劉 娜，李紅俠，張文彬，胡曉航，3*

（1.黑龍江大學農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080；3.農(nóng)業(yè)部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，哈爾濱150080）

2015年國外甜菊研究回顧

劉 娜1，2，李紅俠1，2，張文彬1，胡曉航1，2，3*

（1.黑龍江大學農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080；3.農(nóng)業(yè)部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，哈爾濱150080）

對2015年國外英文文獻報道的甜菊及其提取物的研究概況進行回顧，為國內(nèi)了解和掌握國外甜菊研發(fā)動態(tài)提供參考。

甜菊；提取物；甜菊糖苷；萊鮑迪苷；回顧

甜菊（Stevia rebaudiana）作為第三糖源，具有甘蔗糖和甜菜糖不可替代的十大優(yōu)點：純天然安全、熱穩(wěn)定性、零卡路里、對血糖無影響、非可發(fā)酵性、酸堿性穩(wěn)定、比普通蔗糖甜150～300倍、無褐變反應、無脂肪和碳水化合物、防齲齒。還有特殊的藥用與保健功效，因此受到國內(nèi)外尤其肥胖癥、糖尿病、代謝綜合癥等群體的青睞，因消費需求和應用逐年增加而得到長足的發(fā)展；全球甜菊產(chǎn)品產(chǎn)量由2009年的2750t逐年增長到2014年的4670t，預計2016年產(chǎn)量將達6250t，銷售額將達4.9億美元[1]。隨著研究的深入，新的功能、新的方法被相繼開發(fā)問世，尤其國外對甜菊的研究更為活躍，因此有必要了解和掌握國外甜菊的研究現(xiàn)況，以期對我國甜菊及其相關產(chǎn)品的研發(fā)提供參考與借鑒。

1 甜菊的組分

甜菊糖 （Steviol glycosides，SGs）是一類由甜菊醇 （Steviol）四環(huán)二萜化合物連接不同數(shù)目的配糖體（Glycoside）組成的糖苷混合物。目前研究發(fā)現(xiàn)的有十幾種糖苷，被人們認可且做過醫(yī)學毒理實驗的有8種[1]：（1）甜菊糖苷（Stevioside，St）；（2）甜菊醇雙糖苷（Steviolbioside，Stb）；（3）萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，Reb A）；（4）萊鮑迪苷B（Reb B）；（5）萊包迪苷C（Reb C）；（6）萊鮑迪苷D（Reb D）；（7）萊鮑迪苷E（Reb E）；（8）杜爾可苷A（Dulcoside A，Dul A）。

甜菊糖無熱量，比蔗糖甜200倍左右，但它含有微量奇異果甜蛋白（thaumatin），一種甜蛋白，提供了16.7kJ/g的熱量，是相同量蔗糖甜度的約2000倍[2]。

甜菊中除了含有的SGs外，還主要含有酚酸類和黃酮類物質(zhì)，酚酸類包括：苯甲酸（Benzoic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、綠原酸（Chlorogenic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、原兒茶酸（Protocatechuic acid）、水楊酸（Salicylic acid）、Rozmaric acid等及其衍生物；黃酮類包括：山奈酸（Campherol）、兒茶酸（Catechin）、表兒茶素（Epicatechin）、毛地黃黃酮（Luteolin）、蘆?。≧utin）等及其衍生物[3]。

用水（A）、無水乙醇（E）和含水乙二醇（GA）做溶劑提取多酚和蛋白質(zhì)，結(jié)果表明：含水乙二醇（GA）做溶劑中酚類和黃酮類的最高含量分別為15.50mg/g和3.85mg/g。所有提取物含有大量的蛋白質(zhì) （69.40～374.67mg/g）。用高效液相色譜法（HPLC）分析了GA法甜菊提取物含有最高數(shù)量的茶多酚，尤其是Ferulic acid（5.50mg/g）和Rozmaric acid（4.95mg/g）衍生物；最高的抗二苯基苦基苯肼（DPPH·）和二銨鹽（ABTS·+）自由基活性是GA和E （IC50=0.38和0.71μg類黃酮/mL）；最高的Fe2+螯合能力是E（IC50=2.08μg類黃酮/ mL）。也分析了甜菊提取物的體外細胞毒性和纖維原細胞刺激潛力，E和GA最有細胞毒性和刺激性，可能是生物活性物質(zhì)含量高[3]。

多糖菊粉在食品和醫(yī)藥行業(yè)被重視。菊粉的聚合度（DP）影響溶解性、熱穩(wěn)定性、甜度和益生元活性等重要屬性。具有高聚合度的分子是通過物理技術(shù)濃縮菊糖鏈獲得的，它們通常不是從植物中提取得到。氣相色譜/質(zhì)譜分析和1H核磁共振分析表明，甜菊根的菊粉聚合度（DPn 28）比其他植物物種的菊粉高12～15。而且，通過凍/解凍可以增加鏈進而增加DP，類似于其他方法用于菊糖鏈的濃縮；益生元化驗證實了甜菊菊粉的DP高含量。表明甜菊根有望是高聚合度菊粉的資源[4]。

隨著研究的深入，甜菊中新的未被認識的物質(zhì)相繼被發(fā)現(xiàn)。在甜菊提取物中分離出一種新的雙萜糖苷：15α-羥基-萊鮑迪苷M，根據(jù)核磁共振說明SGs具有中環(huán)雙萜核心C-15的羥基團，以前未曾報道過[5]。新型的甜菊氨基酸甜味劑——甜菊甘氨酸乙酯（ST-GL）和甜菊丙氨酸甲酯（ST-AL）被合成了，并測定評價了其感官屬性及其毒性、熔點、溶解性和熱穩(wěn)定性，在酸性、中性或100℃持續(xù)2h的水溶液中是穩(wěn)定的，其甜味高于蔗糖，ST-GL和ST-AL溶液沒有苦味、甜味純正，可用于低熱量食品的生產(chǎn)[6]。

2 甜菊的提取、加工、分析、測定

采用兩個不同的商用儀器ASCPC250和FCPE300（柱分別為1890和231雙池）離心分配色譜法從甜菊葉的天然水提物純化大規(guī)模的SGs；由乙酸乙酯、正丁醇和水梯度洗脫模式組成的雙極相溶劑系統(tǒng)完成。當使用1890分區(qū)池離心分配色譜法250mL柱，從1 g初始混合物提取42mg St、68mg Dul A和172mg Reb A，純度分別為81%、83%和99%；對231柱303mL（樣品載量可增加到5 g）的強化生產(chǎn)率得到進一步提高，致使回收得到1.2g St、100mg Dul A和1.1g Reb A，純度分別為79%、62%和98%[7]。

應用超聲波和微波能技術(shù)，采用不同溫度（50～100℃）、時間（1～40min）和微波能（1.98和3.30 W/g），從脫水甜菊葉固液萃取SGs（甜味劑）和抗氧化劑（總酚類、類黃酮和抗氧化能力），并與傳統(tǒng)提取方法（大氣壓力下的高溫）比較。結(jié)果收益率有很大的差異，SGs和抗氧化劑呈負相關關系。SGs得到最大的收益是微波能3.30 W/g提取2min；然而，傳統(tǒng)方法（90℃、1min）是提取抗氧化劑最適合的。因此，最好的方法取決于甜菊葉水提物做為甜味劑或抗氧化劑的后續(xù)使用[8]。

為更快和可再生的需要，用加速溶劑萃取法優(yōu)化自動提取甜菊干葉。采用效應面優(yōu)化法（Response surface methodology）調(diào)查提取溫度、靜態(tài)時間和周期數(shù)3個因素對St和Reb A提取收益率的影響。結(jié)果表明，所有的因素都對收益率有影響，最佳提取條件是在100℃、4min和1個周期，收益率占總可抽出SGs的91.8%±3.4%；通過減少葉子研磨的大小完成了優(yōu)化：最終收益率達100.8%±3.3%[9]。

用聲波降解法進行甜菊葉中SGs提取的優(yōu)化，測定了異丙醇濃度 （60%，v/v）、時間 （6～24min）、溫度（30℃）和聲波（300～480 W）對從葉中提取Reb A和用聚合物對提取液的脫色（賽派欄絮凝劑AP30和樹脂ADS-7）的影響。結(jié)果表明，異丙醇適合于甜菊葉提取Reb A，在輸出功率360 W、處理時間18min時，Reb A產(chǎn)量達到35.61g/100g。聲波降解法對甜菊葉的粒度和提取液的顏色有影響，隨著聲波降解強度的增加，粒徑降低了。不同處理下甜菊提取液的顏色差異顯著。AP30和ADS-7可去除色彩的雜質(zhì)，65%以上的有色雜質(zhì)被AP30（結(jié)合氧化鈣）去除掉[10]。

用噴霧、凍結(jié)和真空干燥箱干燥來降低SGs的苦味，并提高其性能。以80∶20、75∶25、70∶30、65∶35不同比的麥芽糊精與菊粉作為測定劑，而SGs占總固體的濃度維持在2.5%。結(jié)果不同干燥方法的微膠囊化效率（MEE%）、水分含量、結(jié)構(gòu)和溶解度值差異顯著；降低吸濕性值（20.26～26.67g水/100g DW）有助于提高穩(wěn)定性；紅外光譜技術(shù)證實，在干燥過程中SGs保持其化學完整性，噴霧干燥的SGs產(chǎn)品呈現(xiàn)最好的理化特性和最吸引人的感覺[11]。

甜菊葉一般是在干燥狀態(tài)下使用，因此干燥過程必然對最終成品的質(zhì)量產(chǎn)生影響。通過分析相關的生物活性組分、抗氧化性、天然甜味劑及礦物質(zhì)含量來評價溫度的影響。干燥過程是在對流烘干機30～80℃恒溫完成的。結(jié)果，葉片中Vc含量與溫度成反比，即隨著溫度的升高而下降；酚類物質(zhì)和黃酮類在溫度小于50℃時隨溫度增加而增加；用DPPH法和氧化自由基吸收能力（ORAC）法測定了抗氧化劑活性，ORAC法在40℃時達最高，與酚類物質(zhì)和黃酮類含量有較好的相關性。當溫度達到50℃以上時，8種天然甜味劑中除了Stb外7種成分含量增加了，在溫度60～80℃甜味劑增加不顯著[12]。使用100℃和180℃的熱風干燥、冷凍干燥和陰涼干燥的不同干燥條件，對甜菊葉中甜菊糖（St、Dul A、Reb A和Reb C）和抗氧化劑進行評估。St是鮮葉的主要糖苷，含量81.2mg/g，在任何情況下都會降低，雖然陰涼干燥是最好的處理?？紤]到抗氧化參數(shù)（總酚類、黃酮類和總抗氧化劑），最合適的熱風干燥法在180℃，因為大大增加了沒食子酸、兒茶素和羧酸含量（分別為76.8、45.1、126mg/g甜菊），在鮮葉的含量分別為44.4、2.5和52.9mg/g甜菊。因此，理想的甜菊葉干燥法取決于他們最終的用途（甜味劑或抗氧化劑），盡管如此，在180℃的熱風處理法是最值得推薦的[13]。

SGs具有甜味和生物活性，然而除了主要糖苷外，提取物中還有能有助其活性的其他苷，因此對其量化是重要的。用HPLC-UV法來測定Dul A、Stb、Reb C和Reb B，結(jié)果：校正曲線的線性工作范圍為25～150μg/ mL，相關系數(shù)≥0.99，測定系數(shù)≥0.98；檢測限（LOD）為5.68～8.81μg/mL，量化限（LOQ）為17.21～26.69μg/mL；回收率為100%±10%，精度、相對標準偏差＜10%。該方法驗證了準確性、線性度和精度，因此可應用于甜菊葉小SGs的定量分析[14]。用UHPLC-UV方法對甜菊產(chǎn)品的葡萄糖進行定量測定。St產(chǎn)品與苯基吡唑酮（PMP）反應后，分析PMP衍生品發(fā)現(xiàn)35個產(chǎn)品至少有7個含有0.3%～91.5%（w/w）的葡萄糖，其中SPR-12和SPR-27分別表現(xiàn)出61.6%和91.5%的高葡萄糖含量。此外，UHPLC-UV-ELSD法用于定量測定甜菊及相關產(chǎn)品的Reb A、St、Reb D、Dul A和Stb。運行12min，基線分離了5個SGs，LOD和LOQ分別小于10和30μg/mL，再現(xiàn)性小于2.5%，回收率為90%～94%；葡萄糖的PMP衍生物LOD和LOQ分別為0.01和0.05μg/mL，再現(xiàn)性小于2.6%，回收率為-101.7%～98.6%。該方法可用于甜菊和SGs甜菊產(chǎn)品的鑒定、質(zhì)量保證和摻雜物評估[15]。

對歐洲8個地區(qū)、7個不同的甜菊品種種植2年以上、1年收獲3次的總共166個甜菊樣本的綠原酸和總黃酮苷進行分析和量化?；衔锏牧炕ňG原酸、類黃酮苷和糖苷配基。所有酚濃度分布剖面圖表現(xiàn)為完美的高斯分布，所有的綠原酸濃度顯示為正相關，而黃酮苷卻沒有相關性[16]。

3 甜菊的培養(yǎng)基、分子生物學、轉(zhuǎn)基因研究

綠原酸及其衍生物（CADs）是有益于健康的生物活性植物次生代謝產(chǎn)物。進行了甜菊毛狀根培養(yǎng)，并優(yōu)化了生產(chǎn)CADs的培養(yǎng)條件研究。由甜菊葉和農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes，C58C1）侵染后共培養(yǎng)誘導毛狀根，進行rolB和rolC基因的PCR檢測驗證。HPLC-MS和HPLC分析表明，綠原酸[3-咖啡?？鼘幩幔?-CQA），3，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-CQA）和4，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-CQA）]是毛根中主要的CADs。選擇8個快速生長的單根，其中，T3的CADs收益率最高；添加40 g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基比其他培養(yǎng)基更適于生產(chǎn)CADs，在最佳培養(yǎng)條件下，這3個化合物的總含量達到105.58mg/g，總收率為234.40mg/100mL[17]。

觀察了甜菊經(jīng)脯氨酸和聚乙二醇（PEG）處理其愈傷組織和懸浮培養(yǎng)SGs的產(chǎn)量增加情況。為研究其效果，從甜菊葉片獲得黃綠色緊湊的愈傷組織，在MS培養(yǎng)基上添加2.0mg/L NAA和不同濃度的脯氨酸（2.5～10mm）與PEG（2.5%～10%），在24±1℃和22.4μmol/（m2·s）的光強度（白色熒光管16 h）進行繼代培養(yǎng)2周。結(jié)果在5mM脯氨酸和5%PEG的濃度，愈傷組織和懸浮培養(yǎng)生物量（即新鮮和干重含量）增加了，如果繼續(xù)增加濃度，它們卻降低了。在用誘導子處理/不處理兩種情況下對愈傷組織（第15天收集）和懸浮培養(yǎng)（第10和15天收集）的SGs含量進一步做HPLC分析，觀察到化學作用顯著增強了SGs的生產(chǎn)。在添加7.5mm脯氨酸和5%PEG時，愈傷組織SGs含量分別從0.27%（對照）增加到1.09%和1.83%，約是對照的4.0和7.0倍。然而，在懸浮培養(yǎng)的情況下，相同的脯氨酸和PEG濃度使SGs含量在第10天分別從1.36（對照）增加到5.03%和6.38%，是對照的3.7倍和4.7倍[18]。

甜菊產(chǎn)物半日花烷型二萜也可由SGs分離出來，然而，在葉片組織中，其生物合成途徑和空間分布還不清楚。組織特異化學分析表明SGs累積在葉片細胞中而不是表皮毛中；甜菊表皮毛中含有半日花烷型二萜，如氧代淚柏醚、樹脂中含貝殼杉醇酸。系統(tǒng)發(fā)育和基因表達分析明確了特定基因在2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸編碼酶和甜菊醇或其它半日花烷型二萜的生物合成。此外，RNA序列分析揭示了柯巴基焦磷酸合酶（CPPS）、貝殼杉烯合酶1（KS1）同系物；柯巴基焦磷酸合酶2（CPPS2）和類貝殼杉烯合酶（KSL）在表皮毛中表達；體外和植株內(nèi)測定表明CPPS和KS1是不同的；CPPS2依次催化KSL組合中的淚柏醚和上淚柏醚。結(jié)論表明，甜菊葉片組織進化到使用不同的代謝途徑以避免代謝干擾來產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物[19]。

接種叢枝菌根真菌（AMF）建立和增強SGs生產(chǎn)，比較了在SGs生物合成途徑的3個階段11個關鍵基因的轉(zhuǎn)錄資料。轉(zhuǎn)錄分析顯示菌根（M）植物的基因編碼2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑酶，即1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸-羥酸還原異構(gòu)酶（DXR）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-焦環(huán)磷酸合成酶（MDS）的負轉(zhuǎn)錄調(diào)控。鋅和錳對MDS的表達是必需的，提高M植物的吸收可能會增強MDS的轉(zhuǎn)錄。在第二階段的SGs生物合成途徑，菌根化增強了CPPS和異貝殼杉烯酸羥化酶（KAH）的轉(zhuǎn)錄，這個表達對SGs的生物合成是決定性的，CPPS調(diào)節(jié)對異貝殼杉烯前體的合成前體代謝流量，KAH指導這些甜菊醇代替赤霉素合成。第三階段，通過4個特定的尿苷二磷酸 （UDP）依賴糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）指令使甜菊醇葡糖基化為Reb A。M植株3個特異的UGTs更高的轉(zhuǎn)錄水平可以解釋SGs增強生產(chǎn)，同時UGT76G1轉(zhuǎn)錄水平就越高，尤其Reb A/St比率提高，可以使甜味增加。此研究表明AM共生上調(diào)了所有SGs生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，由于增強了M植物的光合作用致使營養(yǎng)改善和糖濃度增加[20]。

植物生長和次生代謝通常由外部因素如光、溫度和水來調(diào)節(jié)。測定了高低溫、脫水、光周期、不同生長階段的變化對甜菊的SGs含量和15個參與SGs生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，所有15個基因的轉(zhuǎn)錄水平在低于25℃處理下達最大，在低溫（15℃）和高溫（35℃）下，SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄受到抑制。大多數(shù)基因在SGs生物合成途徑呈現(xiàn)脫水下調(diào)。在生長階段，SGs的含量有明顯的變化，在快速生長時期15個基因的轉(zhuǎn)錄水平是最小的，在現(xiàn)蕾階段和開花階段表現(xiàn)出明顯的增加。結(jié)果說明，環(huán)境因素對SGs含量的影響和相應的生物合成基因的轉(zhuǎn)錄是顯著的，值得深入研究[21]。

miRNAs正在成為潛在的基因表達的調(diào)節(jié)器，在調(diào)節(jié)相關基因網(wǎng)絡的生物合成途徑起重要作用，掌握這些途徑基因調(diào)控的關鍵，可能協(xié)助選擇和操縱得到高效植物基因型（含有更好的次生代謝物產(chǎn)量和增加生物量）。miRNAs與SGs生物合成途徑的基因有關，卻沒有被識別。本研究中，SGs生物合成途徑的目標miRNAs基因首次被識別，其前體可能由來自甜菊的ESTs和核苷酸序列產(chǎn)生，調(diào)查證明了所有的miRNAs在3個組織：葉、花和莖的表達不同。11個miRNAs驗證中，9個miRNAs（miR319a、miR319b、miR319c、miR319d、miR319e、miR319f、miR319h、miRstv_7、miRstv_9）的表達水平是反相關，而miR319g和miRstv_11的表達水平除外，表明葉、花和莖中目標miRNAs的表達水平與SGs含量有直接關系。本研究可更好地理解SGs生物合成途徑，這些miRNAs進一步可以用來操縱這些代謝產(chǎn)物的生物合成以增強甜菊的含量和產(chǎn)量[22]。

測定了擬南芥（Arabidopsis thaliana）對甜菊SrKA13H（貝殼杉烯酸-13羥化酶）cDNA的異位表達。HPLC分析顯示了在兩個獨立的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系過度表達SrKA13H使甜菊醇含量（1～3μg/g DW）顯著增加。甜菊醇濃度檢測顯示，兩個轉(zhuǎn)基因品系的內(nèi)源性生物活性赤霉素（GA1和GA4）均減少，它們具有赤霉素缺乏突變體的表型相似性；減少內(nèi)源赤霉素含量出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因侏儒癥，外源GA3的應用可以拯救轉(zhuǎn)基因侏儒癥。在轉(zhuǎn)基因中下胚軸、叢生區(qū)和莖稈長都大大減少。花粉活力下降了，60%～80%的花粉萌發(fā)受阻，轉(zhuǎn)基因植株的種子產(chǎn)量降低了24%～48%。甜菊醇的外源性應用（0.2、0.5和0.2μg/mL）不影響花粉萌發(fā)率。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中甜菊醇的植株形成沒有變化[23]。

貝殼杉烯做為專用前體池負責SGs等天然甜味劑的合成。本研究中，為在大腸桿菌中生產(chǎn)貝殼杉烯，從甜菊中模塊化構(gòu)建和表達兩個貝殼杉烯基因編碼CPPS和貝殼杉烯合成酶（KS），稱為典型植物生產(chǎn)SGs。甜菊的CPPS和KS功能在不同的宿主大腸桿菌（E.coli）中表達。此外，為了提高大腸桿菌中貝殼杉烯的生產(chǎn)，通過測量貝殼杉烯的生產(chǎn)，比較了來自各種微生物和8株大腸桿菌 （E.coli）的6個香葉基焦磷酸合成酶（GGPPS）。貝殼杉烯最高產(chǎn)量大約41.1 mg/L，是大腸桿菌菌株MG1655共表達合成CPPS-KS模塊和來自類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）的GGPPS。經(jīng)大腸桿菌（E.coli）的類異戊二烯前體的3個關鍵酶[DXS、法呢基焦磷酸合酶（IspA）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）]的過度表達，貝殼杉烯生產(chǎn)進一步增加到179.6 mg/L。最后，在1 L含20 g/L甘油的生物反應器中通過培養(yǎng)大腸桿菌菌株MG1655共表達貝殼杉烯模塊、DXS、IDI和IspA，貝殼杉烯達到最高的滴定度（578 mg/L）時貝殼杉烯特定的收益率是143.5mg/g DW細胞[24]。

Napolitano JG等進行了數(shù)字核磁共振作為構(gòu)建塊，組裝SGs的1H指紋研究[25]。Sadeghi B等使用甜菊葉中提取物將金離子還原成納米粒子的可行性進行了研究[26]。金納米粒子具有不同的技術(shù)特性，如紫外可見光譜、紅外光譜、X射線衍射（XRD）、掃描電鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）。TEM實驗表明，這些納米粒子是球形和均勻分布，其大小為5～20nm；紅外光譜表明，金納米粒子攜帶功能化的生物分子，伯胺團（NH2）、羰基團、OH團和其他穩(wěn)定的功能團；X射線衍射模式顯示，金納米粒子的高純度及面心立方結(jié)構(gòu)大小為17nm；SEM表明形成了金納米粒子。

4 甜菊的營養(yǎng)與保健功能、食品開發(fā)及醫(yī)療作用

對健康白種人和亞洲人采用體外人糞便勻漿，對SGs的Reb A和Reb E的水解作用，以及由Stb至甜菊醇的代謝進行了評價。兩組測試中每種萊鮑迪苷的潛伏導致甜菊醇的快速水解。在24 h內(nèi)完成了0.2 mg/mL樣品的代謝，大多數(shù)發(fā)生在第一個16 h，與對照Reb A比較，Reb E代謝程度和比率沒有明顯的差異，含0.2 mg/mL的Reb A和Reb E水解樣品往往略超過0.2 mg/mL樣品。不管測試濃度如何，Reb A或Reb E在新陳代謝速度上沒有明顯的性別或種族差異。Reb E到甜菊醇水解的中間物Stb也迅速被分解。這些結(jié)果表明Reb E代謝為甜菊醇與Reb A的方式相同，SGs被代謝為甜菊醇（即Reb A）等數(shù)據(jù)說明了Reb E是安全的[27]。在進行的甜菊甜味劑消費和大學生的營養(yǎng)狀況的關系研究中，對4個智利大學的486個一年級大學生進行評估，對每個學生每周含有甜菊的食物和飲料進行測定。結(jié)果：69.8%的學生每周消費甜菊，攝入的甜菊81.2%為液態(tài)膳食，只有1.4%的學生超過了容許日攝入量（ADI），正常體重女性比肥胖或超重者顯示更高的甜菊攝入量。最后，甜菊消費與正常體重第一個模型和第二模型呈正相關。結(jié)論：甜菊消費與智利大學生正常營養(yǎng)狀況呈正相關[28]。

小麥功能面包中的蔗糖由不同水平的甜菊提取物替代，與傳統(tǒng)的小麥面包進行相比。通過α-淀粉酶和α-葡糖苷酶測定得知葡萄糖的攝入明顯減少了，其IC50分別為198.40 μg/mL和596.77 μg/mL，自由基清除能力表明IC50=335.94 mg/mL。與對照組相比，在保質(zhì)期甜菊提取物的面包是柔軟的，并且微生物生長較低；感官試驗表明，甜菊提取替代50%時其質(zhì)量特征更容易被接受，甜菊提取物面包的膳食纖維含量較高，而消化的碳水化合物較低，因此熱量攝入明顯減少。結(jié)果表明，在面包的制作過程中甜菊提取物的生物屬性被保留，此種面包可能成為適合人類營養(yǎng)的功能性食品[29-30]。

植物浸劑有益于健康，是由于它們含有生物活性物質(zhì)。然而，這些物質(zhì)在加工和存儲過程中很容易被降解。洛神葵（Hibiscus sabdariffa L.）的多酚化合物的最佳提取條件是95℃/60min。甜菊的加入增強了該飲料存儲期間色彩和一些多酚的穩(wěn)定性，如槲皮素、沒食子酸和迷迭香酸。此外，甜菊降低了ABTS、DPPH活性和α-淀粉酶抑制能力，而檸檬酸卻沒有這個效果。這些結(jié)果可有助于改善低熱量和功能性飲料的工藝流程[31]。

甜菊葉中主要含有SGs，但也有重要的抗氧化物（維生素C、多酚類物質(zhì)、葉綠素及類胡蘿卜素）和其他重要大量和微量元素，如葉酸和所有的必需氨基酸（色氨酸除外）。今后需要獲得更環(huán)保、可持續(xù)和可行的過程導引食品行業(yè)和食品科學家開發(fā)新流程完全符合綠色開采的理念[32]。

通過ORAC和細胞抗氧化活性（CAA）化驗，葉子提取物抗氧化活性高于莖。與植物提取物相比，甜菊葉的主要甜味代謝物St和Reb A，表現(xiàn)出較低的ORAC，而沒有引起任何CAA，甜菊沒有表現(xiàn)出對人類細胞（肝癌細胞）HepG2的毒性，用這些提取物處理細胞，沒有觀察到細胞治療增生性和過氧化氫酶調(diào)節(jié)等。因此甜菊除了它的甜味，可以作為抗氧化劑的來源，甚至在胞內(nèi)水平起作用[33]。

甜菊葉片提取物無毒，其生物活性表現(xiàn)在與治療糖尿病、防齲齒、抗氧化、調(diào)節(jié)低血壓、降高血壓、抗菌、抗發(fā)炎、抗腫瘤等有關，預防和治療代謝紊亂[34-35]。

身體組織對胰島素不能完全響應與細胞膜胰島素受體有關，胰島素的捆綁到受體在靶細胞表面（增強細胞對葡萄糖的吸收）誘導使高親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運體分子增加。世界衛(wèi)生組織（WHO）專家委員會推薦的從植物源方面探討血糖過低的重要性，用于傳統(tǒng)醫(yī)學治療糖尿病。從甜菊中提取的St和二萜糖苷作為抗高血糖劑用于治療糖尿病已有幾十年。在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平和通過測量細胞葡萄糖吸收的體外細胞系研究，明確St和甜菊醇誘導葡萄糖吸收的功效。結(jié)果：經(jīng)qPCR測定GLUT4基因的絕對和相對量顯示，GLUT4轉(zhuǎn)錄活化發(fā)生在3T3-L1脂肪細胞和L6肌管的甜菊醇的較低濃度（1μM）和St的較高濃度（100μM）。在兩種細胞系中使用相同的甜菊醇濃度和St，GLUT4蛋白和葡萄糖吸收水平的增加說明：甜菊醇和St與胰島素在兩種細胞系控制血糖水平功能是相似的。換句話說，St和甜菊醇的擬胰島素特性是明顯的[36]。最近脂肪因子在糖尿病發(fā)病率的關系作用已被證實。用于治療糖尿病的藥用植物之一是甜菊。在被誘發(fā)糖尿病的大鼠作為新的脂肪細胞因子調(diào)查甜菊對血清網(wǎng)膜素和內(nèi)臟脂肪素水平的影響，找到潛在的甜菊的抗高血糖的影響機制。40個體重180～250g的雄性大鼠被腹腔注射鏈脲霉素（STZ）誘發(fā)患糖尿病，被分成5組，每組8只，第1組（非糖尿病對照）和第2組（糖尿病對照）用蒸餾水處理；在治療組，第3組（T250）、第4組（T500）和第5組（T750），每天上午9時分別喂食250、500和750mg/kg的甜菊。在研究結(jié)束時，第3組和第4組的空腹血糖（FBS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、甘油三酯（TG）、堿性磷酸酶（ALP）和網(wǎng)膜素比第2組顯著降低了，甜菊提取物沒有引起β細胞數(shù)量的增加。結(jié)論：250和500mg/（kg·d）的甜菊劑量對STZ誘發(fā)糖尿病的大鼠通過激活胰島素敏感性降低網(wǎng)膜素水平和血糖[37]。2型糖尿病、肥胖和肝臟疾病是密切交互影響的。對缺乏對待ob/ ob和雙重低密度脂蛋白受體（LDLR-double）的小鼠飼喂10mg/（kg·d）St、12mg/（kg·d）Reb A，或5mg/（kg·d）甜菊醇，測定其對肝脂肪變性和脂毒性代謝的影響。結(jié)果所有物質(zhì)減弱了肝脂肪變性，這可以解釋為改善了葡萄糖代謝、脂肪分解代謝、膽汁酸代謝和脂質(zhì)存儲與運輸。推斷：甜菊衍生物將肝脂肪變性降低到一定程序，肝臟毒性可通過一些病理生理變化而降低[38]。

甜菊醇葡糖苷酸（Steviol glucuronide，SVG）是來自甜菊醇、St和Reb A的糖苷配基的主要代謝物，當攝入St和Reb A后，生成SVG被排泄到尿液中。結(jié)果表明，SVG不是流出轉(zhuǎn)運體BCRP、MRP2、MATE1或P-gp的基質(zhì)，與OATP1B1、OATP1B3或OATP2B1相比，有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白3（OAT3）在SVG吸收中起重要作用。槲皮素、替米沙坦、雙氯芬酸和桑皮黃素抑制OAT3調(diào)解IC50值為1.8、2.9、8.0和10.0μM的SVG的吸收。因為OAT3是腎的主要吸收轉(zhuǎn)運體，使用藥物和甜菊葉提取物使OAT3活動受到抑制可能改變SVG的腎清除[39]。

研究了SGs及其第一階段的一些代謝物在癲癇動物模擬最大電休克發(fā)作（MES）測試中作為潛在的抗驚厥癲癇劑是有效的，證實存在劑量依賴性抗驚厥的作用。分離出的St和Reb A用于MES測試，表現(xiàn)為陽性。說明了在食物成分和天然產(chǎn)品中找到新的功能和治療適應癥的可能性[40]。

5 外界環(huán)境因素對甜菊的影響

SGs和GA3有共同的生物合成途徑。對外源GA3和丁酰肼（赤霉素抑制劑）對甜菊生長和代謝產(chǎn)物的影響進行試驗。結(jié)果表明，GA3顯著增加甜菊的莖長度和莖干重，外源GA3施用在甜菊葉，使甜菊總可溶性糖含量增加而SGs生物合成減少。在另一項試驗中，丁酰肼噴施于甜菊嫩枝，其莖稈長度減少了，丁酰肼在30× 10-4%濃度不影響總SGs含量，顯著增加甜菊葉可溶性糖產(chǎn)量。雖然甜菊的赤霉素生物合成途徑最初是旺盛的，但是外部GA3對甜菊內(nèi)部赤霉素的生物合成有高精度調(diào)節(jié)作用，說明甜菊能夠使內(nèi)源赤霉素保持在低數(shù)量而不影響SGs的生產(chǎn)。此外，假設甜菊葉內(nèi)部赤霉素被丁酰肼破壞，丁酰肼不足對SGs產(chǎn)量的影響中赤霉素生物合成不是主競爭因子[41]。用120個甜菊葉樣本研究了農(nóng)業(yè)措施中生長光化異構(gòu)化的相關性，測定了葉樣品的綠原酸順式反式比率、氣候和收獲的相關性，結(jié)果顯示順式咖啡酰氧基衍生品和收獲前日曬時間有明顯的相關性，說明適當?shù)淖贤饩€照射植株影響其植物的化學成分[42]。

甜菊在發(fā)育階段對低溫敏感，寒冷脅迫與用內(nèi)源性信號組件預處理，特別是水楊酸、過氧化氫、6-芐氨基嘌呤和氯化鈣處理可以誘導對寒冷的耐受性[43]。在露天盆栽條件下，測試5個施N量和3次收獲對甜菊葉黃酮類成分和抗氧化性的影響。結(jié)果表明，在適量施N和適當?shù)氖斋@時間，可以顯著提高和優(yōu)化生物活性物質(zhì)的水平，特別測定了150kg/hm2N的高Reb A/St比、總酚類和黃酮類化合物、木樨草苷、芹菜甙元水平和抗氧化能力；與150kg/hm2N比，減少或增加N量對甜菊化學物質(zhì)含量均沒有影響。St和黃酮類化合物之間存在顯著的相關性，表明黃酮類在St代謝途徑可能起作用，有待深入研究[44]。研究了葉片N濃度、CO2同化、葉片產(chǎn)量和SGs之間的關系。兩個基因型在生長室（CC：控制條件），在溫室（SCC：半控制條件）和大田條件（FC）進行了連續(xù)試驗。在CC和SCC下，應用3個施N水平；FC試驗，植物被種植在4個地點。結(jié)果N供應（CC和SCC）和地點（FC）對葉片N含量有顯著的影響；當光不限制（SCC和FC）葉片N含量時，CO2同化速率與生物量積累呈正相關；不考慮生長條件，葉片N含量與SGs含量呈負相關。然而，增加SGs含量與Reb A/St的比率下降相關。表明，增加SGs積累對生物質(zhì)生產(chǎn)有負面影響，建議要提高植株SGs的生產(chǎn)力要相對減少施肥[45]。植物營養(yǎng)和氣候條件對甜菊的生長和次生代謝物起重要作用；然而，營養(yǎng)劑受生長地區(qū)土壤性質(zhì)和氣候條件強烈的影響。在印度北部進行了三水平氮、二水平磷和三水平鉀的田間試驗，結(jié)果：主成分分析（PCA）表明：根據(jù)CSIR-IHBT（科學和工業(yè)研究理事會-喜馬拉雅生物資源技術(shù)研究所）和RHRS（地區(qū)園藝研究站）地區(qū)的干燥葉產(chǎn)量，確定每公頃90kg N、40kg P2O5和40kg K2O是最好的農(nóng)業(yè)營養(yǎng)條件；空間變異性對葉產(chǎn)量和St含量也有相當大的影響。在3個地方，CSIR-IHBT最適合于干葉產(chǎn)量和葉中次生代謝產(chǎn)物積累。表明干燥葉產(chǎn)量和St的積累受控于環(huán)境因素和農(nóng)藝管理；而Reb A的積累受這兩個因素的影響不大。因此，甜菊葉產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物可以通過選擇適當?shù)纳L地和適當?shù)臓I養(yǎng)管理得到改善[46]。

為了解內(nèi)生細菌、植物生長、葉面噴施富啡酸之間的相互作用，從不同生長階段的甜菊葉（富啡酸和無富啡酸兩種處理）提取宏基因組DNA，甜菊葉內(nèi)生細菌的多樣性通過16S rRNA基因的焦磷酸測序估算。結(jié)果，不管何生長階段和是否有富啡酸應用， 變形菌 （Proteobacteria）、 放線菌 （Actinobacteria）、 擬桿菌（Bacteroidetes）和厚壁菌（Firmicutes）是占主導地位的菌群。甜菊生長階段強力調(diào)控內(nèi)寄生菌群的成分。在苗期農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、歐文氏菌（Erwinia）占主導，分別達12.3%和7.2%，在繁茂期和始花期卻明顯下降，而在收獲季節(jié)成熟葉中鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）和甲基桿菌屬（Methylobacterium）增加了，二者構(gòu)成核心內(nèi)生菌群的重要組成部分，分別與St含量和UGT74G1基因表達呈正相關；而歐文氏菌、農(nóng)桿菌屬和芽孢桿菌屬與St積累呈負相關。富啡酸處理加速了生長階段內(nèi)生菌的變化和增加了SGs含量[47]。

6 甜味及其改良

通過構(gòu)造人類甜味受體的同源模型T1R2和T1R3子單元，來對接研究甜菊天然甜味劑。SGs的對接結(jié)果，與文獻中可用的數(shù)據(jù)顯著相關，能預測SGs精確的甜味等級次序。綁定模式表明，T1R2的主要氨基酸殘基：天冬酰胺44、天冬酰胺52、丙氨酸345、脯氨酸343、異亮氨酸352、甘氨酸346、甘氨酸47、丙氨酸354、絲氨酸336、蘇氨酸326和絲氨酸329，與T1R3的主要氨基酸殘基：精氨酸56、谷氨酸105、天冬氨酸215、天冬氨酸216、谷氨酸148、天冬氨酸258、賴氨酸255、絲氨酸104、谷氨酸217、亮氨酸51和精氨酸52，分別相互影響。氨基酸與SGs的相互作用主要是通過與葡萄糖的羥基團形成氫鍵。在SGs所有的對接構(gòu)成中發(fā)現(xiàn)顯著的變化，各種SGs不同的捆綁模式及其結(jié)構(gòu)特點形成多個點的刺激模型，這就是SGs的甜味機制。使我們進一步認識了解味道的差異，使用半合成的辦法改善SGs的味道[48]。

研究了高效酶改性體系提高St的口味質(zhì)量。環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶 （CGTase）產(chǎn)生的類芽孢桿菌（Paenibacillus sp）菌株CGMCC5316，是從甜菊種植土壤中分離出來的。以淀粉為糖基供體，CGTase可以將St轉(zhuǎn)化為一個特殊產(chǎn)物——Reb A的異構(gòu)體 （可由單糖基化St識別），St的味道明顯地被生成的單糖基化St改善了，具有類似蔗糖品味，其甜味顯著增加了35.4%。對影響CGTase的因素進行優(yōu)化后，與初始條件相比，在3.9 g/L淀粉、17.9 g/L胰蛋白胨和67.6 h培養(yǎng)時間的最優(yōu)條件下，優(yōu)化后的CGTase活性增加了214.7%，St的轉(zhuǎn)糖基作用速率顯著提高了284.8%，達到了85.6%。這個CGTase修飾系統(tǒng)為改善甜味和St的口味質(zhì)量提供了一種很有前途的解決方案，CGTase轉(zhuǎn)化效率可極大提高Paenibacillus sp.CGMCC 5316培養(yǎng)條件的優(yōu)化[49]。

Reb A具有理想的甜味，而St產(chǎn)生殘余苦味。從St到Reb A的酶合成能增加SGs中Reb A/St比率。通過甜菊的UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的蔗糖合成酶AtSUS1活性重組，證明St到Reb A的高效轉(zhuǎn)化。通過AtSUS1使得UDP-葡萄糖再生發(fā)生了轉(zhuǎn)化。UDP是UDP-葡萄糖的初始物執(zhí)行UDP-葡萄糖再循環(huán)，在反應混合物中UDP的數(shù)量可以大大降低。在2.4mM St，7.2mM蔗糖，0.006mM UDP條件下30 h，Reb A的產(chǎn)量是78%[50]。Reb A是合適的滿足消費者需求的甜味劑，但在高濃下有不良的口味。研究中，創(chuàng)建一個模擬飲料（冰紅茶），將含有20%和40%蔗糖樣品由Reb A替代，來確定消費者所能接受的最佳感覺。結(jié)果分別顯示非常相似的感覺，但與冰紅茶相比有明顯高的一些風味屬性，如人造甜味，類似甘草和金屬味，以及甜苦的余味，與對照比含有Reb A的樣品受到偏愛和接納。鑒于此研究結(jié)果，用Reb A替代20%或40%蔗糖的冰紅茶是切實可行的[51]。

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Review of Foreign Stevia Research in 2015

LIU Na1,2,LI Hong-xia1,2,ZHANG Wen-bin1,HU Xiao-hang1,2,3*
(1.Institute for Crop Research，Heilongjiang University/Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China；2.The Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080,China;3.Laboratory of Quality＆Safety Risk Assessment for Sugar Crops Products(Harbin),Ministry of Agriculture,P.R China,Harbin 150080)

The research progress abroad of Stevia and its extractive in the English literature in 2015 was reviewed,so as to provide the references for the research and development of Stevia in China.

Stevia;extractive;stevioside;rebaudioside;review

S566.9

B

1007－2624（2017）01－0057－08

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.019

2016-06-05

劉 娜（1974-），女，黑龍江通河人，助理研究員，主要從事甜菜生理學和栽培學研究。E-mail：ln5-8@163.com

胡曉航（1980-），女，黑龍江省哈爾濱人，助理研究員，博士，從事糖料產(chǎn)品風險評估研究，Email：hxhlmz@163.com