魏 霜,馬新華,汪天杰,龍 陽,紀(jì) 強(qiáng),任 嬌,吳希陽

(1.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東汕頭 515041;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632;3.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東湛江 524022;4.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東廣州 510632)

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雙重DPO-PCR檢測(cè)副溶血弧菌和霍亂弧菌

魏 霜1,2,馬新華3,汪天杰4,龍 陽3,紀(jì) 強(qiáng)1,任 嬌1,吳希陽2,*

(1.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東汕頭 515041;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632;3.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東湛江 524022;4.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東廣州 510632)

根據(jù)副溶血弧菌collagenase基因和霍亂弧菌ompW基因,分別設(shè)計(jì)特異性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,建立一種快速檢測(cè)這兩種弧菌的多重DPO-PCR方法,并對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,設(shè)計(jì)的DPO引物特異性較強(qiáng),副溶血弧菌和霍亂弧菌DNA可分別擴(kuò)增出307 bp與463 bp的特異性條帶,檢測(cè)靈敏度均達(dá)0.1 ng/μL。該檢測(cè)方法對(duì)退火溫度不敏感。利用該方法對(duì)69株疑似弧菌菌株進(jìn)行鑒定,結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高,適合于對(duì)食品、水產(chǎn)品等中副溶血弧菌和霍亂弧菌的進(jìn)行快速篩檢。

副溶血弧菌,霍亂弧菌,多重DPO-PCR

傳統(tǒng)檢測(cè)方法特異性差、靈敏度低并且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、滿足不了快速檢測(cè)的需求。PCR技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn),是目前食源性致病菌檢測(cè)主要采用的檢測(cè)技術(shù)之一[10]。在此基礎(chǔ)上,DNA探針技術(shù)[11]、普通多重PCR(Multiplex PCR)[12]、多重?zé)晒舛縋CR(Multiplex real-time PCR)[13]、PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)[14]等檢測(cè)方法也已建立起來,但是這些方法有些對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高,而且需要優(yōu)化退火溫度,有些則需依賴較昂貴的儀器設(shè)備,難以在實(shí)驗(yàn)室推廣。因此,尋求一種能快速、靈敏、特異的同時(shí)檢測(cè)這兩種病原菌的技術(shù)十分重要。

表1 引物序列

由于多重PCR可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌,在提高檢測(cè)效率的同時(shí)又能降低檢測(cè)成本,因此被廣泛應(yīng)用于食品、水產(chǎn)品等產(chǎn)品中的多種食源性致病菌檢測(cè)。但傳統(tǒng)的多重PCR體系中,由于多對(duì)引物之間存在干擾、各引物的退火溫度存在差異、引物與模板的錯(cuò)配,容易造成靈敏度下降與非特異性擴(kuò)增等問題,限制了多重PCR技術(shù)的應(yīng)用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)一種新型PCR引物設(shè)計(jì)方法,即雙啟動(dòng)寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)[15]。DPO引物技術(shù)的主要原理為其引物包含兩個(gè)獨(dú)立的區(qū)域,5′端序列由18～25個(gè)堿基組成,3′端序列由6～12個(gè)堿基用來引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸,這兩段獨(dú)立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤(Inosine,I)進(jìn)行連接,由于次黃嘌呤的退火溫度低,在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu),從而使5′和3′區(qū)域形成兩個(gè)獨(dú)立功能的雙特異性引物結(jié)構(gòu),研究表明5′和3′引物區(qū)域中任何有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配,PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行,而且因?yàn)槠錁?gòu)造的特殊性,引物自身以及引物之間能夠生成的二級(jí)結(jié)構(gòu)較少,并且對(duì)于退火溫度具有不敏感的特性。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要在于它對(duì)退火溫度等影響普通多重PCR的關(guān)鍵因素不敏感,適用范圍廣[16],而且該技術(shù)特異性強(qiáng),擴(kuò)增效率高,為多重PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌檢測(cè)中,據(jù)報(bào)道DPO-PCR技術(shù)已建立了創(chuàng)傷弧菌[17]、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌[18]、腸出血性大腸桿菌O157∶H7[19]、志賀氏菌[20]等的檢測(cè)方法。本研究旨在建立一種多重DPO-PCR方法來同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌和霍亂弧菌,為口岸實(shí)驗(yàn)室快速鑒定這兩種病原菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河流弧菌(Vibriofluvialis)、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、梅氏弧菌(V.metschnikovi) 保存于汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局;副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,ATCC17802)、溶藻弧菌(V.alginolyticus,ATCC17749)、霍亂弧菌(V.cholerae,ATCC14035)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus,ATCC27562)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC8739)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,ATCC19111)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC43300) 保存于暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系;2012年6月,采集3個(gè)湖泊水樣(暨南大學(xué)石牌校區(qū)明湖)、9個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣和9個(gè)貝殼類水產(chǎn)品(石牌市場(chǎng)) 共計(jì)21個(gè)樣本;胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB)培養(yǎng)基、腦心浸液(Brian Heart Infusion,BHI)液體培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司;DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;多重PCR反應(yīng)試劑盒(Multiplex PCR Assay Kit) TaKaRa公司;DNA Marker DL2000,大連寶生物公司;PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

Veriti96 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司;ND-1000微量紫外分光光度計(jì) Nano Drop公司;600SI電泳儀 上海博彩生物科技有限公司;GBOX-F3凝膠成像系統(tǒng) GENE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 挑取上述弧菌單菌落,接種于3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中;挑取上述非弧菌單菌落,接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基中,37 ℃下振蕩培養(yǎng)過夜。參照DNA提取試劑盒說明操作,分別提取1.1中12種菌株的基因組DNA。提取后取1 μL基因組DNA樣品用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA的濃度和純度,并保存于-20 ℃待用。

教師一句評(píng)價(jià)性鼓勵(lì)的話，調(diào)整了課堂探究氣氛，成為了孩子學(xué)習(xí)的新動(dòng)力，使他在原有基礎(chǔ)上不斷進(jìn)步，用自己的勤奮創(chuàng)造一片屬于自己的真正舞臺(tái)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參考DPO引物設(shè)計(jì)方法和要求[16],根據(jù)副溶血弧菌collagenase基因序列和霍亂弧菌ompW基因序列,設(shè)計(jì)檢測(cè)副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO-PCR引物組合(引物序列中的I為次黃嘌呤)(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 雙重DPO-PCR體系 參考多重PCR反應(yīng)試劑盒說明書的反應(yīng)體系,Mix 2溶液25 μL、Mix 1溶液0.25 μL、各引物終濃度均為0.4 μmol/L、DNA模板1.0 μL,ddH2O調(diào)節(jié)最終體積至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 90 s,72 ℃ 90 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.4 雙重DPO-PCR體系退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.3多重DPO-PCR反應(yīng)體系,將反應(yīng)條件中的退火溫度范圍設(shè)定為45～65 ℃,5 ℃為1個(gè)梯度共五個(gè)梯度,以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板進(jìn)行退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn),產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,討論不同退火溫度下多重DPO-PCR體系的穩(wěn)定性。

1.2.5 雙重DPO-PCR體系的特異性評(píng)價(jià) 按照1.2.3多重DPO-PCR反應(yīng)體系,以1.2.1中提取的12個(gè)供試菌株的基因組DNA為模板,同時(shí)以水為模板做陰性對(duì)照,以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板做陽性對(duì)照,對(duì)所建立的雙重DPO-PCR反應(yīng)體系的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.6 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評(píng)價(jià) 按照1.2.1方法分別提取副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA。用生物學(xué)分光光度計(jì)標(biāo)定濃度為100 ng/μL,再按10倍梯度稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的模板濃度,共六個(gè)模板濃度,分別取1 μL作為模板進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 雙重DPO-PCR體系檢測(cè)實(shí)際樣品 采集9個(gè)養(yǎng)殖水樣、3個(gè)湖泊水樣品、9個(gè)貝殼樣品共計(jì)21個(gè)樣本,將樣品接種于3% NaCl堿性蛋白胨水中,培養(yǎng)8 h后在TCBS培養(yǎng)基上劃線分離得到疑似弧菌單菌落,并挑取該單菌落接種于含3% NaCl的TSB培養(yǎng)基中,按照1.2.1的方法來提取基因組DNA,然后利用已建立的多重DPO-PCR體系來鑒定分離得到的疑似弧菌菌株,同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行API生理生化實(shí)驗(yàn)[21],將兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種弧菌的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法建立

調(diào)整了雙重DPO-PCR體系中引物濃度,確定引物終濃度均為0.2 μmol/L,建立了副溶血弧菌和霍亂弧菌的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法,結(jié)果如圖1所示,雙重DPO-PCR檢測(cè)結(jié)果與單重DPO-PCR檢測(cè)結(jié)果一致,則瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在307 bp和463 bp處有特異性條帶。

圖1 雙重DPO-PCR和單重DPO-PCR的結(jié)果Fig.1 Results of the multiplex DPO-PCR and single DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1:陰性對(duì)照;2:副溶血弧菌、霍亂弧菌;3:副溶血弧菌;4:霍亂弧菌。

2.2 雙重DPO-PCR退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn)

由圖2可知,在本研究DPO-PCR退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn)中,退火溫度設(shè)定在45～65 ℃五個(gè)梯度,利用雙重DPO-PCR檢測(cè)體系均能高效擴(kuò)增出目的基因即副溶血弧菌、霍亂弧菌,不同退火溫度點(diǎn)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不明顯,表明所建立的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法退火溫度范圍較寬并且對(duì)退火溫度不敏感,彌補(bǔ)了常規(guī)雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果易受退火溫度變化的影響較大、擴(kuò)增效果較差的缺陷。

圖2 雙重DPO-PCR退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Tm Sensitivity test of the multiplex DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1～5:退火溫度依次為45、50、55、60、65 ℃。

2.3 雙重DPO-PCR體系的特異性評(píng)價(jià)

DPO引物poly I的氫鍵結(jié)合力弱,擴(kuò)增過程中,若DPO引物的5′或3′端有3個(gè)以上堿基發(fā)生錯(cuò)配,引物就會(huì)與模板脫離,從而不能正常發(fā)生反應(yīng),這大大增強(qiáng)了引物的特異性;同時(shí)DPO引物自身及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)[16]。本實(shí)驗(yàn)以副溶血弧菌collagenase基因和霍亂弧菌外膜蛋白o(hù)mpW為靶基因建立的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法對(duì)12種供試菌株DNA檢測(cè)結(jié)果見圖3,結(jié)果顯示以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板的陽性對(duì)照、副溶血弧菌基因組DNA為模板及霍亂弧菌基因組DNA為模板的樣品中順利檢出副溶血弧菌和霍亂弧菌特異性條帶,而其它10種非目標(biāo)菌及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)目的條帶,證明該方法能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)菌,且與其他菌株無交叉反應(yīng)及非特異性擴(kuò)增,表明所建立的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

圖3 多重DPO-PCR特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Specificity test of the multiplex DPO-PCR注:M:Marker DL 2000;1:陰性對(duì)照;2:副溶血弧菌、霍亂弧菌;3:副溶血弧菌;4:霍亂弧菌;5:溶藻弧菌;6:創(chuàng)傷弧菌;7:擬態(tài)弧菌;8:梅氏弧菌;9:河流弧菌;10:哈維氏弧菌;11:鰻弧菌;12:大腸桿菌;13:金黃色葡萄球菌;14:單增李斯特菌。

2.4 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評(píng)價(jià)

靈敏度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4,DNA模板含量在100、10、1、0.1 ng/μL時(shí)均可擴(kuò)增出2條目的條帶,且呈依次減弱,當(dāng)模板量降到0.1 ng/μL以下時(shí)未能擴(kuò)增到目的條帶。檢測(cè)體系對(duì)混合模板中副溶血弧菌和霍亂弧菌的DNA靈敏度較高,能大大增強(qiáng)該技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室的可推廣性。

圖4 靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of the multiplex DPO-PCR 注:M:Marker DL 2000;1～6:2種病原菌DNA模板量從左到右依次為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL。

2.5 雙重DPO-PCR體系對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

1.2.7中的21個(gè)樣品共分離到69個(gè)疑似弧菌菌落,其中有27個(gè)綠色菌落、42個(gè)黃色菌落。 API生理生化鑒定結(jié)果顯示,24個(gè)綠色菌落為副溶血弧菌(V.parahaemolyticus),22個(gè)黃色菌落為溶藻弧菌(V.alginolyticus),1個(gè)黃色菌落為創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus),并沒有分離到霍亂弧菌(V.cholerae)[21]。利用建立好的多重DPO-PCR體系對(duì)上述69個(gè)疑似弧菌菌落進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果與前期的API生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論

建立了兩種病原弧菌副溶血弧菌和霍亂弧菌的雙重DPO-PCR檢測(cè)方法,該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn),適用于食品中這2種病原弧菌的快速篩檢,具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。同時(shí)今后還可以將多重DPO-PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到更多的致病菌檢測(cè)上,以更好的保障食品、水產(chǎn)品的安全,特別是對(duì)沿海地區(qū),更能夠有效的降低微生物中毒的發(fā)生。

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Multiplex DPO-PCR for the detection ofVibrioparahaemolyticusandVibriocholerae

WEI Shuang1,2,MA Xin-hua3,WANG Tian-jie4,LONG Yang3,JI Qiang1,REN Jiao1,WU Xi-yang2,*

(1.Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou 515041,China; 2.Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China; 3.Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhanjiang 524022,China; 4.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China)

Based on collagenase gene sequences ofVibrioparahaemolyticusand ompW gene sequences ofV.cholerae,designed two pairs of DPO(dual priming oligonucleotide)primers. A multiplex DPO-PCR method had been developed for the detection ofV.parahaemolyticusandV.choleraesimultaneously. The specificity and sensitivity of the method had been tested. The result showed that the DPO primers were of high specificity. Amplified fragments 307 bp forV.parahaemolyticusand 463 bp forV.choleraewere obtained,the sensitivity of the method was 0.1 ng/μL forV.parahaemolyticusandV.cholerae. The multiplex DPO-PCR was not sensitive to the annealing temperature. The multiplex DPO-PCR was validated with 69 suspicious vibrio strains and the results was consistent with physiological and biochemical experiments. The multiplex DPO-PCR method proved to be strong specificity,high sensitivity. This method was suitable for the detection ofV.parahaemolyticusandV.cholerain food,aquatic products,etc.

Vibrioparahaemolyticus;Vibriocholerae;multiplex DPO-PCR

2016-05-27

魏霜(1988-),男,碩士,農(nóng)藝師,研究方向:病原微生物檢測(cè),E-mail:weishuang2008@hotmail.com。

*通訊作者:吳希陽(1966-),男,博士,教授,研究方向:病原微生物檢測(cè),E-mail:tkentwu@jnu.edu.cn。

湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014C01007);廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015GDK27);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目-國(guó)際科技合作領(lǐng)域(2015A050502030)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)22-0080-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.007