李根 李春玲 李海聰 趙慧敏 李鋒 胡志東 盧水華 范小勇 呂建新

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結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細胞檢測在診斷活動性結(jié)核病中的價值

李根 李春玲 李海聰 趙慧敏 李鋒 胡志東 盧水華 范小勇 呂建新

目的 分析結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細胞檢測法在診斷活動性結(jié)核病中的價值。方法 選取2015年1—12月來自上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海市肺科醫(yī)院和沈陽市胸科醫(yī)院的708例活動性結(jié)核病患者、289例非結(jié)核肺部疾病患者和55名健康志愿者作為研究對象。將55名健康志愿者和289例非結(jié)核肺部疾病患者作為非活動性結(jié)核組?；顒有越Y(jié)核組包括68例肺外結(jié)核患者和640例肺結(jié)核患者，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核者歸屬為肺結(jié)核患者；在肺結(jié)核患者中有230例患者痰標本的細菌學檢查呈陽性，410例痰標本細菌學檢查陰性。分離研究對象外周血單核細胞，應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細胞檢測試劑盒進行檢測，評價該檢測方法的診斷效能。結(jié)果 結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測活動性結(jié)核組的敏感度為81.78%(579/708)；檢測非活動性結(jié)核組的特異度為79.36%(273/344)；檢測健康志愿者的特異度為89.09%(49/55)。在經(jīng)檢測結(jié)果為陽性的650例研究對象中，正確檢出陽性579例，陽性預測值為89.08%；在所有檢查結(jié)果為陰性的402例研究對象中，正確檢出陰性273例，陰性預測值為67.91%(273/402)；陽性似然比、陰性似然比和正確診斷效率依次為3.96、0.23和80.99%(852/1052)。檢測痰檢陽性患者的陽性檢出率相對更高，為84.78%(195/230)；檢測肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者的陽性檢出率為91.49%(43/47)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細胞檢測試劑盒對于活動性結(jié)核病的診斷具有較高的敏感度和特異度，尤其在肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核的患者以及痰檢陽性的肺結(jié)核患者中效果較好，可用于輔助診斷活動性結(jié)核病。

結(jié)核； T淋巴細胞； 試劑盒, 診斷； 酶聯(lián)免疫斑點檢測； 評價研究

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis，MTB)感染引起的重大傳染性疾病[1]。2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查顯示，2015年全球結(jié)核病新發(fā)患者1040萬例，死亡140萬例[2]。中國第五次全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告顯示，15歲及以上人群活動性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，情況相當嚴重[3]。

結(jié)核病的早期診斷是控制其傳播的關(guān)鍵。以記憶性T細胞檢測為基礎(chǔ)的γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)在發(fā)達國家中已被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病感染的診斷[4]。MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒(商品名：QB-SPOT)相對于結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)等進口試劑而言，其造價更低，更具有在我國臨床中廣泛應(yīng)用的潛在價值。筆者回顧性分析了該試劑盒在我國結(jié)核病診斷中的敏感度、特異度、診斷效率等相關(guān)指標，為其對于活動性結(jié)核病的臨床診斷提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1. 對象：選取2015年1—12月來自上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海市肺科醫(yī)院和沈陽市胸科醫(yī)院的708例活動性結(jié)核病患者、289例非結(jié)核肺部疾病患者和55名健康志愿者作為研究對象。收集研究對象的年齡、性別、所患疾病等臨床信息。每一位受試者均用肝素抗凝管收集靜脈血液至少5 ml，并在4 h之內(nèi)進行檢測。研究對象均經(jīng)知情同意并簽署知情同意書。

2.分組：非活動性結(jié)核組包括55名健康志愿者和289例非結(jié)核肺部疾病患者?；顒有越Y(jié)核組包括68例肺外結(jié)核患者和640例肺結(jié)核患者，其中，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核者歸屬為肺結(jié)核患者；在肺結(jié)核患者中有230例患者痰標本的細菌學檢查呈陽性，410例痰標本細菌學檢查陰性。所有研究對象均采用MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒進行檢測。

3. 納入排除標準：(1)活動性結(jié)核病確診標準：患者出現(xiàn)發(fā)熱、盜汗、咳嗽等典型結(jié)核病癥狀的基礎(chǔ)之上，滿足下列任意一項：①抗酸涂片鏡檢陽性。②BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)MTB陽性。③組織活檢或病理檢測可見典型結(jié)核病灶。④影像學檢查可見典型結(jié)核病征象，且抗結(jié)核藥物治療3個月后隨訪影像學檢查可見病灶明顯吸收、癥狀減輕。其中，肺外結(jié)核的診斷依據(jù)：肺部影像檢查未見明顯結(jié)核病灶，但肺外組織抗酸涂片鏡檢陽性或MTB培養(yǎng)陽性，或病理檢查提示干酪樣壞死。(2)活動性結(jié)核病的排除標準(滿足其中任意一項)：經(jīng)病灶活檢，明確診斷為腫瘤或其他病原體感染，且排除并發(fā)MTB感染；影像學檢查無明顯結(jié)核特征，且經(jīng)非抗結(jié)核藥物治療后病灶明顯吸收，癥狀減輕。(3)健康志愿者納入標準：影像學檢查正常，無疾病體征，無結(jié)核病接觸史。

4.主要試劑和儀器：Ficoll分離液購自天津灝洋生物制品公司；RPMI1640細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司提供；酶聯(lián)免疫斑點測定(ELISPOT)讀板儀購自北京賽智生物制品公司。

5. MTB效應(yīng)T細胞檢測：參照試劑盒說明書進行，操作步驟如下：(1)使用5 ml肝素或檸檬酸鈉抗凝管，采集新鮮外周血標本，注意樣本采集后不能冷藏或冷凍，室溫儲存不應(yīng)超過4 h；(2)用Ficoll分離液將外周血單個核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離出來；(3)吸取細胞(2.5×105個/孔)于預包被有γ-干擾素(IFN-γ)包被抗體的96孔板條，加入終濃度為10 μg/ml的MTB特異性抗原[早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)、Esx-1底物蛋白(Rv3615c)多肽庫]進行刺激，并以僅加入培養(yǎng)基或2.5 μg/ml植物血凝素(PHA)為陰性或陽性對照，于濃度5%的CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18～20 h；(4)孵育完成后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，并依次添加生物素標記的IFN-γ檢測抗體、鏈酶親和素標記的辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物和3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)顯色劑；(5)讀取板條上的點數(shù)。

結(jié)果判定標準如下：(1)當陰性對照孔斑點數(shù)<6，陽性對照孔≥20，檢測孔點數(shù)減去陰性孔點數(shù)≥6時，判定結(jié)果為陽性；(2)當陰性對照孔斑點數(shù)>6，陽性對照孔≥20，檢測孔點數(shù)≥2倍的陰性對照孔點數(shù)時，判定結(jié)果為陽性；(3)當陽性對照孔斑點數(shù)<20，無論陰性孔和檢測孔斑點數(shù)為多少，都視為無效，需重復檢測。

6.統(tǒng)計學分析：采用GraphPad Prism 6.0軟件進行分析。計算MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒的檢測效能指標。計算不同細菌學檢查結(jié)果肺結(jié)核患者應(yīng)用MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測的斑點數(shù)，并進行比較；數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1～Q3)]表示，選用秩和檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.檢測效能：采用MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒在活動性結(jié)核組708例患者中，成功檢出579例，敏感度為81.78%(579/708)；在非活動性結(jié)核組中，檢測71例陽性，特異度為79.36%(273/344)；其中，在55名健康志愿者中檢測6名陽性，特異度為89.09%(49/55)。在檢測結(jié)果為陽性的650例研究對象中，正確檢出陽性579例，陽性預測值為89.08%(579/650)；在所有檢查結(jié)果為陰性的402例研究對象中，正確檢出陰性273例，陰性預測值為67.91%(273/402)。MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測的陽性似然比、陰性似然比和正確診斷效率依次為3.96、0.23和80.99%(852/1052)。

2.不同類型標本檢測效能：在708例結(jié)核病患者中，包括了470例單一肺結(jié)核、56例單一肺外結(jié)核、47例肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、135例結(jié)核并發(fā)其他疾病(包括腎病綜合征、糖尿病和艾滋病等)，應(yīng)用MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測的陽性率依次為：82.98%(390/470)、83.93%(47/56)、91.49%(43/47)和73.33%(99/135)。

3.不同細菌學結(jié)果患者檢測效能：在640例肺結(jié)核患者中，包括有230例細菌學檢查陽性，應(yīng)用MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測84.78%(195/230)為陽性；410例細菌學檢查陰性，80.98%(332/410)檢測為陽性。其中，細菌學陽性患者中的檢出斑點數(shù)為64.50(134.00～22.25)個，明顯高于細菌學陰性患者斑點數(shù)20.00(52.00～5.00)個，差異具有統(tǒng)計學意義(Z=9.28，P=0.004)。

4.對不同類型的肺外結(jié)核患者的檢測效能：本試驗入組的56例肺外結(jié)核患者中包括了5例結(jié)核性腦膜炎(tubercular meningitis，TBM)、11例結(jié)核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)、11例淋巴結(jié)結(jié)核(lymphatic tuberculosis，LTB)、6例骨結(jié)核(bone tuberculosis，BTB)、5例腎結(jié)核(renal tuberculosis，RTB)、8例腰椎結(jié)核(lumbar vertebral tuberculosis，LVTB)、3例支氣管結(jié)核(endobronchial tuberculosis，EBTB)、1例皮膚結(jié)核(skin tuberculosis，STB)和6例結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleuritis，TBPL)。MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒檢測陽性例數(shù)依次為4、11、10、3、5、6、3、0、5，總檢出率為83.93%(47/56)。

討 論

IGRA是近年發(fā)展起來的一種免疫學診斷新方法，相較于結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculosis skin test，TST)，其在檢測MTB感染方面擁有更好的特異度和敏感度，是篩查和檢查結(jié)核病的重要手段之一[5-6]。目前，市場中應(yīng)用最為廣泛的是基于酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)的T-SPOT.TB。但是，進口T-SPOT.TB試劑的檢測費用昂貴，因而在一定程度上限制了其在我國多數(shù)地區(qū)，尤其是在低收入地區(qū)中的臨床推廣[7-8]。MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒為我國生產(chǎn)，生產(chǎn)成本相對低廉，檢測費用僅為T-SPOT.TB的50%左右，因而更適宜在我國推廣使用。與T-SPOT.TB不同的是，MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒選用的抗原除了ESAT-6、CFP10以外，還添加了第3個抗原——Rv3615c。Rv3615c編碼在RD1區(qū)外，大小及序列與ESAT-6和CFP10類似，也是一種可引起效應(yīng)T細胞產(chǎn)生IFN-γ的MTB特異性抗原[9]。MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒將MTB特異性T細胞抗原ESAT-6、CFP10和Rv3615c全長的重疊多肽組成混合肽庫作為抗原，對外周血中分離到的PBMC進行體外刺激，結(jié)合ELISPOT技術(shù)，即可對結(jié)核病疑似患者及潛伏感染者的全血樣本進行高特異性的篩查[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒對活動性結(jié)核病患者檢測的敏感度和特異度與國內(nèi)外報道的T-SPOT.TB的敏感度和特異度相當[12-15]。此外，筆者還比較了該試劑盒在不同類型結(jié)核病中的陽性檢出率，其中，在肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者中的檢出率最高，為91.49%；在結(jié)核并發(fā)其他疾病患者中的檢出率最低，僅為73.33%。究其原因，因為在并發(fā)其他免疫或代謝性疾病的時候，人體的細胞免疫反應(yīng)會受到一定程度的抑制，能分泌IFN-γ的細胞數(shù)減少，因而降低了這部分并發(fā)感染人群的陽性檢出率；此結(jié)果與Kim等[16]報道的結(jié)果相符。在640例肺結(jié)核患者中，有230例痰菌檢測結(jié)果陽性，其分泌IFN-γ的細胞數(shù)量明顯高于痰檢陰性者，其陽性檢出率為84.78%，也高于痰檢陰性人群的80.98%。痰檢陽性的患者由于其體內(nèi)的MTB載量更多，能誘導體內(nèi)效應(yīng)T細胞分泌產(chǎn)生更多的IFN-γ，從而提高了其檢出率。在肺外結(jié)核患者的檢測中，總檢出率為83.93%?？梢姡摍z測法也適用于活動性肺外結(jié)核患者的體外診斷，特別是對于TBP和LTB等肺外結(jié)核具有較高的臨床診斷價值。

本研究還存在一定的局限性。在計算特異度指標時，納入的對照組人群或為被確診為非活動性結(jié)核的肺部感染人群，或為無臨床癥狀的健康志愿者。因缺乏區(qū)分MTB潛伏感染與活動性結(jié)核病的標準方法，故無法判定所入組的對照人群中是否含有MTB潛伏感染者，可能導致該檢測法對于活動性結(jié)核病診斷的特異度被低估。

總之，筆者的研究結(jié)果表明MTB效應(yīng)T細胞檢測試劑盒在檢測MTB感染方面具有較高的特異度與敏感度，對于活動性結(jié)核病的體外診斷具有較好的臨床應(yīng)用價值，尤其在痰檢陽性的肺結(jié)核患者與肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核的患者中表現(xiàn)出了較好的診斷準確性。同時，相較于T-SPOT.TB，該檢測法費用更為低廉，且具有較高的檢測質(zhì)量，因而更適宜在我國臨床中推廣。

[1] Hassan AS, Garba SM, Gumel AB, et al. Dynamics ofMycobacteriumandbovinetuberculosisin a Human-Buffalo Population. Comput Math Methods Med, 2014, 2014: 912306.

[2] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva: World Health Organization, 2016.

[3] 全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組, 全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告. 中國防癆雜志, 2012, 34(8): 485-508.

[4] 吳妍, 李琦, 張宗德. γ-干擾素釋放試驗對老年肺結(jié)核的輔助診斷價值. 中國防癆雜志, 2016, 38(2): 122-128.

[5] 李同心, 何瑛, 周剛, 等. 全血γ-干擾素釋放試驗在結(jié)核病輔助診斷中的價值. 中國防癆雜志, 2016, 38(8): 623-629.

[6] Lu P, Chen X, Zhu LM, et al. Interferon-Gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis: a systematic review and Meta-analysis. Lung, 2016, 194(3): 447-458.

[7] Kowada A. Cost-effectiveness of interferon-gamma release assays for tuberculosis screening in nursing homes. Epidemiol Infect, 2016, 144(15): 3215-3225.

[8] 艾靜文, 阮巧玲, 張文宏. 結(jié)核分枝桿菌潛伏感染預防性治療的進展. 中國防癆雜志, 2015,37(1): 80-85.

[9] MacGurn JA, Raghavan S, Stanley SA, et al. A non-RD1 gene cluster is required for Snm secretion inMycobacteriumtuberculosis. Mol Microbiol, 2005, 57(6): 1653-1663.

[10] Millington KA, Fortune SM, Low J, et al. Rv3615c is a highly immunodominant RD1 (Region of Difference 1)-dependent secreted antigen specific forMycobacteriumtuberculosisinfection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(14): 5730-5735.

[11] Kong H, Dong C, Xiong S. A novel vaccine p846 encoding Rv3615c, Mtb10.4, and Rv2660c elicits robust immune response and alleviates lung injury induced by Mycobacterium infection. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(2): 378-390.

[12] Yan L, Xiao H, Han M, et al. Diagnostic value of T-SPOT.TB interferon-γ release assays for active tuberculosis. Exp Ther Med, 2015, 10(1): 345-351.

[13] 王立紅, 付秀華, 張桂芝, 等. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值. 中國防癆雜志, 2013, 35(12): 992-996.

[14] 楊建蓉, 楊紅. T-SPOT.TB和TST在結(jié)核診斷中的臨床意義. 醫(yī)學綜述, 2015, 21(12):2279-2281.

[15] Shi X, Zhang L, Zhang Y, et al. Utility of T-cell interferon-γ release assays for etiological diagnosis of classic fever of unknown origin in a high tuberculosis endemic area-a pilot prospective cohort. PLoS One, 2016, 11(1): e0146879.

[16] Kim S, Song KH, Choi SJ, et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. Am J Med, 2009, 122(2): 189-195.

(本文編輯：李敬文)

Value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis

LIGen*,LIChun-ling,LIHai-cong,ZHAOHui-min,LIFeng,HUZhi-dong,LUShui-hua,FANXiao-yong,LYUJian-xin.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China

s:FANXiao-yong,Email:xyfan008@fudan.edu.cn;LYUJian-xin,Email:jxlu313@163.com

Objective To evaluate the value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis (ATB). Methods A total of 708 ATB patients, 289 non-tuberculosis (Non-TB) patients and 55 healthy controls were recruited from Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Pulmonary Hospital and Shenyang Chest Hospital between January 2015 and December 2015 and were then tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. Non-active tuberculosis (NATB) group included 55 heathy individuals and 289 Non-TB patients. And 708 ATB patients included 640 cases of pulmonary tuberculosis (PTB) and 68 cases of extra-pulmonary tuberculosis (EPTB), in which the patients suffered from PTB complicated with EPTB were classified into PTB cases. Of the PTB cases, 230 were positive and 410 were negative in sputum smear test. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated and then detectedMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay to evaluate its value in diagnosis of ATB. Results The results showed that the sensitivity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the ATB patients was 81.78% (579/708); the specificity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the Non-TB patients and healthy controls were 79.36% (273/344) and 89.09% (49/55), respectively. Among all the 650 positive cases, 579 were detected correctly and the positive predictive value was 89.08%; while of the 402 negative cases, 273 were detected correctly and the negative predictive value was 67.91%. Additionally, positive likelihood ratio (LR+), negative likelihood ratio (LR-) and diagnostic efficiency ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay were 3.96, 0.23 and 80.99% (852/1052), respectively. Positive detection rate of patients with sputum smear positive was relatively higher (84.78% (195/230)), and positive detection rate of PTB combined with EPTB was 91.49% (43/47) when tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. ConclusionMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay has shown a high sensitivity and specificity in detection of ATB, especially in the PTB combined with EPTB cases, PTB cases with bacterial-positive results, it could be adjunctive to the diagnosis of ATB.

Tuberculosis; T-lymphocytes; Reagent kits, diagnostic; Enzyme-linked immunospot assay; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.016

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003007-003)；國家自然科學基金(81273328、31170876)；上海市科學技術(shù)委員會科研計劃項目(17ZR1423900、134119a5200)

325035 溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院 生命科學學院(李根、李春玲、范小勇、呂建新)；上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心(李海聰、趙慧敏、李鋒、胡志東、盧水華、范小勇)

范小勇，Email：xyfan008@fudan.edu.cn；呂建新，Email：jxlu313@163.com

2016-12-21)