李 倩,李晨陽,買吾拉江·阿不都熱衣木,徐 芳,趙 軍,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830004)

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高速逆流色譜法分離純化新疆圓柏枝葉中的黃酮類成分

李 倩1,李晨陽2,買吾拉江·阿不都熱衣木1,徐 芳2,趙 軍2,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830004)

目的:建立高速逆流色譜分離純化新疆圓柏枝葉中的黃酮類成分的方法。方法:以氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2)為溶劑系統(tǒng),上相為固定相,下相為流動(dòng)相,在流速2.0 mL/min、轉(zhuǎn)速850 r/min、檢測波長254 nm的條件下,對新疆圓柏中的黃酮類成分進(jìn)行分離純化。結(jié)果:從新疆圓柏提取物中分離純化得到3個(gè)化合物:異槲皮苷(a,91.89%)、槲皮苷(b,98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷(c,95.35%),其中c為首次從圓柏屬植物中分離得到的化合物。結(jié)論:該法快速簡便,能夠高效分離新疆圓柏中的黃酮類成分。

高速逆流色譜,新疆圓柏,黃酮,分離

新疆圓柏(JuniperussabinaL.),又名叉子圓柏、砂地柏和臭柏等,為柏科圓柏屬常綠匍匐灌木,廣泛分布于我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙和陜北的干旱荒山和沙地之中[1]。新疆圓柏枝葉在我國民間常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療,被收載于《維吾爾藥志》、《新疆中草藥手冊》和《中國沙漠藥用植物》等醫(yī)藥文獻(xiàn)中。該植物包含黃酮、木脂素和萜類等多種類型的化學(xué)成分,其中黃酮類化合物是其主要化合物之一[2-5]。

高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是近10年迅速發(fā)展起來的新型液-液分配色譜技術(shù)。與其他分離手段相比,HSCCC不用固相載體作固定相,并具有分離純度高、樣品回收率高、適用范圍廣、能夠同時(shí)純化出多個(gè)單體化合物等優(yōu)點(diǎn),在醫(yī)藥[6]、天然產(chǎn)物化學(xué)[7]、食品[8]等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HSCCC從新疆圓柏枝葉中分離黃酮類成分,以期得到分離黃酮的快速簡便方法,為進(jìn)一步藥理藥效研究和新藥的研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新疆圓柏 于2014年9月采自烏魯木齊后峽地區(qū),由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定;對照品異槲皮苷(批號(hào)MUST-15070211)、槲皮苷(批號(hào)MUST-13022112) 成都曼思特生物科技有限公司(純度均大于98%);D101大孔吸附樹脂 天津興南允能高分子技術(shù)有限公司;100～200目柱層層析硅膠 青島海洋化工廠分廠;60～90目柱層析聚酰胺 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;甲醇與乙腈 為色譜純,美國Fisher公司;水 為純凈水;其余試劑為 國產(chǎn)分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TBE-300A高速逆流色譜儀 上海同田生化技術(shù)有限公司;N2000色譜工作站 浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司;LC-10ATvp高效液相色譜儀、UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)、SPD-10Avp紫外可見檢測器 日本島津有限公司;AS系列超聲波清洗機(jī) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;INOVA-400型超導(dǎo)核磁共振儀 美國VARIAN公司;RT-3型熔點(diǎn)測定儀 天津新天光分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新疆圓柏總黃酮的制備 取新疆圓柏枝葉樣品1 kg,以料液比1∶7(g/mL)加入50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮至膏狀。然后以適量硅膠拌樣后上硅膠柱,分別用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)、60%乙醇洗脫。收集60%乙醇洗脫液,減壓濃縮至無乙醇味后,再用蒸餾水溶解制成樣品溶液。然后上D101大孔樹脂柱,收集50%乙醇洗脫液,減壓濃縮至干[9]。接著上聚酰胺柱,分別用水、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,收集50%乙醇洗脫液,50 ℃下減壓濃縮至干,用于高速逆流色譜分離。

1.2.2 溶劑體系的選擇 選擇兩相溶劑系統(tǒng)是通過目標(biāo)化合物的分配系數(shù)K來確定的。K值通過HPLC檢測確定,步驟如下:取大約5 mg樣品放入試管中,加入已平衡的兩相溶劑系統(tǒng),上、下相溶劑各5.0 mL,充分振搖溶解后靜置分層,分別取上、下相4 mL旋蒸干,用甲醇溶解定容至10 mL,用HPLC檢測,上相和下相的峰面積分別為A1和A2,分配系數(shù)K=A1/A2。

1.2.3 HSCCC分離過程 溶劑系統(tǒng):將氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(1200 mL∶900 mL∶150 mL∶600 mL,即4∶3∶0.5∶2)加入分液漏斗中,充分振搖后靜置過夜。實(shí)驗(yàn)前將分配平衡的兩相溶劑系統(tǒng)按上相和下相分開放入瓶中,超聲脫氣20 min,以備使用。操作步驟:首先將兩相溶劑系統(tǒng)中已超聲脫氣后的上相(固定相)以10 mL/min泵入HSCCC螺旋管中,待螺旋管充滿后,緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)至850 r/min,順時(shí)針旋轉(zhuǎn),同時(shí)將下相(流動(dòng)相)以2.0 mL/min泵入其中,待兩相平衡后,取樣品200 mg溶于5 mL上相和5 mL下相溶液,由進(jìn)樣閥注入到螺旋管中,同時(shí)開始采集數(shù)據(jù),通過紫外檢測器(254 nm)檢測流出物,按照色譜圖手動(dòng)收集各成分。保留率計(jì)算公式如下：

保留率(%)=(V總-V出)/(V總-V環(huán))×100

式中V總為管路總體積;V出為流動(dòng)相推出固定相體積;V環(huán)為進(jìn)樣環(huán)體積(20 mL)。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)分析 采用HPLC檢測新疆圓柏總黃酮的成分及經(jīng)HSCCC分離后各色譜峰的純度。HPLC分析條件:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(A):0.2%磷酸水溶液(B);梯度洗脫程序(0 min～2 min～20 min～25 min,19% A～20% A～24% A～19% A);柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC分離溶劑系統(tǒng)的選擇

溶劑系統(tǒng)是決定HSCCC分離效果的最重要因素,應(yīng)該滿足以下幾方面的要求:a.不造成樣品的分解與變性;b.足夠高的樣品溶解度;c.樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)值;d.固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。結(jié)合所分離樣品的極性偏大,選用極性較大的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行研究。本研究采用HPLC測定,共考察了以下幾個(gè)溶劑系統(tǒng),結(jié)果見表1。

表1 化合物在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)

K值越大,化合物在固定相中分配越高,導(dǎo)致分離的時(shí)間過長,影響分離效率;K值越小,出峰越快,分離效果差。從表1可以看出,溶劑系統(tǒng)K值比較符合條件的是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)和氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),但是溶劑系統(tǒng)正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)的b、c化合物的K值比較接近,分離度小,無法將它們分開。因此,選擇溶劑系統(tǒng)為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),其固定相保留率為73.3%。

2.2 HSCCC分離純化的結(jié)果

根據(jù)HSCCC色譜圖手動(dòng)收集,得到3種化合物,分離情況見圖1。新疆圓柏總黃酮(200 mg)HSCCC分離得a(24.6 mg),b(54.6 mg)和c(26.8 mg)三個(gè)主要組分。

圖1 新疆圓柏總黃酮的高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

峰a和b通過TLC和HPLC檢測,并和對照品相對照,鑒定為異槲皮苷和槲皮苷。

峰c為淡黃色粉末,熔點(diǎn):207～209 ℃,10%硫酸-乙醇溶液顯色呈黃色,遇1%三氯化鐵-乙醇溶液顯色呈黃綠色,UV(MeOH):254 nm,361 nm;1HNMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:6.19(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),6.41(1H,d,J=1.6 Hz,H-8),7.52(1H,s,H-2′),6.82(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),7.53(1H,d,J=6.8 Hz,H-6′),δ5.37(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″).13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:156.7(C-2),133.1(C-3),177.5(C-4),161.4(C-5),98.9(C-6),164.4(C-7),93.7(C-7),156.5(C-9),104.0(C-10),121.7(C-l′),115.3(C-2′),145.0(C-3′),148.7(C-4′),116.3(C-5′),121.2(C-6′),101.2(C-1″),74.2(C-2″),76.4(C-3″),69.8(C-4″),74.2(C-5″),63.0(C-5″),170.0(>C=O),20.3(CH3)。以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為槲皮素-3-O-(6″-O-乙?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 純度檢測

新疆圓柏總黃酮的HPLC色譜圖見圖2。經(jīng)HSCCC分離所得主要峰通過HPLC檢驗(yàn)(圖3),用峰面積歸一法計(jì)算純度。

圖2 新疆圓柏總黃酮的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

圖3 HSCCC中3個(gè)組分的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC profiles of three components in HSCCC

HPLC檢測結(jié)果表明,峰a是異槲皮苷,純度為91.89%;峰b是槲皮苷,純度為98.45%;峰c是槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷,純度為95.35%。從結(jié)果可知,HSCCC高效、快速、連續(xù)地從新疆圓柏總黃酮中分離得到3種主要的黃酮類化合物。新疆圓柏總黃酮種類多、結(jié)果復(fù)雜,通過其他方法純化比較復(fù)雜,而采用HSCCC方法操作方便、分離時(shí)間短、樣品回收率高,同時(shí)制備成本較低、重現(xiàn)性好,一步分離得到新疆圓柏總黃酮中3種主要的黃酮類化合物,這為高速逆流色譜技術(shù)在藥物工業(yè)中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

應(yīng)用高速逆流色譜分離新疆圓柏總黃酮,得到3種黃酮類化合物,純度均大于90%。經(jīng)結(jié)構(gòu)表征,分別確定為:異槲皮苷(91.89%)、槲皮苷(98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷(95.35%),其中化合物c為首次從圓柏屬植物中分離得到的成分。由于HSCCC不用固態(tài)載體做固定相,避免了載體填充物所形成的不可逆吸附、減少了樣品的損耗、分離時(shí)間短、回收率高、分離效率高,能實(shí)現(xiàn)更有效的制備性分離和純化,可用于新疆圓柏中黃酮類成分的快速分離。

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Separation and purification of flavonoids fromJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography

LI Qian1,LI Chen-yang2,Maiwulajiang ABUDUREYIMU1,XU Fang2,ZHAO Jun2,*

(1.College of Life Sciences&Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines,Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China)

Objective:To study separation and purification of flavonoids from the leaves ofJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography(HSCCC). Methods:Solvent system of chloroform∶methanol∶n-butanol∶water(4∶3∶0.5∶2)was employed,the upper phase as stationary phase,the lower phase as mobile phase,a flow-rate of 2.0 mL/min,the rotation speed 850 r/min and detection wavelength 254 nm,flavonoids fromJuniperussabinaL. were isolated and purified under this condition. Results:Three compounds were separated from the leaves ofJuniperussabinaL. as isoquercitrin(a,91.89%),quercitrin(b,98.45%),quercetin-3-O-(6″-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside(c,95.35%),of which compound c was separated fromJuniperusgenusfor the first time. Conclusion:This method could conveniently and effectively separate flavonoids fromJuniperussabinaL.

high-speed counter-current chromatography;JuniperussabinaL.;flavonoids;separation

2016-05-20

李倩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：藥食兼用植物的研究與開發(fā)，E-mail：yaaitingzheng@163.com。

*通訊作者:趙軍(1973-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥與天然藥物化學(xué)研究，E-mail:zhaojun21cn@163.com。

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃(201433103)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)22-0059-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.003