賈旭釗，賈雨楠，王小峰

（大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1老年醫(yī)學科，2婦產(chǎn)科，遼寧大連116011；3陜西省渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西渭南714000）

·綜述·

中性粒細胞胞外殺菌網(wǎng)絡與腫瘤關系的研究進展

賈旭釗1，賈雨楠2，王小峰3

（大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1老年醫(yī)學科，2婦產(chǎn)科，遼寧大連116011；3陜西省渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西渭南714000）

中性粒細胞是外周血中數(shù)量最多的一種白細胞，其在非特異性免疫應答中起重要作用．目前，中性粒細胞胞外殺菌網(wǎng)絡（NETs）作為一種新的中性粒細胞作用機制逐漸被報道，其由核酸物質(zhì)和顆粒蛋白組成，滅菌效率高于其他機制．免疫系統(tǒng)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但NETs與腫瘤關系的報道較少且存在分歧，可能具有抗腫瘤和促腫瘤的雙重作用．本文總結(jié)了NETs在腫瘤進程中已被證明的作用，及其在治療中的潛在機制．

中性粒細胞胞外殺菌網(wǎng)絡；腫瘤；中性粒細胞

0 引言

中性粒細胞（neutrophils）又稱分葉核白細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs），其胞質(zhì)內(nèi)含有許多彌散分布的細小的特有顆粒，細胞核呈桿狀或2～5分葉狀，葉與葉間有細絲相連，是機體抵御細菌等病原體入侵的第一道防線，在非特異性免疫應答中起重要作用［1－2］．2004年，Brinkmann等［3］發(fā)現(xiàn)了由核酸物質(zhì)和顆粒蛋白組成的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為中性粒細胞新的殺菌機制，稱之為中性粒細胞胞外殺菌網(wǎng)絡（Neutrophil extracellular traps，NETs）．中性粒細胞在誘導因子刺激下于炎癥部位形成大量NETs，它可在局部提供高濃度的抗菌分子，捕獲并殺死多種病原體，快速控制病菌在體內(nèi)引起的感染，參與免疫反應，并且抗菌效率高于其他機制［3－5］．NETs在腫瘤發(fā)生過程中可能存在雙重作用：一方面，基于NETs抗腫瘤機制猜測下，NETs可能直接殺傷腫瘤細胞或激活免疫反應系統(tǒng)，從而殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的進展；另一方面，NETs可能促進了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和免疫逃逸，或在腫瘤細胞和免疫細胞之間形成物理屏障，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展．

1 免疫系統(tǒng)和腫瘤的關系

免疫系統(tǒng)識別和殺滅腫瘤細胞的過程稱為腫瘤免疫監(jiān)視，同時其也可能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］．Dunn等［7－8］提出了在腫瘤進程中免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的理論，稱為“免疫編輯”．該理論指出，免疫系統(tǒng)和腫瘤的關系復雜多變，而主要進程分為三個階段［9－10］．第一階段稱為免疫監(jiān)視，此時機體建立對腫瘤的免疫應答，在此階段無任何臨床癥狀，免疫系統(tǒng)有效地消除了腫瘤對正常組織的損害［7］．第二階段是免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的持續(xù)攻擊，隨著腫瘤細胞不斷增殖，免疫系統(tǒng)逐漸被抑制，達到免疫平衡，在此階段尚無臨床癥狀，可逐漸出現(xiàn)組織損害［7，9］．在第三階段中，腫瘤細胞有效地逃逸了免疫識別，并阻止免疫系統(tǒng)對其抑制，出現(xiàn)對免疫監(jiān)視的逃逸和進一步的組織損害，可伴發(fā)臨床癥狀及表現(xiàn)．

中性粒細胞為免疫細胞的重要組成部分，通常認為其主要與抗感染有關，而在抗腫瘤方面無相關性．但目前有研究表明，中性粒細胞可能影響腫瘤發(fā)生的每個階段，其中T淋巴細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞和巨噬細胞在抗腫瘤反應作用中起主要作用［11］．中性粒細胞對腫瘤的影響尚不十分明確，基于小鼠模型的實驗將中性粒細胞分為抗腫瘤的N1型和導致腫瘤發(fā)生的N2型．N1型通過活性氧簇（reactive oxy?gen species，ROS）或抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody?dependent cell?mediated cytotoxicity，ADCC）直接對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性，刺激CD?8＋T細胞和樹突細胞等其他免疫活性細胞并表達腫瘤抗原．N2型則通過不同機制促進腫瘤生長，包括細胞外基質(zhì)重建、促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移、血管和淋巴管再生以及產(chǎn)生致瘤細胞因子（如表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子?β、血小板衍生因子和血管內(nèi)皮生長因子等）影響免疫抑制［11－12］．

2 NETs和腫瘤的關系

2．1 NETs的組成NETs由核酸物質(zhì)和顆粒蛋白組成，不含其他細胞骨架蛋白［3］．核酸物質(zhì)主要為DNA，是NETs的主體部分．顆粒蛋白則包含由彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化酶等組成的來自中性粒細胞的嗜天青顆粒（原發(fā)顆粒），由乳鐵蛋白、明膠酶等組成的繼發(fā)顆粒和三級顆粒．在透射電鏡中顯示，NETs周圍無任何膜狀結(jié)構(gòu)包圍，而且未在NETs中發(fā)現(xiàn)顆粒膜蛋白CD63、胞質(zhì)的膜聯(lián)蛋白（Annexin I）、肌動蛋白、微管蛋白以及其他各種胞質(zhì)的標志性蛋白存在［3，13］．

2．2 影響NETs生成的因素NETs通常在炎癥部位大量產(chǎn)生，并提高局部抗菌分子濃度，從而起到免疫抗菌作用．NETs形成過程是不同于細胞凋亡和壞死的一種新的細胞死亡程序，稱之為NETosis［5］，其特征為細胞內(nèi)的染色體去濃縮化和核膜的崩解．目前已發(fā)現(xiàn)，除細菌、真菌、原生動物、HIV、病毒等病原體外，一些化學或生物因子如氟波醇（phorbol nyristate acetate，PMA）、白介素?8（IL?8）、脂多糖（LPS）、活化的血小板、ROS、補體因子5a（comple?mentary 5a，C5a）、碳酸酐酶抑制劑（carbonic anhy?drase inhibitor，CaI）、葡聚糖（β?glucan，BG）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GO）等也可誘發(fā)NETosis，影響NETs的形成［3，5，14－16］．

2．3 NETs對腫瘤的雙重作用非特異性免疫應答中NETs的發(fā)現(xiàn)使眾多學者重新研究中性粒細胞在腫瘤中的作用［3，17－19］．且目前關于NETs對腫瘤作用的觀點較少且存在分歧．有推測NETs通過直接殺傷癌細胞或激活免疫系統(tǒng)從而對抗腫瘤，然而，細胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)卻可能使腫瘤更易轉(zhuǎn)移從而起到促進腫瘤的作用．NETs的發(fā)現(xiàn)者指出在尤文氏肉瘤患者中，與腫瘤相關聯(lián)的中性粒細胞具有形成細胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力，只有在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中才能夠發(fā)現(xiàn)NETs．NETs和蛋白酶能使細胞外基質(zhì)退化，從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移．此外，NETs可因基質(zhì)金屬蛋白酶?9（matrix metalloprotein，MMP?9）抑制腫瘤細胞衰老的作用而促進腫瘤生長，MMP?9還可促進腫瘤的新生血管生成．在肺癌轉(zhuǎn)移細胞中，發(fā)現(xiàn)MMP?9具有促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用［20－22］．NETs還可能在腫瘤細胞和免疫細胞之間形成物理屏障，同時還可抑制其他免疫細胞的正常生物功能，進而促進腫瘤的發(fā)展．

NETs在一些惡性腫瘤中具有高表達性，在肺癌和骨肉瘤患者中可以發(fā)現(xiàn)NETs結(jié)構(gòu)．在一些乳腺癌、非小細胞型肺癌和慢性粒細胞白血病的小鼠模型中，中性粒細胞具備形成和釋放NETs的高表達性［23－24］．進一步研究表明，NETs中的大量成分也對腫瘤細胞具有毒性．其中，過氧化物酶（MPO）可殺死惡性黑色素瘤細胞并抑制其生長，組蛋白能夠破壞上皮細胞繼而使腫瘤血管破裂出血，防御素可調(diào)節(jié)腫瘤細胞溶解，NETs還能重新召集腫瘤環(huán)境中的樹突狀細胞而抑制血管生成［17，23，25－26］．

2．4 NETs與腫瘤相關疾病的關系腫瘤同肺炎、腹膜炎及敗血癥一樣，都可因轉(zhuǎn)移而明顯增加死亡率．許多研究結(jié)果顯示NETs可促進腫瘤轉(zhuǎn)移［19，24，27］．原發(fā)腫瘤手術的操作可增加血液中腫瘤細胞的數(shù)量．此外，腫瘤手術或化療常伴隨炎癥反應［28－29］．研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導炎癥形成的NETs可使肺癌細胞粘附于肝臟的幾率增加50%，而肝臟恰是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位［27］．中性粒細胞和／或NETs看起來像是一個橋梁，將腫瘤細胞和靶器官內(nèi)皮細胞連接在一起．在肺癌小鼠模型中已經(jīng)證明NETs位于微血管中并捕獲腫瘤細胞DNA［24］．NETs作用于腫瘤轉(zhuǎn)移的病理機制與其在全身感染中的病理機制一樣，可成為治療的靶向目標．

1865年，Armand Trousseau首先發(fā)現(xiàn)了自發(fā)性靜脈血栓與腫瘤之間潛在的關系，隨后研究表明血栓是腫瘤中最重要的并發(fā)癥之一，在腫瘤患者死亡原因中居于第二位．根據(jù)Virchow理論，血流紊亂、血管壁病理改變和異常的血液成分可導致血栓形成［30］．一些研究者假設，在腫瘤形成的過程中，NETs是一個支架，其通過粘附血小板進而形成血栓［1－2］．在乳腺癌模型中，中性粒細胞伴隨著腫瘤的生長，在疾病的終末期，當血漿中可以檢測到NETs激活標志物時，機體會自發(fā)形成血栓，這些研究結(jié)論顯示，在腫瘤中，NETs在血液中自發(fā)形成，可作為血栓形成的標志［2，23］．NETs被認為是腫瘤相關血栓發(fā)生的主要原因，并成為減少腫瘤患者血栓形成的新靶向目標［18］．

3 NETs在腫瘤治療中的潛在應用

過去對腫瘤的研究多圍繞在血漿游離DNA（cell?free DNA，cfDNA）和脫氧核糖核酸酶Ⅰ（De?oxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）的改變，發(fā)現(xiàn)其對癌癥發(fā)展有重要影響［31］．根據(jù)已明確的NETs的生物學功能，許多研究結(jié)果進一步解釋了腫瘤發(fā)生的病理生理機制中有cfDNA和DNase I的參與．它們在大多數(shù)情況下成反比，cfDNA的增加通常伴有DNaseⅠ濃度的降低，這與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移有關［2，23－24］．研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌或胰腺癌中，DNaseⅠ有效地抑制轉(zhuǎn)移并降低cfDNA［31］．在患病兒童和成人中給予重組人DNaseⅠ后，除了對腫瘤外沒有任何副作用［32］．基于此，DNaseⅠ可以作為單一治療方案或聯(lián)合其他方案應用，目前，臨床試驗已經(jīng)將DNaseⅠ用于頭頸部腫瘤患者．另外，已經(jīng)證明肽?；彼崦搧啺泵?4（peptidylarginine deiminases?4，PAD?4）在NETs的形成中起重要作用．在人和小鼠中，選擇性PAD?4抑制劑能抑制NETs形成［33］．

還有一些嘗試在活性氧通路中使用NETs相關酶抑制劑的試驗，結(jié)果表明羧酸和四甲基哌啶這類抗氧化劑可以阻止人中性粒細胞中NETs的形成，并且推薦用于相關治療［34］．但這一方法同時存在著抑制NETs的形成和釋放而出現(xiàn)膿毒血癥的風險．誘導小鼠膿毒血癥的試驗顯示維生素C在阻止NETs的形成上具有重大意義．同樣的結(jié)果在人類身上也得到了驗證，在人血液中分離出用丙二醇甲醚醋酸酯預活化的中性粒細胞后，用維生素C刺激并沒有形成NETs．在小鼠試驗中，缺乏維生素C的小鼠具有自體吞噬、組蛋白瓜氨酸化增多及細胞凋亡抑制這些典型的NETs化表現(xiàn)．這些試驗結(jié)果證實了先前關于維生素C在膿毒癥中起保護作用的報道［35］．因此，維生素C可能影響腫瘤中NETs的形成，從而用于腫瘤的輔助治療．

4 結(jié)語

NETs的發(fā)現(xiàn)是中性粒細胞生物學的新方向，其在腫瘤進展中的作用具有重大意義．目前NETs對腫瘤影響的研究結(jié)果仍存在爭議，NETs可能直接殺傷或刺激免疫系統(tǒng)反應抑制腫瘤細胞，相反亦可能促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和免疫逃逸．雖然目前的數(shù)據(jù)還不能有效地排除其中任一種可能，但可以指出中性粒細胞的活性在NETs的形成與癌癥的關系中具有二元性．此類研究可能對非特異免疫應答機制對抗腫瘤的理解產(chǎn)生巨大的影響，以及發(fā)現(xiàn)對抗癌癥新的治療策略．同時，調(diào)節(jié)NETs的形成可能通過減少血栓形成降低癌癥患者的死亡率．

［1］Fuchs TA，Brill A，Duerschmied D，et al．Extracellular DNA traps promote thrombosis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（36）：15880－15885．

［2］Demers M，Wagner DD．Neutrophil extracellular traps：A new link to cancer?associated thrombosis and potential implications for tumor progression［J］．Oncoimmunology，2013，2（2）：e22946．

［3］Brinkmann V，Reichard U，Goosmann C，et al．Neutrophil extracel?lular traps kill bacteria［J］．Science，2004，303（5663）：1532－1535．

［4］Perova MD，Shubich MG．［Discovery of the neutrophil extracellular traps begins a new stage in the study of neutrophil morphogenesis and function］［J］．Morfologiia，2011，139（3）：89－96．

［5］Arazna M，Pruchniak MP，Zycinska K，et al．Neutrophil extracellular trap in human diseases［J］．Adv Exp Med Biol，2013，756：1－8．

［6］Zamarron BF，Chen W．Dual roles of immune cells and their factors in cancer development and progression［J］．Int J Biol Sci，2011，7（5）：651－8．

［7］Dunn GP，Old LJ，Schreiber RD．The three Es of cancer immu?noediting［J］．Annu Rev Immunol，2004，22：329－360．

［8］Dunn GP，Old LJ，Schreiber RD．The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting［J］．Immunity，2004，21（2）：137－148．

［9］Smyth MJ，Dunn GP，Schreiber RD．Cancer immunosurveillance and immunoediting：the roles of immunity in suppressing tumor develop?ment and shaping tumor immunogenicity［J］．Adv Immunol，2006，90：1－50．

［10］Schreiber RD，Old LJ，Smyth MJ．Cancer immunoediting：integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion［J］．Science，2011，331（6024）：1565－1570．

［11］Granot Z，Jablonska J．Distinct Functions of Neutrophil in Cancer and Its Regulation［J］．Mediators Inflamm，2015，2015：701067．

［12］Fridlender ZG，Albelda SM．Tumor?associated neutrophils：friend or foe［J］．Carcinogenesis，2012，33（5）：949－955．

［13］Sarkar A，Hellberg L，Bhattacharyya A，et al．Infection with Ana?plasma phagocytophilum activates the phosphatidylinositol 3?Kinase／Akt and NF?κB survival pathways in neutrophil granulocytes［J］．Infect Immun，2012，80（4）：1615－1623．

［14］Brinkmann V，Zychlinsky A．Neutrophil extracellular traps：is immunity the second function of chromatin［J］．J Cell Biol，2012，198（5）：773－783．

［15］Bachiega TF，Dias?Melicio LA，F(xiàn)ernandes RK，et al．Participation of dectin?1 receptor on NETs release against Paracoccidioides brasiliensis：Role on extracellular killing［J］．Immunobiology，2016，221（2）：228－235．

［16］White PC，Chicca IJ，Cooper PR，et al．Neutrophil Extracellular Traps in Periodontitis：A Web of Intrigue［J］．J Dent Res，2016，95（1）：26－34．

［17］Berger?Achituv S，Brinkmann V，Abed UA，et al．A proposed role for neutrophil extracellular traps in cancer immunoediting［J］．Front Immunol，2013，4：48．

［18］Gregory AD，Houghton AM．Tumor?associated neutrophils：new targets for cancer therapy［J］．Cancer Res，2011，71（7）：2411－2416．

［19］Cools?Lartigue J，Spicer J，Najmeh S，F(xiàn)erri L．Neutrophil extracel?lular traps in cancer progression［J］．Cell Mol Life Sci，2014，71（21）：4179－4194．

［20］Acuff HB，Carter KJ，F(xiàn)ingleton B，Gorden DL，Matrisian LM．Matrix metalloproteinase?9 from bone marrow?derived cells contrib?utes to survival but not growth of tumor cells in the lung microenvi?ronment［J］．Cancer Res，2006，66（1）：259－66．

［21］Pahler JC，Tazzyman S，Erez N，et al．Plasticity in tumor?promoting inflammation：impairmentofmacrophagerecruitmentevokesa compensatory neutrophil response［J］．Neoplasia，2008，10（4）：329－340．

［22］Fink K，Boratyński J．［The role of metalloproteinases in modification of extracellular matrix in invasive tumor growth，metastasis and angiogenesis］［J］．Postepy Hig Med Dosw（Online），2012，66：609－628．

［23］Demers M，Krause DS，Schatzberg D，et al．Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to canc?er?associated thrombosis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（32）：13076－13081．

［24］Cools?Lartigue J，Spicer J，McDonald B，et al．Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis［J］．J Clin Invest，2013：67484．

［25］Metzler KD，F(xiàn)uchs TA，Nauseef WM，et al．Myeloperoxidase is required for neutrophil extracellular trap formation：implications for innate immunity［J］．Blood，2011，117（3）：953－959．

［26］Al?Benna S，Shai Y，Jacobsen F，Steinstraesser L．Oncolytic activities of host defense peptides［J］．Int J Mol Sci，2011，12（11）：8027－8051．

［27］Spicer JD，McDonald B，Cools?Lartigue JJ，et al．Neutrophils promote liver metastasis via Mac?1?mediated interactions with circu?lating tumor cells［J］．Cancer Res，2012，72（16）：3919－3927．

［28］Van Den Berg YW，Reitsma PH．Not exclusively tissue factor：neutrophil extracellular traps provide another link between chemother?apy and thrombosis［J］．J Thromb Haemost，2011，9（11）：2311－2312．

［29］Tsou CC，Lo SS，F(xiàn)ang WL，et al．Risk factors and management of anastomotic leakage after radical gastrectomy for gastric cancer［J］．Hepatogastroenterology，2011，58（105）：218－223．

［30］VirchowR．Gesammelte．AbhaldungenzurWissenchaftlichen Medicin［J］．Frankfurt：FRG Meidinger Sohn，1856：477．

［31］Hawes MC，Wen F，Elquza E．Extracellular DNA：A Bridge to Cancer［J］．Cancer Res．2015，75（20）：4260－4264．

［32］Lazarus RA，Wagener JS．Recombinant human deoxyribonuclease I［J］．Pharm Biotechnol，2013：321－336．

［33］Lewis HD，Liddle J，Coote JE，et al．Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation［J］．Nat Chem Biol，2015，11（3）：189－191．

［34］Vorobjeva NV，Pinegin BV．Effects of the antioxidants Trolox，Tiron and Tempol on neutrophil extracellular trap formation［J］．Immunobi?ology，2016，221（2）：208－219．

［35］Mohammed BM，F(xiàn)isher BJ，Kraskauskas D，et al．Vitamin C：a novel regulator of neutrophil extracellular trap formation［J］．Nutri?ents，2013，5（8）：3131－3151．

Research progress of relationship between neutrophil extracellular traps and tumor

JIA Xu?Zhao1，JIA Yu?Nan2，WANG Xiao?Feng3

FirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity：1Departments of Geratology，2Departments of Obsterics and Gyne?cology，Dalian 116011，China；3Department of Neurosurgery，Weinan Central Hospital，Weinan 714000，China

Neutrophils are the most numerous white blood cells in peripheral blood in the body，and they play an important role in non?specific immuneresponse．Neutrophilextracellulartraps（NETs）are a new neutrophil mechanism which was discovered recently．NETs are composed of DNA strands and neutrophil gran?ule proteins，and bacillus mortality of NETs is higher than that of other mechanisms．The immune system to participate in the devel?opment of tumor，but NETs may have a different relationship with tumor，potentially having the dual function of promoting and inhibiting them．This article summarizes the demonstrated func?tions of NETs in the process of tumor formation and their potential mechanism in tumor treatment．

neutrophil extracellular traps；tumor；neutrophil

R730．3

A

2095?6894（2017）03?81?04

2016－11－08；接受日期：2016－11－23

賈旭釗．E?mail：409259304＠qq．com

王小峰．碩士．研究方向：神經(jīng)外科．E?mail：441975169＠qq．com