得到的革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實驗陰性的桿菌和球菌暫定為乳酸菌。將分離得到的乳酸菌在MRS固體平板培養(yǎng)基上再劃線兩次以更進一步得到純培養(yǎng)物。

1.2.3 乳酸菌對鉛離子最大耐受濃度的測定 將分離得到的乳酸菌活化至三代,分別劃線至鉛離子濃度為0、1200、2400、3600、4800、6000、7200、8400、9600 mg/L的MRS固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察菌株生長情況直到96 h,記錄乳酸菌對鉛離子的耐受及其修復能力。

1.2.4 高耐受鉛乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 實驗菌株總DNA的提取及16S rRNA序列PCR擴增及凝膠電泳 將實驗菌株活化培養(yǎng)至三代,3000 r/min離心10 min,用生理鹽水洗滌3次后,按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書中步驟進行基因組DNA的提取。

實驗菌株16S rRNA序列PCR擴增引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ R:5′-CCGTCAA TTCCTTTGAGTTT-3′,參照文獻[13]所給引物。PCR擴增體系:上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、Dream Tap Green PCR Master Mix 25 μL、加無菌水補齊至50 μL。PCR條件參數(shù)為:預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 30 s,退火57.4 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 90 s,循環(huán)35次,最后末端延伸72 ℃ 5 min。取5 μL實驗菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合均勻上樣后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(110 V、30 min),使用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。

1.2.4.2 實驗菌株16S rRNA序列分析 將PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司測序及雙向拼接后,在NCBI上用BLAST進行同源性比較,最后使用DNAStar軟件中Megalign程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐受鉛離子乳酸菌分離

對所采樣品進行分離后共得到62株乳酸菌,其中包鋼所采10個樣品中分離得到24株乳酸菌菌株,白云稀土礦區(qū)所采7個樣中分離得到38株乳酸菌菌株。白云稀土礦樣品分離得到的菌株較包鋼樣品分離得到的菌株多。

由表1可知,在不同的樣品中,分離得到的菌株個數(shù)也有所差異,BY-B、BY-C、BY-D三個樣品中分離得到的乳酸菌均來自37 ℃,可能是這三個樣品中的乳酸菌較適宜在37 ℃下生長;BG-7、BG-8兩個樣品中分離得到的乳酸菌均來自于30 ℃,可能是這兩個樣品中的乳酸菌更適宜在30 ℃條件下生長,其余樣品中在30 ℃和37 ℃下均分離到了不同數(shù)量的乳酸菌。在37 ℃分離條件下白云鄂博稀土礦區(qū)所采樣品分離得到20株菌,包鋼所采樣品只分離得到10株菌,37 ℃對兩個不同采樣區(qū)域的分離結(jié)果影響比較明顯;30 ℃分離條件下兩個不同的采樣區(qū)域分離得到的乳酸菌株數(shù)比較接近,說明30 ℃對兩個不同采樣區(qū)域的影響不大。但從分離總數(shù)可以看出,在30 ℃分離得到32株乳酸菌,37 ℃分離得到30株乳酸菌,分離溫度對分離結(jié)果影響不大。在有氧條件下分離得到33株乳酸菌,厭氧條件下分離得到29株乳酸菌,厭氧條件下分離得到的菌株數(shù)較有氧條件略多,可能由于乳酸菌生長土壤中氧氣含量較低所致。

表2 分離溫度對菌株耐受能力的影響結(jié)果

注:“-”表示該濃度沒有可生長的菌株。

表1 各樣品不同溫度條件分離結(jié)果

注:“-”表示該條件下沒有可生長的菌株。

2.2 分離菌株耐受鉛離子篩選

2.2.1 分離菌株耐受不同鉛離子濃度的能力 培養(yǎng)基中設(shè)置鉛離子濃度分別為1200、2400、3600、4800、6000、7200、8400、9600 mg/L八個梯度,將分離得到的乳酸菌分別劃線至上述含不同鉛離子濃度的MRS固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24、48、72、96 h觀察分離菌株的生長情況,結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出,菌株對鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對鉛離子的耐受能力有所不同,隨著鉛離子濃度的增大,可耐受鉛離子濃度的菌株減少。隨著培養(yǎng)時間的增長,分離菌株對耐受鉛離子的修復能力逐漸增強,如在鉛離子濃度為3600 mg/L,培養(yǎng)時間為24 h時,62株分離菌株中只有26株可生長,培養(yǎng)至48 h,有46株乳酸菌可生長,培養(yǎng)至72 h時,可生長菌株增加到57株,當培養(yǎng)到96 h時,共有59株乳酸菌可生長,僅有3株分離菌株未生長。

圖1 不同鉛離子濃度下菌株生長情況Fig.1 Growth of various strains in different lead concentrations

2.2.2 分離溫度對菌株耐受能力的影響 實驗設(shè)置的分離溫度為30 ℃和37 ℃,對分離菌株在不同鉛離子濃度下的耐受情況結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,在30 ℃和37 ℃下分離得到的菌株對鉛離子均有較強的耐受能力。當鉛離子濃度大于4800 mg/L時,30 ℃下分離得到的菌株對鉛離子的修復能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株。如可耐受鉛離子濃度為6000 mg/L的菌株中,培養(yǎng)24 h時,有3株來自30 ℃,2株來自37 ℃,培養(yǎng)至48 h時,來自30 ℃的菌株增長至14株,37 ℃的菌株只有5株,培養(yǎng)至72 h,來自30 ℃的菌株為16株,37 ℃菌株為8株,培養(yǎng)至96 h,來自30 ℃下的菌株為19株,37 ℃的菌株為9株;再如,可耐受鉛離子濃度為7200 mg/L的菌株中,培養(yǎng)48 h時,有2株來自30 ℃,1株來自37 ℃,培養(yǎng)至72 h時,來自30 ℃的菌株增長至4株,37 ℃的菌株沒有變化,還是1株,培養(yǎng)至96 h,來自30 ℃下的菌株增加到12株,37 ℃的菌株無變化。

2.2.3 不同培養(yǎng)時間乳酸菌最大耐受鉛離子濃度的測定結(jié)果 通過在不同的培養(yǎng)時間下測得的乳酸菌最大耐受鉛離子濃度,隨著培養(yǎng)時間的延長,菌株逐步對鉛離子的抑制作用進行修復,表現(xiàn)出較好的耐受能力。實驗中有13株乳酸菌對鉛離子表現(xiàn)出較強的耐受能力,由表3可知,培養(yǎng)96 h,菌株耐受鉛離子濃度均可達到7200 mg/L以上,這13株對鉛離子濃度耐受能力較強的菌株在培養(yǎng)48 h時就表現(xiàn)出較強的耐受能力。其中,BY-Fa1、BY-Fc2、BY-Fa4這3株乳酸菌在培養(yǎng)48 h最大耐受鉛離子濃度與培養(yǎng)至96 h時的最大耐受鉛離子濃度一致,說明這3株乳酸菌對鉛離子有較強的耐受能力,其余10株乳酸菌隨著培養(yǎng)時間的延長對鉛離子的耐受能力均有提高,說明這10株乳酸菌除了對鉛離子有較強的耐受能力外,還對鉛離子有較強的修復能力。

表3 不同培養(yǎng)時間菌株耐受鉛離子最大濃度值(mg/L)

2.3 高耐受鉛離子乳酸菌的鑒定

13株實驗菌株和標準菌株的測序序列與GeneBank中菌株16S rRNA基因序列進行同源性比較,同源性比較結(jié)果見圖2,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖3。

圖2 實驗菌株與其他乳酸菌的同源性Fig.2 The homology between the test strains and other lactic acid bacteria

圖3 實驗菌株與其他乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree of strains and other lactic acid bacteria

由圖2、圖3可知,實驗菌株BG-10a1、BG-5b3與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)同源性為100%、96.3%,并且在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于同一分支,進化距離很相近,所以可以判定BG-10a1、BG-5b3為戊糖片球菌;BG-6b1與清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)的同源性為99.5%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中位置最近,并屬于同一分支,可以判定BG-6a1為清酒乳桿菌;BY-Fa5、BY-Ff3、BY-Fe3、BY-Fe21、BG-8b2與食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)的同源性分別為99.4%、99.6%、100.0%、99.7%、95.9%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于同一分支,由此可鑒定為食竇魏斯氏菌;BY-Fa2、BY-Fa4與戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的同源性分別為99.9%、97.2%,由此可鑒定為戊糖乳桿菌;BY-Fa1、BY-Fc2、BY-Ff4與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性分別為99.2%、100.0%、99.9%,由此可鑒定為植物乳桿菌,標準菌株CICC23658為屎腸球菌,與鑒定結(jié)果一致,說明測序結(jié)果可信。

3 結(jié)論

實驗對包頭尾礦庫和白云鄂博稀土礦區(qū)17個樣品的分離,共得到62株乳酸菌。其中不同的溫度條件、不同的氧氣培養(yǎng)條件對分離菌株的總數(shù)結(jié)果影響不大;分離得到的62株乳酸菌對鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對鉛離子的耐受能力有所不同。隨著培養(yǎng)時間的增長,菌株對耐受鉛離子的修復能力逐漸增強;30 ℃下分離得到的菌株對鉛離子的修復能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株;篩選得到13株對鉛離子不僅具有較強耐受能力而且具有較強修復能力的菌株;對篩選出13株高耐受鉛的菌株進行16S rRNA序列分析,結(jié)果得出,菌株BG-10a1、BG-5b3為戊糖片球菌,菌株BG-6b1為清酒乳桿菌,菌株BY-Fa5、BY-Ff3、BY-Fe21、BY-Fe3、BG-8b2為食竇魏斯氏菌,菌株BY-Fa1、BY-Fa2、BY-Fa4、BY-Fc2、BY-Ff4為植物乳桿菌。

[1]Cocchi L,Vescovi L,Petrini L E,et al. Heavy metals in edible mushrooms in Italy[J]. Food Chemistry,2006(2):277-284.

[2]Xiangliang P,Jianlong W,Daoyong Z. Biosorption of Pb(II)byPleurotus ostreatus immobilized in calcium alginate gel[J]. Process Biochemistry,2005(8):2799-2803.

[3]Melgar M J,Alonso J,García M A. Removal of toxic metals from aqueous solutions by fungal biomass of Agaricus macrosporus.[J]. Science of the Total Environment,2007,385(1-3):12-19.

[4]閆建芳,劉秋,趙柏霞,等. 龜裂鏈霉菌GQ-17對Pb2+吸附性的初步研究[J]. 大連民族大學學報,2016,18(1):19-22.

[5]李明春,姜恒,侯文強,等. 酵母菌對重金屬離子吸附的研究[J]. 菌物系統(tǒng),1998(4):80-86.

[6]劉月英,傅錦坤,陳平,等. 巨大芽孢桿菌D01吸附金Au3+的研究[J]. 微生物學報,2000,40(4):425-429.

[8]Avallj??skel?inen S,Lindholm A,Palva A. Surface display of the receptor-binding region of the Lactobacillus brevis S-layer protein in Lactococcus lactis provides nonadhesive lactococci with the ability to adhere to intestinal epithelial cells[J]. Applied & Environmental Microbiology,2003,69(4):2230-2236.

[9]倪奕弘. 耐受重金屬銅的乳酸菌的篩選及其銅結(jié)合性能的研究[D]. 廣州：暨南大學,2014.

[10]陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造及應(yīng)用[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[11]內(nèi)村泰,崗田草苗. 乳酸菌實驗手冊[M]. 日文版.東京:朝倉書店,1992.

[12]Bhakta J N,Munekage Y,Ohnishi K,et al. Isolation and identification of cadmium-and lead-resistant lactic acid bacteria for application as metal removing probiotic[J]. International Journal of Environmental Science & Technology,2012,9(3):433-440.

[13]李少英. 奶牛源性雙歧桿菌和乳桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2008.

Isolation,screening and identification of lactic acid bacteria tolerance to heavy metal lead

JIA Yuan-bo1,ZHAO Xiao-feng1,HE Min2,GU Yue1,HE Yin-feng1,*

(1.College of Food Sciences and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China; 2.Baotou Center Disease Control and Prevention,Baotou 014030,China)

A total of 62 strains of lactic acid bacteria was isolated from the soil sample which was polluted by heavy metal collected at Baotou and Baiyun Ebo mine. And by the test of the tolerance of lead ions,the 62 strains of lactic acid bacteria all had the tolerance of lead ions,but different stains had different tolerance capability. With the increasing of culturing time,the capability of strains to repair the lead ions had increased gradually when the concentration of lead ions was 1200～9600 mg/L. The strains which were isolated at 30 ℃ had better repair capability of lead ions than the strains isolated at 37 ℃. There were 13 strains could survive under the condition of 7200 mg/L concentration of lead ions,and the strains of BY-Fa4、BG-5b3、BG-8b2 could survive under the condition of 8400 mg/L concentration of lead ions. It indicated that there were 13 stains of all the lactic acid bacteria which isolated had better capability of both tolerance and repair to lead ions. The 16S rRNA gene of 13 strains was amplified by PCR and were identified as 2 strains ofPediococcuspentosaceus,1 strain ofLactobacillussake,5 strains ofWeissellacibaria,2 strains ofLactobacilluspentosus,3 strains ofLactobacillusplantarum.

tailings;lactic acid bacteria;tolerance to heavy metal lead;screening and identification

2016-05-27

賈原博(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:jiayb2016@163.com。

*通訊作者:賀銀鳳(1960-),女,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:heyinf6468@163.com。

內(nèi)蒙古自然科學基金資助項目(2015MS0345)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0244-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.039