劉 華，李 芳，張 坤，肖東杰，汪運(yùn)山

（1山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，2山東省移植與組織工程研究中心，山東濟(jì)南250013）

新生兒缺氧缺血性腦病的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀

劉 華1，2，李 芳1，2，張 坤1，2，肖東杰1，2，汪運(yùn)山1，2

（1山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，2山東省移植與組織工程研究中心，山東濟(jì)南250013）

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是由圍產(chǎn)期缺氧所致的顱腦損傷，是導(dǎo)致新生兒死亡的主要原因之一，目前還沒有很好的治療措施.因此，了解該病的發(fā)病機(jī)制，有助于促進(jìn)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床轉(zhuǎn)化.本文總結(jié)了HIE發(fā)病病因、病理生理機(jī)制，結(jié)合最新的研究現(xiàn)狀，深入探討HIE潛在的治療靶點(diǎn)及目前研究的局限性，為制定新的研究方案指明方向，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床轉(zhuǎn)化搭建橋梁.

新生兒；缺氧缺血性腦?。话悬c(diǎn)

0 引言

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是圍生期由于各種因素引起的新生兒部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停所致的腦組織病變表現(xiàn).HIE是影響新生兒神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致新生兒死亡的主要原因之一.在全球范圍內(nèi)，HIE發(fā)病率約為1／1000～8／1000，在發(fā)展中國家高達(dá)26／1000，其中新生兒期死亡率為20%～25%，存活患兒約25%伴有永久性神經(jīng)系統(tǒng)缺陷［1］.HIE輕癥患者在學(xué)齡期有正常的認(rèn)知能力，而中重度的HIE患者則伴有遠(yuǎn)期后遺癥及運(yùn)動(dòng)認(rèn)知障礙.

目前還沒有針對(duì)新生兒HIE建立有效治療措施.低溫治療是治療新生兒中重度HIE常用保護(hù)方法.除了低溫治療以外，還需要全面的臨床護(hù)理如機(jī)械通氣、生理生化指標(biāo)監(jiān)控、神經(jīng)影像學(xué)檢查、癲癇檢測(cè)和監(jiān)控、神經(jīng)系統(tǒng)的檢查等.雖然低溫治療是目前臨床研究中證實(shí)有效的治療措施，但40%的HIE新生兒患者治療后仍存在神經(jīng)系統(tǒng)缺陷［2］.由于HIE損傷的病理生理機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，因此深入了解新生兒HIE發(fā)病機(jī)理，有助于找到新的潛在的干預(yù)靶點(diǎn)以阻止細(xì)胞損傷.本文將會(huì)介紹HIE的發(fā)病原因、病理機(jī)制及研究現(xiàn)狀，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床轉(zhuǎn)化搭建橋梁，為治療HIE提供新的思路.

1 發(fā)病原因

1.1 缺氧①圍生期窒息:包括產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)和產(chǎn)后窒息，胎盤／臍帶功能異常，異常分娩，子宮破裂，胎兒發(fā)育異常等；②呼吸暫停；③嚴(yán)重肺部感染:新生兒有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病.

1.2 缺血①嚴(yán)重循環(huán)系統(tǒng)疾病:如心臟驟停，心動(dòng)過緩，重度心力衰竭，嚴(yán)重的先天性心臟病等；②大量失血或休克；③嚴(yán)重顱內(nèi)疾病:如顱內(nèi)出血或腦水腫等.

在HIE病因中圍生期窒息是導(dǎo)致本病的主要原因，產(chǎn)前和產(chǎn)時(shí)窒息各占50%和40%，其他原因共占10%.

2 病理生理機(jī)制

新生兒HIE損傷是個(gè)逐漸發(fā)展的過程，可以分為以下三個(gè)階段［3］:

第一階段是血流改變，原發(fā)性能量受損階段.新生兒窒息胎盤血流中斷，體循環(huán)動(dòng)脈壓降低，腦血流量減少，機(jī)體自我調(diào)節(jié)機(jī)制受損，葡萄糖氧化磷酸化不能進(jìn)行，細(xì)胞的能量代謝變?yōu)闊o氧代謝，從而導(dǎo)致乳酸堆積、ATP耗竭、興奮性氨基酸釋放、Na+、Ca2+內(nèi)流增加、細(xì)胞水腫，組織缺血壞死.細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加將會(huì)導(dǎo)致膜電位去極化和脂肪酸的釋放.神經(jīng)元型一氧化碳合酶激活導(dǎo)致自由基堆積和線粒體功能障礙.線粒體功能障礙最終激活細(xì)胞凋亡或壞死信號(hào)通路.

第二階段缺血再灌注，又稱為“潛伏期”.窒息復(fù)蘇后，腦血流恢復(fù)，磷酸激酶和ATP部分恢復(fù)，細(xì)胞水腫暫時(shí)消退.而在缺血缺氧后的6～48 h再次發(fā)生能量衰竭，興奮性毒性、氧化應(yīng)激及線粒體損傷等繼續(xù)發(fā)展，此階段不依賴腦組織酸中毒，所以和第一階段有所不同.

第三階段慢性炎癥階段.此階段在整個(gè)疾病過程中最為關(guān)鍵，該階段一旦啟動(dòng)，則會(huì)引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)生化反應(yīng).小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后會(huì)釋放炎性因子以及其他有害物質(zhì)，誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，最終引起表觀遺傳學(xué)改變，抑制軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)及突觸的形成.

因此，HIE早期治療的目的為減輕興奮毒性、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，而后期治療以減輕炎性因子釋放，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)為治療重點(diǎn).其中第二階段缺血再灌注階段已證實(shí)是減輕腦損傷的最佳治療時(shí)間窗［4］，而目前在國內(nèi)的臨床治療中尚未被重視.

3 潛在干預(yù)靶點(diǎn)

3.1 血腦屏障血腦屏障包括基膜、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞［5］.血腦屏障的每個(gè)組成部分在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定和功能中發(fā)揮重要作用.HIE發(fā)生后血腦屏障受損會(huì)嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能.Kumar等［6］在分析比較43例HIE新生兒患者與20例健康新生兒腦脊液及血漿白蛋白表達(dá)水平中，發(fā)現(xiàn)HIE患者腦脊液白蛋白水平高出正常新生兒5倍，而血漿中白蛋白兩者沒有明顯差異，這提示HIE損傷后血腦屏障的通透性發(fā)生改變.

有研究認(rèn)為HIE損傷后血腦屏障的開啟經(jīng)過兩個(gè)短暫階段.第一階段在缺氧缺血后數(shù)小時(shí)之內(nèi)發(fā)生，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）參與此階段［7-8］；6～24 h后進(jìn)入第二階段，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)MMP、環(huán)氧酶觸發(fā)蛋白酶的破壞以及氧化應(yīng)激反應(yīng)（reactive oxygen specise，ROS）的發(fā)生.血腦屏障一旦破壞，血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞會(huì)侵潤到腦組織中加重病情［9］.

目前研究表明HIE損傷后，通過維持血腦屏障的穩(wěn)定性和減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生可以減輕腦損傷.Li等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)在新生鼠HIE模型中，粒系集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）一方面通過抑制炎性因子TNF-α，IL-1β，及IL-12表達(dá)，上調(diào)抑炎因子IL-10，減輕腦水腫及神經(jīng)炎性反應(yīng)，另一方面通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子VCAM-1，ICAM-1，上調(diào)緊密連接蛋白Claudins3、5表達(dá)來穩(wěn)定血腦屏障的，從而發(fā)揮治療作用.Yang等［11］在新生大鼠HIE模型中，纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibirtor-1，PAI-1）通過抑制組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA），從而抑制MMP的活化，阻止HIE-tPA誘導(dǎo)的血腦屏障通透性增加，發(fā)揮治療HIE的作用.

關(guān)于HIE損傷后血腦屏障的改變國內(nèi)外學(xué)者已做了大量研究，但關(guān)于血腦屏障通透性改變的具體病理生理機(jī)制仍需要更多深入細(xì)致的研究.有研究表明內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧更加敏感，星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞對(duì)缺氧相對(duì)耐受［12］.因此進(jìn)一步了解血腦屏障各組成部分之間的相互作用，有助于找到治療HIE的新方法.

3.2 血管生成血管生成即血液進(jìn)入無血管區(qū)域形成新的血管過程.血管生成是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，一般包括血管基底膜的形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移，遷移細(xì)胞的管形形成.有研究發(fā)現(xiàn)新生兒HIE大腦急性損傷后第一個(gè)月，激活新生血管生成［13］.Shaikh等［14］利用低溫治療發(fā)生窒息的新生兒，結(jié)果顯示與正常健康新生兒相比，沒有腦損傷的窒息新生兒上調(diào)促血管形成蛋白，如脂肪酸結(jié)合蛋白4，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，神經(jīng)菌毛素1，受體酪氨酸蛋白激酶erbB-3，而發(fā)生腦損傷的窒息新生兒則下調(diào)表達(dá)抗血管形成蛋白，如胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1，4，6.因此Shaikh等提出不能上調(diào)促血管形成蛋白的新生兒更易發(fā)生腦損傷，作為代償，患兒將啟動(dòng)下調(diào)抗血管形成蛋白機(jī)制.由此可以看出促血管形成可作為出生窒息后是否發(fā)生腦損傷的重要決定因素.

血管生成可以作為新生兒HIE一個(gè)新的治療靶點(diǎn).然而新生兒HIE損傷發(fā)生后，如何激活血管生成，對(duì)尋找新的治療策略提高腦損傷后功能及結(jié)構(gòu)的恢復(fù)至關(guān)重要.Shaikh等利用磁共振成像技術(shù)（magnetic resonance imaging，MRI）檢測(cè)新生兒窒息后腦血流變化，發(fā)現(xiàn)HIE損傷后一個(gè)月大腦高灌注激活血管生成.Pimentel-Coelh等［15］也表明移植臍血來源的CD34+細(xì)胞，通過誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)損傷修復(fù).綜上所述，新血管生成對(duì)提高患兒生存率至關(guān)重要，將成為治療HIE的潛在新靶點(diǎn)［16］.

3.3 神經(jīng)再生神經(jīng)再生包括神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移和分化.神經(jīng)再生可持續(xù)存在，并貫穿到成人期.神經(jīng)再生多發(fā)生在腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層，這些區(qū)域的微環(huán)境調(diào)節(jié)神經(jīng)再生的發(fā)生［17］.有研究表明HIE腦損傷可促進(jìn)神經(jīng)再生，但這一內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制仍然不能阻止腦損傷的發(fā)生［18］.Ong等［19］發(fā)現(xiàn)，HIE損傷后1～3周內(nèi)同側(cè)腦室下區(qū)免疫組化染色，未成熟神經(jīng)元微管蛋白（Doublecortin，DCX）表達(dá)增加.然而，4周以后卻檢測(cè)不到新生的成熟神經(jīng)元，這表明在HIE病理狀態(tài)下，不利于新生神經(jīng)元的存活和成熟.如何提高內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)神經(jīng)再生都將成為研究的熱點(diǎn).

大量研究發(fā)現(xiàn)外源性干細(xì)胞移植也能促進(jìn)損傷后的神經(jīng)再生.例如Zhang等［20］及van Velthoven等［21］研究證實(shí)在HIE動(dòng)物模型中，臍帶／骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以明顯促進(jìn)神經(jīng)再生和少突膠質(zhì)細(xì)胞的形成.因此研究生理及病理?xiàng)l件下影響神經(jīng)再生的各種因素，有助于找到新的治療靶點(diǎn).

3.4 自噬HIE損傷后不同的細(xì)胞有不同的死亡機(jī)制.自噬是近年來引起科學(xué)界關(guān)注的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，將其定義為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，有望成為一種新的治療靶點(diǎn).自噬發(fā)生需要眾多分子的參與，其發(fā)生過程分為啟動(dòng)、延長(zhǎng)、成熟、裂解4個(gè)階段.研究報(bào)道表明，自噬在疾病的不同時(shí)期，起到不同的作用.適量的自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)受損、變性的蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞器，并產(chǎn)生氨基酸、核苷酸供細(xì)胞循環(huán)利用.自噬的持續(xù)活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、細(xì)胞器大量降解，細(xì)胞無法維持基本功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死的發(fā)生.

目前關(guān)于HIE損傷后自噬所起的作用尚存在爭(zhēng)議.Balduini等［22］研究發(fā)現(xiàn)在新生鼠HIE早期，凋亡自噬同時(shí)增加，神經(jīng)保護(hù)藥物促進(jìn)自噬的發(fā)生，而抑制自噬可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞從凋亡向壞死轉(zhuǎn)化.Chen等［23］發(fā)現(xiàn)濃度為50～200 ng／mL的腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在體外通過誘導(dǎo)自噬保護(hù)缺氧后受損的神經(jīng)元.BDNF通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬.活化的mTOR復(fù)合物1可以引起蛋白翻譯調(diào)控因子p70S6K的磷酸化，最終可以誘導(dǎo)自噬，起到神經(jīng)保護(hù)作用.而Zhou等［24］在小鼠局造性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，N-乙酰血清素通過抑制線粒體細(xì)胞凋亡途徑及細(xì)胞自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.

自噬是一個(gè)復(fù)雜的過程，因此自噬在HIE發(fā)生或治療作用中是起到神經(jīng)保護(hù)作用還是損傷作用主要取決于自噬發(fā)生的部位、損傷的嚴(yán)重程度以及激活的時(shí)間.過去的十年中自噬作用越來越受到重視，但是自噬的作用機(jī)制尤其是神經(jīng)損傷后的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究.

4 研究現(xiàn)狀的局限

4.1 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的局限一般來說，實(shí)驗(yàn)研究包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn).因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單易行，所以大部分實(shí)驗(yàn)從體外實(shí)驗(yàn)開始.但體外實(shí)驗(yàn)脫離了細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境，存在一定的限制和不足，所以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證必不可少.如果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)，那結(jié)果會(huì)很有意義.大多數(shù)情況下，藥物臨床實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)有效，而動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)無效.究其原因，可能與給藥途徑、藥物毒性以及給藥過程中存在的問題有關(guān)［25］.盡管一些研究證明動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)價(jià)值不大，但在藥物應(yīng)用到臨床之前這些實(shí)驗(yàn)是必需的.

4.2 動(dòng)物模型的局限HIE和新生兒中風(fēng)都是一個(gè)復(fù)雜的疾病，因此尋找適宜的動(dòng)物模型，建立完善的大腦損傷后神經(jīng)發(fā)育和行為學(xué)評(píng)價(jià)系統(tǒng)仍是一項(xiàng)艱巨的任務(wù).Ashwal等［26］用MRI方法比較了rice-vannucci法HIE模型和線栓法新生兒中風(fēng)模型，發(fā)現(xiàn)中風(fēng)的損傷區(qū)域主要為身體同側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)，而HIE損傷會(huì)造成大腦皮層廣泛缺血，甚至對(duì)側(cè)也可能存在損傷.

最近又有人提出了新的新生兒HIE模型，如圍產(chǎn)期大鼠產(chǎn)時(shí)子宮外置，缺血缺氧20 min造成新生鼠大腦廣泛損傷［27］.另一個(gè)圍產(chǎn)期HIE模型則是通過切斷胎兒的胎盤血液供應(yīng)，模仿早產(chǎn)兒腦損傷［28］.產(chǎn)后永久性腦損傷模型則是用電凝法閉塞大腦中動(dòng)脈，造成一個(gè)高度可重復(fù)的、一致的、可選擇的皮質(zhì)梗死區(qū)［29］.

大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及新的實(shí)驗(yàn)方案出現(xiàn)提示選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)驗(yàn)證治療方案非常重要.在不同的動(dòng)物模型制備中HIE損傷的時(shí)間和性質(zhì)是關(guān)鍵因素.由于種族差異及神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)感覺運(yùn)動(dòng)皮層的反應(yīng)不同，從動(dòng)物研究到臨床應(yīng)用尚需要大量研究.由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物跟人的神經(jīng)系統(tǒng)相似，因此開展靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)十分有必要.而目前為止僅有一例圍產(chǎn)期靈長(zhǎng)類動(dòng)物的HIE模型［30］.盡管在動(dòng)物模型的研究中與人類的生物學(xué)特性越接近越好，但是目前95%以上的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是以大鼠和小鼠為研究對(duì)象.另外還有幾點(diǎn)需要注意:臨床癥狀與治療開始的延遲現(xiàn)象；動(dòng)物模型結(jié)果評(píng)價(jià)的短期性與臨床患者長(zhǎng)期療效評(píng)價(jià)的差距.

盡管在過去的幾十年中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但尋找可以充分模仿人類病理生理機(jī)制的動(dòng)物模型仍面臨巨大的挑戰(zhàn).

4.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥途徑的局限藥物如何通過血腦屏障進(jìn)入大腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥所面臨的挑戰(zhàn).在大多數(shù)研究中，研究者極少對(duì)藥物復(fù)合物通過血腦屏障作出預(yù)測(cè)與評(píng)估，這也極大地限制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥途徑的發(fā)展［31］.如果不能解決血腦屏障的問題，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物只能局限于脂溶性、小分子量的化合物［32］.分子神經(jīng)學(xué)的發(fā)展可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的研究方向.分子神經(jīng)學(xué)研究的重點(diǎn)集中在信號(hào)通路及其傳導(dǎo)機(jī)制，包括血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和大腦-腦脊液血流屏障.

最新研究顯示，新生大鼠HIE損傷后，緊密連接蛋白表達(dá)改變，出現(xiàn)快速短暫的血腦屏障損傷，并激活一些補(bǔ)償機(jī)制［33］.這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物早期進(jìn)入腦組織提供了良好的治療窗口.

4.4 新生兒用藥的局限新生兒處于生理和代謝過程迅速變化的階段，對(duì)藥物具有特殊的反應(yīng).兒童，尤其新生兒參與的藥物臨床試驗(yàn)一般都放在成人藥物臨床Ⅲ期之后才開始.新生兒由于臟器發(fā)育尚不成熟，酶系統(tǒng)尚不健全，所以給藥劑量、給藥途徑及給藥時(shí)間需要根據(jù)新生兒自身的情況及藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)個(gè)性化給藥［34］.只有這樣才能保證安全、有效的用藥，發(fā)揮最佳治療作用，減少毒副反應(yīng).而這無疑增加了新生兒藥物開發(fā)，臨床推廣應(yīng)用的成本.因此如何促進(jìn)新生兒藥物的開發(fā)，研制適合兒科的劑型、劑量對(duì)治療HIE具有重要的臨床意義.

綜上所述，HIE是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)綜合因素造成的病理生理損傷，這需要針對(duì)不同階段采用不同的治療方法.任何單一的治療措施都不能完全有效的阻斷疾病的進(jìn)展.針對(duì)HIE的治療措施都應(yīng)從“治療時(shí)間窗”，血腦屏障的通透性，促進(jìn)損傷部位的血管神經(jīng)再生，阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡，提高藥物治療的安全性、有效性等多個(gè)方面考慮，聯(lián)合治療必將成為HIE治療方向.

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R722.12

A

2095-6894（2017）01-72-04

2016-11-11；接受日期：2016-11-26

國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81200950）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GSF118173）；中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016M590637）

劉 華.博士，主管技師.研究方向:干細(xì)胞基礎(chǔ)研究及臨床轉(zhuǎn)化.Tel:0531-85695365 E-mail:liuhuagreen＠126.com

汪運(yùn)山.E-mail:sdjnwys＠163.com