李緒鵬 彭家杰 胡浩光 劉少彬 莫炯懷 郭少忠

（東莞市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，廣東 東莞 523002）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的不確定度分析

李緒鵬 彭家杰 胡浩光 劉少彬 莫炯懷 郭少忠*

（東莞市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，廣東 東莞 523002）

評定了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物含量的測量不確定度。該方法測量不確定度的主要來源有：標準曲線擬合；標準溶液配制；同位素-內(nèi)標配制；樣品的稱量；樣液的定容；加標回收率；測量重復(fù)性。通過建立數(shù)學(xué)模型，對結(jié)果進行分析和量化，發(fā)現(xiàn)該方法的測量不確定度主要由加標回收率、標準曲線擬合及測量重復(fù)性引起，其它因素是次要的。實際操作過程中可通過增加混合標準工作液的測定次數(shù)及平行樣品的測定，對分析方法進行優(yōu)化以保證方法的可靠性和數(shù)據(jù)的準確性等來減少不確定度。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；硝基呋喃類代謝物；水產(chǎn)品；不確定度；測定

硝基呋喃類藥物是人工合成的抗感染類藥物[1]，此類藥物可在動物機體內(nèi)與蛋白結(jié)合產(chǎn)生代謝物并發(fā)生基因突變，其代謝速度快[2]，滯留時間久[3]，具有高致癌、高致畸和高毒性[4]，給食用者的健康帶來潛在風(fēng)險，引起人們的高度重視。目前，全球大多數(shù)國家均禁止將該藥物作為獸藥使用，并采用液質(zhì)方法[5-10]對硝基呋喃類代謝物進行測定，限量值為1.0 μg/kg[11]。

為確保硝基呋喃類代謝物殘留量檢測結(jié)果的準確性，工作試驗中應(yīng)根據(jù)相關(guān)權(quán)威技術(shù)規(guī)范[12]要求進行測量不確定度的評定。測量不確定度是說明被測量之值分散性的參數(shù)，是判斷測量結(jié)果的依據(jù)和評定測量水平的參數(shù)指標[13]。本文依據(jù)《測量不確定度評定與表示》[14]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[15]規(guī)定的基本方法和程序，對農(nóng)業(yè)部783號公告1-2006[16]液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的硝基呋喃類代謝物殘留量的不確定度進行分析評定，建立數(shù)學(xué)模型，找出影響不確定度的主要分量，并對其不確定度進行了評定和表示，以保證方法的可靠性和數(shù)據(jù)的準確性，從而提高檢測質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

API4000+液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配ESI離子源（美國AB SCIEX公司）；LXJ-IIB 型離心機（上海安亭）；ZWY-110X50 往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；MS3 Digital 漩渦振蕩器（德國IKA公司）；N-EVAP 24 氮吹儀（美國Organomation公司）；超純水機（Milli-Q公司）。

1.2 標準品與試劑

AOZ、AMOZ、AHD·HCl、SEM·HCl、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C-15N2以上標準品均購自Sigma 公司；甲醇、乙酸乙酯、二甲亞砜、2-硝基苯甲醛，甲酸為色譜純，購自Fisher scientific 公司；鹽酸、磷酸氫二鉀、乙酸銨為優(yōu)級純，購自廣州化學(xué)試劑廠；實驗用水為超純水。

1.3 樣品前處理方法

樣品：稱2 g 樣品于50 mL 離心管中，加入50 μL濃度為100 ng/mL的同位素-內(nèi)標混合標準溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻50 s后，置于往復(fù)式水浴恒溫振蕩器中37℃避光振蕩16 h。

取出離心管待冷卻至室溫，加入4.2 mL磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋混勻50 s，4000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層清液至10 mL玻璃離心管中，于40 ℃下N2吹干。準確加入1.0 mL甲醇水溶液溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，待液質(zhì)測定。

標準溶液：分別在5支50 mL離心管中分別加入10、50、100、250、500、1000 μL濃度為10 ng /mL的混合標準溶液。除不加樣品外，按照上述樣品處理方法處理后，進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測定方法，建立樣品中硝基呋喃類代謝物含量的數(shù)學(xué)模型如下：

式中：X為樣品中待測物含量（μg/kg）；R為樣液中的待測物與同位素內(nèi)標峰面積比值；c為標準溶液中待測物濃度（ng/mL）；Rs為標準溶液中的待測物與同位素內(nèi)標峰面積比值；V為樣液最終定容體積（mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）。

2.2 測量不確定度的來源及合成

樣品中硝基呋喃類代謝物測量不確定度來源主要有以下幾個方面：標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(c0)；標準溶液配制過程中的相對標準不確定度urel(cs)；同位素-內(nèi)標引入的相對標準不確定度；樣品的稱量過程中引入的相對標準不確定度urel(m)；樣液濃縮的最終定容體積引入的不確定度urel(V)；加標回收率引入的相對標準不確定度urel(R)；樣品上機重復(fù)測量引入的不確定度urel(frep)。方差合成標準不確定度的數(shù)學(xué)模型為：

2.3 各項相對標準不確定度的分量計算

2.3.1 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(c0)

本試驗以SEM為例，對SEM梯度標準工作溶液（C）進行檢測，每個濃度檢測1次，以峰面積比（Ai）與標準溶液濃度（Ci）采用最小二乘法擬合，標準曲線測定結(jié)果及線性回歸（）見表1。曲線擬合引入的不確定度為：回歸直線標準偏差；Ai 為第i個標準溶液峰面積比值；a 為線性回歸方程的截距；b 為斜率；Ci 為第i點的質(zhì)量濃度值；C0為樣品的測定值；為標準溶液質(zhì)量濃度的平均值；n=6為標準溶液濃度點。計算結(jié)果見表1。

表1 SEM的標準曲線測定結(jié)果和不確定度計算

2.3.2 標準溶液配制過程中的相對標準不確定度urel(c的數(shù)學(xué)模型為

表2 標準溶液配制過程中的相對標準不確定度

表2 標準溶液配制過程中的相對標準不確定度

?

表3 同位素-內(nèi)標引入的相對標準不確定度

2.3.4 樣品的稱量過程中引入的相對標準不確定度urel(m)

根據(jù)稱量樣品所用天平計量證書查得U= 0.03 g，按矩形分布，k=。稱量樣品為2.00 g，天平稱量過程中引入的不確定度為：

2.3.5 樣液濃縮的最終定容體積引入的不確定度urel(V)

樣液最終定容使用1mL吸液器，按照JJG196-2006[17]要求，1mL吸液器的允許誤差為± 1.5 %，按照均勻分布，k=3，樣液定容引入的不確定度為

2.3.6 加標回收率引入的相對標準不確定度urel(R)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部783號公告1-2006 標準文本的實驗方法，在空白樣品中添加1.00 μg/kg水平的混合標準，進行6次加標回收試驗，用公式算樣品加標回收的相對標準不確定度，按均勻分布，k=，計算結(jié)果見表4。

表4 樣品加標回收引入的相對標準不確定度

2.3.7 樣品上機重復(fù)測量引入的不確定度urel(frep

在同一未檢出樣品中添加同一濃度的混合標準溶液，按照1.3方法進行處理和液質(zhì)上機測定，重復(fù)測定6次，用貝塞爾公式進行計算，最后計算結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)測定結(jié)果和不確定度計算

2.3.8 合成不確定度及檢測結(jié)果表述ucrel

以上各項不確定度分量相互獨立，不考慮分量間的相關(guān)性，將上述SEM各值代入公式（2）中，最終檢測結(jié)果取包含因子k=2（近似95 %置信概率），用擴展不確定度U=k ?ucrel表示，AOZ、AHD和AMOZ的評定結(jié)果同理，見表6。

表6 相對標準不確定度評定結(jié)果

3 結(jié)論

本文參考多篇不確定度評定文獻[18-22]及其相關(guān)測定方法，結(jié)合實際操作情況，按照測量不確定度的評定標準，分析不確定度分量因素，建立數(shù)學(xué)模型，進行不確定度各分量的評定，得出最終的不確定度主要來源于樣品試驗處理過程中的標準曲線擬合、加標回收率以及樣品重復(fù)測量這3方面，其他因素來源于實驗員配制標準溶液過程中帶來的不確定度。因此，為保證最終結(jié)果的準確性，可在實際操作過程中通過增加混合標準工作液的測定次數(shù)及平行樣品的測定，對分析方法進行優(yōu)化以保證方法的可靠性和數(shù)據(jù)的準確性，同時樣品的采集與制備對試驗過程帶來的不確定度也不容忽視。

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O657.7

A

10.11974/nyyjs.20161232001

李緒鵬（1985-），男，助理工程師，研究方向：海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測，水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控；郭少忠（1965-），男，高級工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控、海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)養(yǎng)殖。

東莞市科技計劃資助項目（項目編號：K10017K）

*為本文通訊作者