吳晨悅，范文碩，田娟，蔡程科

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

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質(zhì) 量 工 藝

快速膜乳化法制備齊墩果酸微粒的工藝研究

吳晨悅，范文碩，田娟，蔡程科*

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

目的：初步建立無包載輔料的齊墩果酸微粒的制備方法，對制備工藝進行考察和優(yōu)化，得到分散性好、粒徑均一、分布窄的齊墩果酸微粒。方法：以齊墩果酸微粒的平均粒徑Z-average、多分散指數(shù)PDI為主要指標，輔以電鏡觀察，對影響齊墩果酸微粒成型和分散性的各因素進行考察。結(jié)果：制備的齊墩果酸微粒凍干粉平均粒徑(434.7±39.06)nm，PDI(0.25±0.08)，大小均勻，分散性好。結(jié)論：不銹鋼快速膜乳化法可用于中藥難溶性成分齊墩果酸的微粒制備，具有良好的開發(fā)前景。

齊墩果酸；快速膜乳化法；微粒

齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)是中藥中重要的有效成分之一，為五環(huán)三萜類化合物，白色針狀結(jié)晶，不溶于水；在自然界中分布廣泛[1]。OA具有護肝降酶、抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗癌、降糖、降血脂、免疫雙向調(diào)節(jié)等多種藥理作用，臨床上主要用于治療急慢性病毒性肝炎、傳染性急性黃疸型肝炎，具有明顯的降谷丙轉(zhuǎn)氨酶及退黃效果，對癥狀、體征和肝功能均有明顯的改善作用[2]。OA屬于低溶解性-低滲透性藥物，在25℃時水中溶解度僅為4.61 μg/ml，37℃時為17.59 μg/ml[3]，在Caco-2單層細胞的表觀滲透系數(shù)Papp為1.11.3×10-6cm/s[4]，影響了在胃腸道的溶出和吸收，導(dǎo)致生物利用度低，嚴重限制了其藥理作用的充分發(fā)揮。目前上市的齊墩果酸制劑主要是片劑和膠囊劑，急慢性肝炎患者每日最低服用量分別達30 mg、90 mg，因此有必要利用制劑技術(shù)提高其在生物體內(nèi)的溶解度及溶出速度，以提高生物利用度。

本研究應(yīng)用快速膜乳化法制備不含輔料的齊墩果酸微粒，以平均粒徑(Z-average)和多分散指數(shù)PDI值為考察指標，輔以電鏡下觀察OA微粒形態(tài)及分散狀態(tài)，對OA微粒的制備工藝進行初步考察。

1 材料與儀器

1.1 試藥

齊墩果酸原料(南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，批號D151106020，純度>98%)；PVA 088-20(山西三維集團股份有限公司)；乙酸乙酯(美國Fisher 有限公司，色譜純)；NaCl(北京化工廠)；葡萄糖、乳糖、甘露醇(北京化工廠)；蔗糖(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器

快速膜乳化器(中國科學院過程工程研究所)；不銹鋼膜(自制)；RT10高效10點加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；3-18N高速離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；KH-7200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；LGJ-12冷凍干燥機(北京松原華興科技發(fā)展有限公司)；Quanta-250掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)；ZetaSizer Nano-ZS 90激光粒徑測試儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸微粒制備

應(yīng)用四級串聯(lián)不銹鋼快速膜乳化法[5]制備齊墩果酸微粒。

將OA原料在70℃條件下溶解于乙酸乙酯中，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為油相。將PVA088-20在磁力攪拌(70℃、480 r/min)條件下溶解于去離子水中，至無明顯顆粒狀物質(zhì)，趁熱經(jīng)0.8 μm濾膜過濾，冷卻，作為水相。油相與水相混合、震搖形成初乳后，倒入快速膜乳化裝置，在N2壓力作用下通過四級串聯(lián)的不銹鋼膜，反復(fù)過膜3次。過膜后的乳液迅速倒入預(yù)先準備好的固化液中，磁力攪拌(480 r/min)至無乙酸乙酯氣味，使微粒充分析出。固化后的乳液加入去離子水離心清洗4次，冷凍干燥。

2.2 評價指標

2.2.1 微粒形態(tài)

取少量OA微粒凍干粉制掃描電鏡用樣品，觀察樣品形態(tài)。OA原料與OA微粒在掃描電鏡下成像如圖1所示。

圖1 OA原料及OA微粒SEM圖

2.2.2 平均粒徑及多分散指數(shù)

圖2 OA微粒粒徑分布圖

2.3 齊墩果酸微粒制備影響因素考察

根據(jù)前期經(jīng)驗，按照水相PVA濃度4%、油相濃度0.3%、油相：水相1∶4、過膜壓力600KPa、過膜后乳液：固化液1∶3、離心速度9 000r/min的條件初步制備了OA微粒，OA微粒形貌如圖3所示。為改善OA微粒凍干粉的成型及分散性，對可能影響其分散的各個因素進行了逐一考察。文中如無特別說明，條件如上。

圖3 試制OA微粒SEM圖

2.3.1 過膜后乳液與固化液體積比考察

對不同的乳液與固化液體積比考察如表2所示，微粒成型如圖4所示。結(jié)果顯示，隨著固化液體積比增大，Z-average及PDI均有減小的趨勢。SEM可觀察到1∶2與1∶4兩組，微粒成型較差，存在大量片狀物，可以推測1∶2、1∶4兩批中殘留了PVA，在粒徑檢測時溶解于水中，致平均粒徑減小。綜合掃描電鏡與粒徑檢測結(jié)果，以過膜后乳液與固化液體積比1:5時微粒成型狀態(tài)、平均粒徑及PDI值均較好。

表2 固化液體積考察試驗表

2.3.2 離心速度考察

為提高微粒再分散性同時保證PVA完全除去，將固化后的乳液用去離子水稀釋1倍后離心。不同離心速度考察及結(jié)果如表3。在4 500r/min的條件下，離心時間達到50min仍然沒有藥物分離出。由粒徑分布結(jié)果可知：6 000r/min和8 000r/min離心效果較好，但是離心速度慢耗時長，效率低；第一次離心8 000r/min時，加水洗滌時不容易分散均勻，OA微粒黏連較嚴重。為改善上述情況，選擇6 500r/min，30min+6 500r/min，10min×4次進行洗滌，粒徑檢測結(jié)果如圖5所示，Z-average=544.9nm，PDI=0.231。

圖4 不同體積固化液制備的OA微粒SEM圖

編號離心速度與時間平均粒徑(nm)PDI14500r/min,50min——24500r/min,30min;5500r/min,30min+10min×4799.00.39236000r/min,50min+10min×4605.50.16548000r/min,30min+5500r/min,10min×4395.50.23859000r/min,30min+5500r/min,10min×4827.50.221

圖5 6 500 r/min制備的微粒粒徑分布圖

2.3.3 水相PVA濃度考察

對水相PVA濃度進行考察，如表4所示。由粒徑檢測結(jié)果可以看出，一定范圍內(nèi)，隨著水相PVA濃度的增大，平均粒徑及PDI值有減小的趨勢，以4%時最好，但是PVA濃度為4%時，粒徑檢測結(jié)果顯示三個峰，分布不均勻。綜合Z-average和PDI值，當水相PVA濃度為3%時最好。

2.3.4 固化溫度考察

加熱固化及常溫固化考察如表5所示，水相PVA濃度為3%。由試驗結(jié)果可知常溫固化效果不好，推測常溫時，溶劑揮發(fā)慢，液滴保持液態(tài)的時間長，相互之間發(fā)生融合的幾率高，融合后的液滴體積發(fā)生比較大的變化。

表4 不同PVA濃度考察

表5 固化溫度考察試驗表

2.3.5 固化液種類考察

表6 不同固化液考察

2.3.6 凍干保護劑考察

為減小凍干過程對微粒粒徑的影響，需要加入凍干保護劑[6]。通過對比凍干前后微粒混懸液粒徑變化，考察不同凍干保護劑對微粒的保護效果，見表7。離心洗滌后每支離心管(含OA60mg)加入2mL凍干保護劑超聲分散均勻后凍干。

表7 凍干保護劑對OA微粒粒徑的影響

加入葡萄糖和蔗糖組，OA微粒吸濕性很強，黏度很大，不成粉末。而加入乳糖和甘露醇組與不加凍干保護劑組相比，均能降低OA微粒再分散后的平均粒徑，說明可以改善OA微粒的分散性。為最大程度降低由于凍干造成的OA微粒團聚，對乳糖和甘露醇的濃度進行考察，如表8所示。以15%乳糖和3%甘露醇為凍干保護劑時，OA微粒的平均粒徑較小。15%乳糖為凍干保護劑時，凍干樣品表面出現(xiàn)塌陷，因此選擇3%甘露醇作為凍干保護劑。

表8 凍干保護劑不同濃度對OA微粒粒徑的影響

綜上，在油相濃度為0.3%、油相與水相體積比為1∶4的條件下，優(yōu)選水相濃度3%、過膜后乳液與固化液體積比1∶5、固化液為2.4%PVA+0.9%NaCl、固化溫度70℃、以6 500r/min速度離心30min后洗滌4次，每次10min，凍干前加入3%甘露醇制備的OA微粒平均粒徑較小，分散較容易。按照此條件進行工藝驗證結(jié)果如表9，平均粒徑(434.7±39.06)nm，PDI(0.25±0.08)。

表9 工藝驗證結(jié)果

3 討論

快速膜乳化法被認為是制備單分散乳滴最有效、實用的方法，課題組開發(fā)的不銹鋼膜已經(jīng)成功應(yīng)用于水飛薊賓PLGA微球[7]和水飛薊賓微粒[5,8]的制備，本研究采用不銹鋼膜首次制備了不含包載輔料的球形齊墩果酸微粒。課題前期研究已經(jīng)證明膜孔徑、水相濃度、油相與水相體積比、過膜壓力等是影響微球及微粒平均粒徑和粒徑均勻度的主要因素，本研究主要對影響齊墩果酸微粒分散性的影響因素進行了探究。研究結(jié)果表明，除水相濃度外，固化及干燥過程對OA微粒的分散性均有顯著影響。一定范圍內(nèi)，水相濃度越高，微粒的平均粒徑越小，PDI越小，分散性越好；固化液中加入適量的電解質(zhì)可以增大電位，增加乳滴之間的斥力，從而提高乳液的穩(wěn)定性；固化液體積比增大，可以使乳滴充分分散，減小再團聚的可能；加熱固化，可以縮短固化時間，減小液滴融合的幾率；凍干時加入合適的凍干保護劑能夠有效的防止微粒再次聚集，減小粒徑分布跨度，提高微粒凍干粉的穩(wěn)定性。

目前藥物微粉化常用的方法有氣流粉碎、膠體磨、球磨等，通常只能將藥物粒徑加工至25μm以下，只有極少數(shù)小于1μm，在該尺度范圍內(nèi)，由于粒子比表面積的增加，可以增大藥物的溶出速率，但是藥物的溶解度提高并不顯著[9]。本實驗制備的齊墩果酸微?？梢詫⒘娇刂圃?μm以下，實現(xiàn)了微粉化藥物向亞微米化藥物的發(fā)展；同時與常規(guī)的微球、微囊制備方法相比，由于不含包載輔料，因此不必考率包封率、載藥量以及輔料安全性問題。但是目前制備的OA微粒凍干粉再分散性仍然不能滿足注射給藥的要求，即凍干粉需要較長時間超聲才能分散完全，不能在短時間混懸均勻；并且分散均勻后不能長時間穩(wěn)定懸浮于水中，容易發(fā)生沉降。作者期望通過進一步試驗從多方面改善OA微粒再分散性和穩(wěn)定性問題，為齊墩果酸亞微粉化及新制劑的開發(fā)提供一種新的思路。

[1] 田麗婷,馬龍,堵年生.齊墩果酸的藥理作用研究概況[J].中國中藥雜志,2002,27(12):9-11.

[2] 楊桂明,胡志芳.中藥藥劑學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:437.

[3] 趙爭勝,邢黎明,周彥召,等.齊墩果酸鈉鹽的制備及其溶解度[J].中成藥,1991,13(8):32.

[4]JeongDW,KimYH,KimHH,etal.Dose-linearpharmacokineticsofoleanolicacidafterintravenousandoraladministrationinrats[J].Biopharm.DrugDispos,2007, 28(2):51-57.

[5] 尹雪雁,許涼涼,伊辛,等.均勻與正交設(shè)計法優(yōu)化水飛薊賓微粒制備工藝的比較研究[J].天津中醫(yī)藥,2015,32(12):752-756.

[6] 趙曉玲.齊墩果酸納米懸浮液及其凍干粉的制備[D].武漢:華中科技大學,2006.

[7] 戎堃,劉彬麗,李木子,等.不銹鋼膜乳化法制備PLGA微球的初步研究與評價[J].中國中藥雜志,2014,39(7):1229-1233.

[8] 伊辛,許涼涼,尹雪雁,等.不銹鋼膜乳化法制備水飛薊賓微粒的工藝優(yōu)化[J].世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(1):243-248.

[9] 陳亞軍.齊墩果酸納米懸浮液研究[D].武漢:華中科技大學,2005.

Preparation of Oleanolic Acid Particles through Premix Membrane Emulsification

WU Chen-yue, FAN Wen-shuo, TIAN Juan, CAI Cheng-ke*

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective: To achieve well dispersible, relatively uniform and narrow size distribution Oleanolic Acid (OA) particles without coating materials and to establish a method and optimize the process parameters. Methods: Take Z-average and PDI of OA particles as main indexes, and supplement electron microscope to investigate the factors which may influence the shape and dispersibility of OA particles. Results: Uniform and well dispersible OA particles were prepared by premix membrane emulsification method. The average particle size was (434.7±39.06)nm and PDI was (0.25±0.08). Conclusion: Stainless steel premix membrane emulsification could be used to prepare insoluble component OA particles, and has a promising developmental prospect.

Oleanolic acid;Premix membrane emulsification;Particles

國家自然科學基金面上項目(No.81173562)；北京中醫(yī)藥大學自主選題在讀研究生項目(No.2016-JYB-XS102)

吳晨悅(1992-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向：微粒給藥系統(tǒng)研究。

蔡程科*(1971-)，男，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥新劑型與制藥新技術(shù)研究。

2016-09-01

R283.6

A

1002-2406(2017)01-0029-04

修回日期：2016-09-30