楊 輝， 任雁宇

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

綠茶提取液納米Ag的制備及表征

楊 輝， 任雁宇

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

采用綠茶提取液制備AgNPs，借助UV-Vis跟蹤檢測反應(yīng)液中Ag+的還原和Ag單質(zhì)的生成過程；采用XRD、TEM對所得AgNPs進行組成、結(jié)構(gòu)和表面形貌進行表征；通過FTIR分析探索AgNPs表面化學作用情況;測定了綠茶提取液還原性，對綠茶提取液制備AgNPs的機理進行了分析；采用抑菌圈試驗驗證所得AgNPs的抗菌性.結(jié)果表明：綠茶提取液制備AgNPs快速、簡單，粒徑10～15 nm，大小分布均勻，結(jié)晶度高；并對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有較強的抑菌性能；綠茶萃取液具有很強的還原能力，易將Ag+還原成單質(zhì)銀，而其中所含的生物大分子則起到了分散劑的作用.

生物合成法； 納米Ag粒子； 綠茶提取液； 抑菌性能表征； 抗氧化

0 引言

納米Ag(Silver nanoparticles，AgNPs)具有尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和隧道效應(yīng)等特殊的性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化工、食品、紡織、電子、建材和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域[1,2]，納米Ag的制備方法有物理法、化學法、光催化法和生物合成法[3,4]，其中生物合成法因具有高效、快速、穩(wěn)定、簡單易行、環(huán)境友好、無毒及價格低廉等諸多優(yōu)點倍受人們關(guān)注和青睞[3,5].Vidhu V.K.等[6]用Macrotylomauniflorum提取液制備AgNPs；Ali M等[7]將Artemisia absinthium提取液與AgNO3按6∶4的體積比混合，反應(yīng)后得到5～20 nm的AgNPs，粒徑分布較寬；Ashokkumar S.等[8]用Tribulus terrestris提取液制備得到15～40 nm的AgNPs.此外，Murraya Koenigii[9]，Mangifera Indica[10]，Ziziphora tenuior[4]等植物提取液也被用來合成AgNPs粒子，研究了具體的合成過程，并對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了表征，以上研究得到的物尺寸不均勻，分散性較差，缺乏對提取液中的有效成分作用的研究.

因此，本文采用綠茶萃取液還原AgNO3制備AgNPs，采用UV-Vis、 XRD、TEM手段對AgNPs合成過程進行跟蹤監(jiān)測，對產(chǎn)物組成、結(jié)構(gòu)和表面形貌進行表征，通過FTIR分析探索AgNPs表面化學作用情況，采用抑菌圈試法檢驗所得AgNPs的抗菌性，測定綠茶提取液的還原性，對綠茶提取液制備AgNPs的機理進行分析.

1 實驗部分

1.1 綠茶萃取液的制備

稱取10 g綠茶放入裝有100 mL超純水的250 mL三角瓶中，80 ℃水浴30 min后，用10～15μm孔徑的定性濾紙過濾，冷卻，所得萃取液將作為還原劑和分散劑來制備納米Ag材料.

1. 2 AgNPs的制備

取4份20 mL綠茶萃取液分別與4份不同濃度100 mL AgNO3(5、10、20、50 mmol/L，AR，天津市科密歐化學試劑有限公司)溶液在室溫下混合，磁力攪拌10 min后，放入30 ℃的水浴中50 min.觀察發(fā)現(xiàn)混合溶液的顏色由淡黃色逐漸變?yōu)樯詈稚?份混合溶液還原反應(yīng)持續(xù)了40 min，繼續(xù)觀察至90 min，溶液顏色再無任何變化后，將所得膠體分別記為S1、S2、S3、S4，將這4份膠體溶液10 000 r/min高速離心10 min后，所得沉淀分別用95%的乙醇溶液和超純水清洗3～4次，然后在85 ℃下干燥8 h，得到AgNPs粉體.

1.3 綠茶萃取液總還原能力測定

將綠茶水提取液用乙酸乙酯萃取后，濃縮冷凍干燥，得到綠茶水提取物粉體，測定其對DPPH自由基的清除能力.用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存，Vc溶液作為對照.將樣品配制成不同濃度(0.2～2.0 mg/mL)的溶液.取2 mL、0.1 mmol/L的DPPH溶液分別加入不同濃度的2 mL綠茶提物溶液中，劇烈震蕩后室溫下反應(yīng)30 min，測定吸光度Ai，以乙醇作為空白對照組，自由基清除率按下式計算：

(1)

式(1)中：Ai為樣品溶液和DPPH試劑混合液吸光值；Aj為樣品溶液和空白溶劑混合液吸光值；Ac為DPPH試劑與空白溶劑吸光值.

1.4 AgNPs形成過程跟蹤及產(chǎn)物表征

反應(yīng)所得膠體溶液用紫外可見分光光度計(UV-vis,Unico Instrument,Shanghai)檢測跟蹤反應(yīng)體系中銀離子的還原和AgNPs的形成.所得AgNPs粉體采用X射線衍射(X-ray diffraction,XRD,D/max-2200PC,Rigaku)分析其晶體組成和結(jié)構(gòu)；借助透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM,FEI G2 F20 S-Twin,America)觀察其形貌及大小.

1.5 AgNPs抗菌性能表征

利用抑菌圈法檢驗AgNPs對大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)的抗抑菌性.用移液槍分別取活化培養(yǎng)后的E.coli和S.aureus各10μL，稀釋10倍后各取50μL注射到2個LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布器涂抹均勻后分別依次放入編號1～5直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片.1～5號濾紙片分別含有不同濃度的AgNPs (7.23×10-6，2.89×10-5，5.79×10-5，1.16×10-4，4.63×10-4mol/L).將兩個實驗平板放在37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈的直徑，以抑菌圈的直徑為標準來衡量AgNPs的抑菌性.

2 結(jié)果與討論

2.1 綠茶提取液還原性分析

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基，其溶液在517 nm處有很強的吸收.自由基清除劑能使DPPH自由基單電子配對，溶液的吸光度減小，所以DPPH自由基吸光值的變化能定量地衡量抗氧化劑對其清除能力的強弱[11,12]，這種強的清除自由基的能力可反映出提取液的強還原性.以Vc作為對照，測定綠茶水提取物溶液對DPPH自由基的清除能力.如圖1所示，當樣品溶液濃度小于0.2 mg/mL時，對DPPH自由基清除率小于25%，隨著樣品濃度的增加清除率逐漸增強，當樣品濃度增加到1.5 mg/mL后，清除率達到90%以上，并且逐漸趨于平穩(wěn).與Vc對DPPH自由基的清除率相比，綠茶水提取物對其清除率更強，這說明綠茶提取液的抗氧化能力很強，表現(xiàn)出強的還原性，可提高Ag+的還原率.

圖1 不同濃度的綠茶提取物溶液對 DPPH自由基清除率(以Vc作為對照)

2.2 AgNPs的UV-vis、TEM和XRD分析

2.2.1 AgNPs形成及形態(tài)分析

綠茶提取液與AgNO3溶液反應(yīng)中，膠體溶液S1，S2，S3和S4的顏色漸漸加深，這是由于AgNPs的表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)產(chǎn)生的，與塊體的單質(zhì)銀不同，微小顆粒的Ag粉對光的反射能力差，卻能吸收光線呈現(xiàn)黑色，反應(yīng)中出現(xiàn)黑色表明Ag+被還原為Ag.研究表明，當納米晶粒是球形或近似球形時，UV-vis的吸收峰只會出現(xiàn)單一的SPR共振帶，而各向異性顆粒根據(jù)它們的形狀會表現(xiàn)出兩個或三個SPR共振帶；且當SPR共振帶較寬時表明溶液中合成的AgNPs粒子粒徑分布較寬，反之亦然[6].

圖2(a)顯示：膠體溶液S1，S2，S3和S4在460 nm附近都有單一且顯著的吸收峰，且隨著AgNO3濃度的減小，UV-vis的吸收峰逐漸變窄，當AgNO3濃度為5 mmol/L時吸收峰較尖銳，因此，本文制備的AgNPs晶粒較小、分布均勻、且呈現(xiàn)球形或近似球形.圖2(b)表明：當AgNO3濃度為5 mmol/L時，混合溶液反應(yīng)進行到5 min時Ag+逐漸被還原為Ag單質(zhì)，當反應(yīng)進行到20 min時，反應(yīng)基本已經(jīng)完成，至40 min時，反應(yīng)幾乎沒有變化，表明前20 min反應(yīng)很快，此后，反應(yīng)物濃度逐漸減小，速度隨之慢慢降低.

(a)綠茶提取液與不同濃度的AgNO3反應(yīng)所得納米Ag膠體溶液的UV-Vis吸收峰

(b)綠茶提取液與AgNO3(5 mmol/L)混合溶液不同反應(yīng)時間段的UV-Vis跟蹤檢測吸收峰圖2 UV-Vis跟蹤檢測混合物反應(yīng)圖譜

2.2.2 AgNPs的XRD、TEM分析

圖3是所得AgNPs的TEM圖.圖3(a)表明所合成的納米Ag粒子粒徑均勻分散，呈球形和近似球形，粒徑尺寸10～15 nm；圖3(b)是高分辨率下的納米Ag粒子的TEM圖片，從圖中可以看到單個納米晶粒有明顯的晶格條紋，且晶格條紋之間的距離為0.23 nm，這與純凈納米Ag的面心距(0.235 nm)接近(JCPDS file No. 04-0783)[13]，這表明所合成的AgNPs高度結(jié)晶.

圖4為所得AgNPs晶體的XRD衍射圖譜.圖中五個吸收峰位置與純納米Ag的標準譜JCPDS file no.04-0873完全對應(yīng)，表明所得晶體為純納米Ag.以(111)晶面衍射參數(shù)采用Debye-Scherrer′s公式計算，AgNPs粒子平均尺寸為13.6 nm.這與XRD檢測結(jié)果與TEM結(jié)果一致.Sun Q等[14]和Babu S等[15]用綠茶提取液制備得到的納米Ag粒子尺寸分別處于20～90 nm和5～30 nm，都存在納米晶粒尺寸較大和分布不均勻等缺點.與之相比，本研究改變料液比、硝酸銀濃度、綠茶提取液與硝酸銀溶液混合比例，反應(yīng)溫度及其它條件后所制備的AgNPs晶粒尺寸更小且分布更均勻，粒子間分散且結(jié)晶度較高，說明本實驗條件更適合AgNPs合成.

(a)用綠茶提取液合成AgNPs的TEM圖片

(b)高分辨率下AgNPs的TEM圖片(由圖可得AgNPs的單個納米晶體晶格條紋間距是0.23 nm)圖3 TEM檢測所合成的AgNPs結(jié)果

圖4 所得納米Ag級粉體的XRD衍射圖譜

2.2.3 AgNPs與提取液中生物大分子作用分析

綠茶提取液中含有茶多酚、維生素、氨基酸等物質(zhì)，其中含有具有強的還原性羥基，使銀離子被還原成銀，而含有氨基、羰基的生物大分子從理論上分析能夠與銀和銀離子形成較強絡(luò)合作用，使得提取液中的生物大分子包裹在AgNPs顆粒表面，起到分散和保護作用[14].分散保護作用的實質(zhì)是納米Ag顆粒被生物大分子包裹其表面自由能降低，導致團聚過程在體系能量降低方面是不利的.因為體積相同的條件下球形具有最小的表面積，納米Ag顆粒呈球形有利于其處在低能量狀態(tài)，不易團聚，所以，合成的納米Ag粒子為穩(wěn)定分散的晶粒.

如圖5所示，F(xiàn)TIR分別檢測合成AgNPs前和反應(yīng)后的綠茶取液分別對應(yīng)圖中a、b兩條圖譜曲線.從圖5可以看到，a曲線在3 372.72 cm-1處有一個很強的吸收峰，這是由于酰胺基團中的N-H鍵伸縮振動引起的，b曲線中此峰吸收變?nèi)跚壹t移至3 390.48 cm-1，這是說明N-H鍵與銀離子發(fā)生絡(luò)合作用.a曲線在1 699.27 cm-1處是萃取液中黃酮類和酰胺類的C=O的伸縮振動吸收，在1 457.32和1 239.14 cm-1處的吸收是因為芳香族氨基團的C-N伸縮振動或者是-C-N的伸縮振動；b曲線在1 699.27 cm-1處吸收減弱，說明在反應(yīng)溶液中，C=O被氧化；在1 457.32和1 239.14 cm-1處的吸收紅移或消失，說明C-N或-C-N與銀離子發(fā)生絡(luò)合作用.a曲線在1 619.12和1 036.93 cm-1處分別是來自綠茶萃取液中蛋白質(zhì)、多酚的C-OH和烯烴中的C-H伸縮振動吸收峰；b曲線在1 616.09 cm-1處藍移至1 625.30 cm-1，說明烯烴可能發(fā)生取代反應(yīng)，電子誘導效應(yīng)導致的；在1 036.93 cm-1吸收峰消失，說明蛋白質(zhì)、多酚的C-OH被氧化[16].因此，F(xiàn)TIR分析表明在AgNPs合成過程中，綠茶萃取液中酰胺基團、氨基、羰基和多酚類化合物等起還原、分散和保護作用.也與參考文獻[9,14]的報道一致.

a：合成納米Ag前； b：合成納米Ag后圖5 FTIR分析檢測綠茶萃取液成分 在合成AgNPs前后的變化

2.3 AgNPs的抑菌性能表征

AgNPs的抑菌效果如圖6所示.1～5號濾紙片含有AgNPs的濃度分別為7.23×10-6,2.89×10-5,5.79×10-5,1.16×10-4,4.63×10-4mol/L.從圖6可知,隨著AgNPs溶液濃度的逐漸增大，其對E.coli和S.aureus的抑菌圈直徑明顯增大，在試驗范圍內(nèi)，對E.coli和S.aureus的最小抑菌濃度為7.23×10-6.納米Ag材料對E.coli和S.aureus的最大抑菌圈直徑分別是12.50 mm (圖6(a))和12.70 mm (圖6(b)).抑菌機理可能是AgNPs具有很小的半徑，吸附能力強，可與細胞組成中的磷脂、蛋白質(zhì)、DNA中官能團，如氨基、羰基、氧負離子、雙硫鍵等形成絡(luò)合作用，對細胞的破壞能力極強，所以AgNPs對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用.

(a)AgNPs對E.coli的抗菌效果圖

(b)AgNPs對S.aureus的抗菌效果圖圖6 AgNPs對E.coli和S.aureus的抗菌效果圖

3 結(jié)論

綠茶提取液與AgNO3在溫和條件下可合成AgNPs，XRD和TEM檢測分析表明當AgNO3濃度為5 mmol/L時，用綠茶萃取液可合成結(jié)晶度好、球形、尺寸介于10～15 nm的納米Ag粒子.抗氧化實驗分析表明綠茶萃取液中生物大分子具有很強的抗氧化能力，表現(xiàn)出的強還原性，可將AgNO3溶液中幾乎所有的Ag+還原成銀單質(zhì)，對此，UV-Vis跟蹤觀測反應(yīng)體系中Ag+的還原進程得到了證實；FTIR分析表明綠茶萃取液中含有酰胺基團、氨基、羰基和多酚類化合物等起到了還原、分散和保護作用；抑菌實驗結(jié)果表明所得納米Ag材料對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有較強的抑菌作用.茶提取液大分子物質(zhì)組成復雜，分散穩(wěn)定機理還需進一步研究.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Preparation mechanism and characterization of monodisperse silver nanoparticles synthesized by green tea leaf extract

YANG Hui, REN Yan-yu

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

In this project,green tea extract was used to synthesize AgNPs.UV-Vis was employed to detect and track the reduction of Ag+and the forming process of AgNPs.The synthesize AgNPs with desirable physical and biological properties was characterized using TEM and XRD.FTIR spectroscopy was used to analysis to determine capping of biomolecule on the AgNPs surface of plant extract.Reduction properties of green tea extract were analyzed to study the mechanism of redox reaction.Antibacterial activity of the AgNPs was determined.The results showed that the biosynthesis method of AgNPs is easy and simple.The size of AgNPs between 10～15 nm and it takes spherical shapes and good crystallinity，and has strong antibacterial activity against gram positive bacteria and gram negative bacteria.Antioxidant experiment results showed that green tea extract has strong reduction capacity, able to reduct Ag+into Ag easily, and the biological macromolecules of the extract have stabilizing agent properties.

biosynthesis; silver nanoparticles; green tea leaf extract; antibacterial active; antioxidant

2016-09-23

陜西科技大學學術(shù)帶頭人團隊計劃項目(2013XSD19)

楊 輝(1960-)男，陜西西安人，教授，博士生導師，研究方向：材料合成、發(fā)酵工程

1000-5811(2017)01-0124-05

TB383.1

A