吳雪瓊 張俊仙

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合理應(yīng)用藥物敏感性試驗(yàn)提高耐多藥結(jié)核病診斷率

吳雪瓊 張俊仙

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是目前臨床結(jié)核病治療的難題之一，快速檢出耐多藥的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，指導(dǎo)臨床選擇有效抗結(jié)核藥物，制定合理的化療方案，是控制MDR-TB的關(guān)鍵。目前抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)方法主要有下列三類：一是建立在細(xì)菌生長(zhǎng)基礎(chǔ)上的藥敏試驗(yàn)方法；二是建立在基因多態(tài)性分析基礎(chǔ)上的分子藥敏試驗(yàn)方法；三是建立在耐藥MTB特異組分基礎(chǔ)上的色譜、質(zhì)譜方法。作者概要地介紹了MTB的藥敏試驗(yàn)方法，以及聯(lián)合應(yīng)用現(xiàn)有藥敏檢測(cè)技術(shù)以提高臨床對(duì)MDR-TB的診斷率。

分枝桿菌，結(jié)核； 藥物耐受性； 微生物敏感性試驗(yàn)

我國(guó)結(jié)核病的耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)重[1]，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是目前臨床結(jié)核病治療中亟待解決的難題之一。快速檢出耐多藥的結(jié)核分枝桿菌(MTB)，指導(dǎo)臨床選擇有效抗結(jié)核藥物，制定合理的化療方案，是控制MDR-TB的關(guān)鍵，尤其對(duì)復(fù)治和難治患者更有意義。由于傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)方法是建立在培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，繁瑣、費(fèi)時(shí)，不能滿足臨床開(kāi)展早期、有效治療的需求。近年來(lái)研發(fā)建立了一系列快速、有效的藥敏試驗(yàn)新方法，部分方法已轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品并獲得注冊(cè)證書(shū)，可應(yīng)用于臨床。因此，筆者概要地介紹MTB藥敏試驗(yàn)的方法，及聯(lián)合應(yīng)用現(xiàn)有藥敏檢測(cè)技術(shù)，提高臨床MDR-TB診斷率。

一、建立在細(xì)菌生長(zhǎng)基礎(chǔ)上的MTB藥敏試驗(yàn)方法

細(xì)菌的生長(zhǎng)特性決定了基于培養(yǎng)基礎(chǔ)上的藥敏試驗(yàn)方法耗時(shí)長(zhǎng)，但其可用于分析大多數(shù)抗結(jié)核藥物的耐受性。

1. 傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是在改良羅氏培養(yǎng)基固體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，鑒定MTB對(duì)十幾種一線和二線抗結(jié)核藥物的敏感性水平的方法。我國(guó)常用絕對(duì)濃度法，也有部分實(shí)驗(yàn)室采用比例法，該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于基層。由于分枝桿菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，該方法通常需1～2個(gè)月的時(shí)間。

2．分枝桿菌快速培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)方法：是建立在分枝桿菌快速液體培養(yǎng)(如BACTEC MGIT 960[2]、BacT/ALERT 3D分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)[3]等)基礎(chǔ)上的直接或間接的藥敏試驗(yàn)方法，與傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)基藥敏試驗(yàn)方法具有較好的一致率，報(bào)告時(shí)間縮短至2～3周，較快速，但進(jìn)口試劑成本高，只能檢測(cè)4～5種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，對(duì)二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段[4]。

3．微孔板測(cè)定法：是利用比色法或熒光法來(lái)檢測(cè)細(xì)菌增殖或活細(xì)菌數(shù)量的一種藥敏試驗(yàn)方法，一般MTB需先培養(yǎng)7～10 d。常用下列氧化還原反應(yīng)指示劑：MTT [3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑]、刃天青(Alamar-Blue)[5]、MTS [3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑 ]、TTC [2，3，5-三苯基氯化四氮唑]、XTT{3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉}、臺(tái)盼藍(lán)等，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化，從而判斷菌株的耐藥性。這些方法簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器，但雜菌污染易導(dǎo)致假陽(yáng)性，此外，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全及實(shí)驗(yàn)人員的防護(hù)要求較高。上述方法大多數(shù)尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，而美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)開(kāi)發(fā)出的分枝桿菌藥敏檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB，已通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)，可檢測(cè)MTB對(duì)12種一線和二線抗結(jié)核藥物[包括利福平(rifampicin,RFP)、利福布汀(rifabutin,Rfb)、異煙肼(isoniazid,INH)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、鏈霉素(streptomycin,Sm)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、阿米卡星(amikacin,Am)、對(duì)氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid,PAS)、乙硫異煙胺(ethionamide,Eto)、卡那霉素(kanamycin,Km)、環(huán)絲氨酸(cycloserine,Cs)]的耐藥性，各藥物與羅氏培養(yǎng)基比例法的一致率達(dá)90.0%以上，只需10 d時(shí)間即可獲得抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度[6]。

4．噬菌體生物擴(kuò)增法 (phage amplified biologi-cally assay,PhaB)：分枝桿菌噬菌體對(duì)活的MTB具有親嗜性，MTB受感染后發(fā)生裂解，而形成清晰的噬菌斑。由于噬菌體不能感染死的MTB，因此，噬菌斑的數(shù)量與宿主菌的活菌數(shù)呈正相關(guān)。這是利用噬菌體建立的一種間接檢測(cè)標(biāo)本中活MTB的快速檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)藥物作用后活菌減少的比例，可用來(lái)檢測(cè)MTB對(duì)藥物的敏感性[7]。英國(guó)BIOTEC Lab公司開(kāi)發(fā)的MTB快速診斷試劑盒(噬菌體法；FASTPlaque TBTM)可用于臨床檢測(cè)，只需2 d 時(shí)間，無(wú)需特殊儀器，成本較低，但需克服因接種MTB量較難準(zhǔn)確控制而重復(fù)性差、與其他分枝桿菌有交叉感染而特異度不高的問(wèn)題。

5．硝酸鹽還原試驗(yàn)(nitrate reductase assay，NRA)：將MTB接種于含硝酸鹽及含藥或無(wú)藥的羅氏培養(yǎng)基中，若MTB生長(zhǎng)可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，通過(guò)Griess方法檢測(cè)培養(yǎng)基顏色變化。若含藥管無(wú)顏色變化為敏感；若含藥管呈粉紅色或紫藍(lán)色為耐藥?？捎糜谥苯訖z測(cè)涂陽(yáng)痰標(biāo)本中MTB的耐藥性，與改良羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏試驗(yàn)有很好的符合率，但時(shí)間縮短至1～2周，而且觀察結(jié)果直觀，不需特殊儀器設(shè)備，可用于耐藥MTB的初步篩查[8]。

6. 顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)(microscopic observation drug-susceptibility assay，MODS)：MTB在細(xì)胞培養(yǎng)板中液體培養(yǎng)3～6 d，通過(guò)顯微鏡觀察含藥孔和不含藥孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，即可簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)MTB對(duì)各種抗結(jié)核藥物的敏感性。該方法與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較具有很好的符合率(92%～98%)，可用于快速檢測(cè)耐藥MTB，其缺點(diǎn)是需要倒置顯微鏡觀察MTB的生長(zhǎng)情況[9]。

7.采用顯微鏡延時(shí)成像的MTB瓊脂糖快速藥敏試驗(yàn)：MTB接種于微流控芯片的瓊脂糖基質(zhì)中，在液體培養(yǎng)基中的抗結(jié)核藥物通過(guò)瓊脂糖擴(kuò)散到固定在瓊脂糖基質(zhì)中的MTB，通過(guò)自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)、圖像處理程序自動(dòng)確定MTB對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性，只需9 d時(shí)間[10]。

8. 三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光藥敏試驗(yàn)：MTB細(xì)胞內(nèi)ATP 水平與細(xì)胞存活率呈正相關(guān)?？菇Y(jié)核藥物殺死MTB后，細(xì)胞內(nèi)ATP 經(jīng)酶促催化降解后水平降低，試驗(yàn)時(shí)加入熒光素-熒光素酶，記錄發(fā)光值并計(jì)算樣品ATP含量，即可了解MTB對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性，快速、簡(jiǎn)便，與羅氏固體培養(yǎng)基法一致率為92.7%[11]。該方法最主要的問(wèn)題是痰標(biāo)本中其他細(xì)菌的干擾而導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

9. mRNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)藥敏試驗(yàn)：Ag85B是MTB增殖期分泌的蛋白，當(dāng)MTB經(jīng)抗結(jié)核藥物處理24 h后，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)其Ag85B mRNA表達(dá)水平，若表達(dá)水平下降到無(wú)藥對(duì)照管的1%以下為敏感，>10%為耐藥，1%～10%之間為可疑。該方法與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法具有較好的一致性，也是一種快速有效的耐藥檢測(cè)方法[12]。

10. MPT64藥敏檢測(cè)方法：MPT64是MTB增殖期較豐富的分泌蛋白，耐藥菌株在含藥培養(yǎng)基中生長(zhǎng)MPT64表達(dá)水平就高，通過(guò)檢測(cè)含藥和不含藥培養(yǎng)基中MPT64的含量即可間接反映MTB菌株對(duì)藥物的敏感程度[13]。目前該方法尚需進(jìn)一步完善。

11.流式細(xì)胞術(shù)藥敏檢測(cè)方法：MTB能水解二乙酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA)，應(yīng)用FDA標(biāo)記經(jīng)過(guò)藥物處理后的MTB菌株，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)帶FDA標(biāo)記的菌株的熒光強(qiáng)度，而間接地檢測(cè)MTB對(duì)藥物的敏感性[14]。目前尚處于實(shí)驗(yàn)室探索階段。

二、建立在基因多態(tài)性分析基礎(chǔ)上的分子藥敏試驗(yàn)方法

該方法是采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)、鑒定MTB耐藥靶基因的突變基因型。近年來(lái)隨著MTB對(duì)一線、二線抗結(jié)核藥物耐藥分子機(jī)制的闡明，耐藥基因檢測(cè)試劑盒不斷推出。目前，常用的方法有耐藥基因測(cè)序試劑盒(檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥基因型)、GeneXpert MTB/RIF(檢測(cè)MTB對(duì)RFP的耐藥基因型)、GenoType?MTBDRplus檢測(cè)試劑盒(檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥基因型)、GenoType?MTBDRsl檢測(cè)試劑盒(檢測(cè)MTB對(duì)EMB、氟喹諾酮類、氨基糖苷類藥物的耐藥基因型)、晶芯?MTB耐藥檢測(cè)基因芯片(檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥基因型)[15]、INNO-LiPA MTB耐RFP基因型檢測(cè)試劑盒(INNO-LiPA Rif.TB MTB)及配套的自動(dòng)檢測(cè)儀 (Auto-LiPA)及MeltPro?MTB耐藥檢測(cè)系統(tǒng)(實(shí)時(shí)熒光PCR-探針熔解曲線法；檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥基因型)[16]等。新的耐藥基因檢測(cè)技術(shù)也不斷問(wèn)世，如多層熒光實(shí)時(shí)定量PCR 方法應(yīng)用4種熒光標(biāo)記10個(gè)探針?lè)治鰎poB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因檢測(cè)RFP和INH耐藥[17]；顏色反應(yīng)生物芯片藥敏試驗(yàn)方法通過(guò)不對(duì)稱多重PCR(templex PCR)、生物芯片雜交和酶顏色反應(yīng)檢測(cè)RFP和INH耐藥性，與常規(guī)的藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果具有很高的一致率[18]。應(yīng)用數(shù)字PCR能夠較好地檢測(cè)MTB異質(zhì)性耐藥，可檢出1000∶1的敏感株∶耐藥株混合物中的突變基因[19]；下一代測(cè)序(next-genera-tion sequencing，NGS)將能夠更好地檢測(cè)異質(zhì)性耐藥。分子藥敏試驗(yàn)方法最大的優(yōu)點(diǎn)是快速，只需1～2 d，實(shí)現(xiàn)了MDR-TB的快速診斷。但其缺點(diǎn)是可檢測(cè)的藥物有限，仍有許多藥物無(wú)耐藥基因可檢測(cè)，或檢測(cè)的敏感度不高。因此，分子藥敏試驗(yàn)并不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥敏試驗(yàn)，仍需進(jìn)一步闡明抗結(jié)核藥物的耐藥分子機(jī)制。

三、建立在耐藥MTB特異組分基礎(chǔ)上的色譜、質(zhì)譜方法

MTB產(chǎn)生耐藥后，其菌株各組分會(huì)發(fā)生變化，應(yīng)用色譜技術(shù)(薄層層析、氣相色譜、液相色譜技術(shù))可分離并解析MTB細(xì)胞中各種組分，如脂肪酸、分枝菌酸、單糖等細(xì)胞成分，根據(jù)指紋圖譜或色譜峰的數(shù)量、位置和高度，鑒定耐藥MTB。應(yīng)用質(zhì)譜方法分析MTB耐藥菌株與敏感菌株蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，根據(jù)蛋白指紋圖譜也可鑒定耐藥MTB[20]。但這些方法都只能分析分離株，而且專用儀器設(shè)備和試劑成本高，目前這些方法沒(méi)有在臨床推廣應(yīng)用。

四、聯(lián)合檢測(cè)，提高臨床MDR-TB的診斷率

目前，臨床上采用任何單一的藥敏試驗(yàn)方法均無(wú)法完全滿足臨床需求，需采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)以提高耐藥結(jié)核病的檢出率[21]。將可檢測(cè)對(duì)一、二線抗結(jié)核藥物的基于細(xì)菌生長(zhǎng)的快速藥敏試驗(yàn)方法與在1～2 d內(nèi)即可檢出對(duì)部分藥物耐藥的MTB耐藥基因型的分子診斷方法相結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可快速、敏感地診斷MDR-TB。

目前，國(guó)內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)室采用分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)和改良羅氏培養(yǎng)基相結(jié)合進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，首先通過(guò)分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)提高M(jìn)TB培養(yǎng)的陽(yáng)性率，縮短培養(yǎng)時(shí)間；而后通過(guò)改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，增加進(jìn)行藥敏試驗(yàn)藥物的種類，尤其是二線抗結(jié)核藥物的快速藥敏試驗(yàn)對(duì)于確定MDR-TB治療方案是非常需要的，同時(shí)也降低了污染率和檢測(cè)成本，但仍需1個(gè)月左右的時(shí)間。

目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室大多是采用分子藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)涂陽(yáng)或培陽(yáng)的臨床標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率較高，但傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法的低檢出率也導(dǎo)致一些菌陰耐藥結(jié)核病患者未能得到早期診斷。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室將熒光定量PCR檢測(cè)MTB和NTM方法與耐藥基因檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)耐藥基因芯片直接檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)MTB DNA陽(yáng)性的臨床標(biāo)本，以確定MTB對(duì)RFP和INH的耐受性，31%涂陰和17%培陰的臨床標(biāo)本通過(guò)基因擴(kuò)增可進(jìn)行耐藥基因分析，提高了耐藥結(jié)核病患者的陽(yáng)性檢出率，檢測(cè)耐多藥的MTB與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)的一致率達(dá)83%～87%，敏感度70%～80%，特異度83%～90%[15]，并且只需1～2 d時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的快速藥敏，對(duì)于MDR-TB的早期診斷、有效治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但該方法檢測(cè)其他一、二線抗結(jié)核藥物的敏感度和特異度還有待進(jìn)一步提高，部分二線藥物的耐藥分子機(jī)制還需闡明。

新的表型藥敏試驗(yàn)與分子藥敏試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用將提高耐藥MTB的檢出率，如硝酸鹽還原試驗(yàn)與反向斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)MTB耐藥性，其結(jié)果與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)具有高度的一致性，敏感度和特異度均優(yōu)于單一方法[22]。

綜上所述，MTB藥敏試驗(yàn)方法很多，但已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊(cè)證書(shū)者不多，而在臨床廣泛推廣應(yīng)用的新技術(shù)更少。因此，表型藥敏試驗(yàn)仍是臨床判斷耐藥性、確定治療方案的主要依據(jù)，而分子藥敏試驗(yàn)為MDR-TB的早期診斷提供了有效的手段，若兩者聯(lián)合應(yīng)用將在MDR-TB的控制方面發(fā)揮重要作用。

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(本文編輯：薛愛(ài)華)

Rational use of drug sensitivity test techniques to improve the diagnosis rate of multidrug-resistant tuberculosis

WUXue-qiong,ZHANGJun-xian.

InstituteforTuberculosisResearch,ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,the309thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100091,China

Correspondingauthor:WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

At present, multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is one of the difficult problems in clinical treatment of tuberculosis. The rapid detection of drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(MTB), to guide the clini-cal selection of effective anti-TB drugs, to determine reasonable chemotherapy regimen, were the key points to control MDR-TB. There are mainly three kinds of anti-TB drug sensitivity test methods as follow: (1) the anti-TB drug sensitivity test methods based on bacterial growth; (2) the molecular drug sensitivity test methods based on the gene polymorphism analyses; (3) the chromatography and mass spectrometry methods based on specific components of drug-resistant MTB. This paper briefly introduces the MTB drug sensitivity test methods, and the combined use of the existing drug sensitivity testing techniques, to improve the clinical diagnosis rate of MDR-TB.

Mycobacteriumtuberculosis; Drug tolerance; Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.003

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳雪瓊，Email: xueqiongwu@139.com

2016-10-27)