郭 成，張新瑞，張軍高，李敏權(quán)，徐生軍，王天玉

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2的生物學(xué)特性

郭 成1，張新瑞1，張軍高2，李敏權(quán)1，徐生軍1，王天玉2

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

從碳氮源、酸堿度及生長溫度等方面對俄羅斯木霉(Trichodermarossicum)菌株GAU 1-X-2的生物學(xué)特性進行了研究。結(jié)果表明，俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2的生長溫度范圍為10～35 ℃，最適溫度為20 ℃；菌落在pH值為5.0～12.0的培養(yǎng)基上能夠生長，pH為7.0時，生長最快，pH值為8.0時產(chǎn)孢量最大；營養(yǎng)生長最好的碳源為甘露醇，產(chǎn)孢量最好的碳源為葡萄糖；營養(yǎng)生長最適氮源為蛋白胨，在供試的7種氮源中，培養(yǎng)6 d未觀測到該菌株產(chǎn)孢；完全黑暗條件有利于菌絲生長和產(chǎn)孢；孢子致死溫度為68 ℃，10 min。

俄羅斯木霉；生物學(xué)特性；菌絲生長；產(chǎn)孢量

隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期和大量使用而引起的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和病蟲的抗藥性等問題日益凸顯，給人民的生命安全和經(jīng)濟收入帶來了巨大的風(fēng)險。木霉屬(Trichoderma)真菌作為土壤習(xí)居菌的主要類群，其中有許多不同種和同一種不同菌株對植物病原真菌具有較強的抑制作用和拮抗效果，目前，已經(jīng)應(yīng)用于植物土傳病害的生物防治[1-3]。木霉菌不僅能防治病蟲害，還能夠增強植物抗逆性、提高營養(yǎng)利用效率、促進植物生長和修復(fù)農(nóng)化污染環(huán)境等[4-5]。因此，利用木霉菌等微生物資源來防治植物病蟲害已成為研究熱點。

目前，國內(nèi)外學(xué)者不斷搜集和篩選有較強抑制作物病原真菌的木霉菌株，進行發(fā)酵培養(yǎng)和作用機制研究[6-12]，包括競爭作用、重寄生作用、抗生作用、協(xié)同拮抗作用、誘導(dǎo)抗性及促進植物生長等。關(guān)于俄羅斯木霉(T.rossicum)的研究，國外有文獻報道其對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的大白菜(Brassicacamperstrisssp.pekinens)菌核病有較好的防治效果[13]。國內(nèi)崔巖等[14]從甘肅國營條山農(nóng)場馬鈴薯(Solanumtuberosum)連作田植株根圍土樣中分離到1株木霉菌株GAU 1-X-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析將其鑒定為俄羅斯木霉，為國內(nèi)木霉新記錄種；同時經(jīng)過對峙培養(yǎng)法測定該菌株對馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsolani,F.sambucinum)和黑痣病菌(Rhizoctoniasolani)具有較強的抑制作用。研究結(jié)果證明了俄羅斯木霉(T.rossicum)具有較好的生防應(yīng)用潛力，因此，擬對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2的生物學(xué)特性進行研究，以期明確其營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢所需的最佳碳源、氮源、pH、溫度及光照條件等影響因子，為下一步發(fā)酵培養(yǎng)俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2及其有效利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理研究室柴兆祥教授惠贈。

1.2 生物學(xué)特性研究

1.2.1 碳、氮源對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響 將俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2在PSA平板上25 ℃下培養(yǎng)3 d，用滅菌的內(nèi)徑6 mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅，分別轉(zhuǎn)移至以蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇制成的7種不同碳源的固體培養(yǎng)基中央[15-21]和以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、DL-天門冬酰胺、硝酸鉀、尿素、硫酸銨制成的7種不同氮源的固體培養(yǎng)基中央[22]，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。3 d后用十字交叉法測量菌落生長直徑， 6 d后用血球計數(shù)板鏡檢孢子數(shù)量[23]，每處理 3 次重復(fù)。

1.2.2 溫度對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響 以直徑6 mm的打孔器打取該菌株菌餅移至 PDA 培養(yǎng)基平板上，分別置于 5、10、15、20、25、30和35 ℃共7個溫度梯度下進行黑暗培養(yǎng)，3 d后測量菌落生長直徑，6 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理 3 次重復(fù)。

1.2.3 pH 值對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響 利用0.1 mol·L-1的HCl和0.1 mol·L-1的NaOH將已滅菌的PDA培養(yǎng)基pH值分別調(diào)至為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0共10個梯度，依次制成不同pH值的PDA平板。移植直徑6 mm的俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2菌餅于PDA平板中央，25 ℃下黑暗培養(yǎng)，3 d后測量菌落生長直徑，6 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理3次重復(fù)。

1.2.4 光照對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響 在智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實驗儀器廠，PRX-450C)內(nèi)設(shè)置12 h光暗交替(12 h光+12 h黑暗)、24 h連續(xù)光照(氣候箱燈管為40 W日光燈)、24 h連續(xù)黑暗(無光照條件)共3種光照條件。25 ℃下培養(yǎng)，3 d后測量菌落生長直徑，6 d后鏡檢孢子數(shù)量，每處理3次重復(fù)。

1.2.5 俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2孢子的致死溫度測定 第1步，將2 mL孢子懸浮液分別置于40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min，吸取20 μL孢子懸浮液制成玻片，置于25 ℃保濕黑暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，于12、24和72 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況；第2步，根據(jù)第1步試驗結(jié)果，把2 mL懸浮液置于66、67、68、69 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min，同第1步觀察孢子萌發(fā)情況[24]，同時吸取0.1 mL孢子懸浮液涂于PDA平板培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，5 d后檢查PDA平板上菌落生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，并采用DPS 2005軟件進行單因素方差分析，Duncan氏新復(fù)極差法進行處理間差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2對碳、氮源的利用

俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2在供試的7種碳源和7種氮源培養(yǎng)基上均能生長。生長最適的碳源為甘露醇，平均菌落直徑為75.3 mm，顯著大于其它6種碳源(P<0.05)；其它6種碳源上的菌落直徑為48.3～66.3 mm，以淀粉和蔗糖為碳源培養(yǎng)基的菌落直徑較低，顯著低于其它碳源培養(yǎng)基，以葡糖糖、麥芽糖、乳糖和果糖為碳源的菌落直徑差異不大(圖1)。以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、天門冬酰胺為氮源，菌落生長差異并不顯著(圖2)，以尿素為氮源培養(yǎng)基的菌落直徑最低，為5.0，顯著低于其它氮源培養(yǎng)基。

GAU 1-X-2菌株適宜產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖和麥芽糖，1 mL孢子懸浮液平均產(chǎn)孢對數(shù)值為9.06～9.12，其中最適碳源為葡萄糖；其次為乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇和可溶性淀粉的產(chǎn)孢量，1 mL孢子懸浮液平均產(chǎn)孢對數(shù)值8.47～8.81，葡萄糖和麥芽糖之間，乳糖和果糖之間，蔗糖、甘露醇和淀粉之間差異不顯著(P>0.05)，但它們之間產(chǎn)孢量差異顯著(P<0.05)(圖3)。

圖1 供試碳源對菌絲營養(yǎng)生長的影響Fig.1 Effects of different carbon sources values on mycelium growth

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below.

圖2 供試氮源對菌絲營養(yǎng)生長的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources values on mycelium growth

圖3 碳源對產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on sporulation quantity

2.2 溫度對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢的影響

該菌株在10～35 ℃溫度范圍內(nèi)均能生長，平均菌落直徑為1.3～71.2 mm。但在不同溫度條件下，該菌株菌落擴展速度不同，適宜溫度為20～25 ℃，菌落平均直徑為66.3～71.2 mm，其中最適宜溫度為20 ℃，菌落平均直徑高達71.2 mm。溫度低于5 ℃，菌落停止營養(yǎng)生長，高于30 ℃菌絲生長速率減慢，至35 ℃平均菌落直徑為1.3 mm(圖4)。在15～30 ℃的溫度范圍內(nèi)該菌株均能產(chǎn)孢，平均產(chǎn)孢量對數(shù)值為8.24～9.20，適合產(chǎn)孢溫度范圍為20～30 ℃，平均產(chǎn)孢量對數(shù)值為9.13～9.20，其中最適宜產(chǎn)孢溫度為20、25和30 ℃，3個處理下產(chǎn)孢量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于15 ℃處理(P<0.05)(圖4)。

2.3 pH 值對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響

pH為3.0時，PDA平板不凝固；pH為4.0時，PDA平板凝固較差。俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2在pH為5.0～12.0范圍內(nèi)菌絲均可進行營養(yǎng)生長，對酸堿適應(yīng)范圍較廣，以pH為6.0～7.0菌絲營養(yǎng)生長較快，其中最適pH為7.0，平均菌落直徑為66.3 mm；pH低于或高于7.0時，菌絲生長速度開始下降(圖5)。pH為8.0時的產(chǎn)孢量對數(shù)值為9.29，顯著高于除9.0以外的其它pH值(P<0.05)；pH為12.0時，產(chǎn)孢量最低，平均產(chǎn)孢量對數(shù)值為8.27(圖5)。

2.4 光照對俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢量的影響

俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2對光照條件要求不太嚴格，在24 h黑暗、24 h光照、12 h黑暗+12 h光照條件下，平均菌落直徑分別為66.3、56.0和56.7 mm， 24 h光照和12 h黑暗+12 h光照處理間異不顯著(P>0.05)，但二者均菌落直徑均顯著小于24 h黑暗條件下的菌落直徑(P<0.05)(圖6)。產(chǎn)孢量以24 h黑暗處理最高，顯著高于其它兩個處理；24 h光照最低，顯著低于其它兩個處理(圖6)。

圖4 溫度對菌絲營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelium growth and sporulation quantity

圖5 pH對菌絲營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of pH on mycelium growth and sporulation quantity

圖6 光照對菌絲營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effects of light on mycelium growth and sporulation quantity

2.5 俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2孢子的致死溫度

第1步試驗結(jié)果顯示，俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2的孢子在40～65 ℃條件下處理10 min后仍能萌發(fā)，而在70～80 ℃下不能萌發(fā)，說明該菌株孢子的致死溫度在66～69 ℃。第2步試驗結(jié)果表明，在66和67 ℃條件下，孢子均能萌發(fā)，5 d后能觀察到有菌落生長，菌落直徑較小；在68和69 ℃下未觀察到有孢子萌發(fā)，也未形成菌落，說明該菌株孢子的致死溫度是68 ℃，10 min。

3 討論與結(jié)論

在木霉菌生物學(xué)特性方面，許多學(xué)者做了大量研究[7,22,25-29]，而木霉菌的不同種及同種不同菌株在生物學(xué)特性方面存在差異。本研究結(jié)果表明，俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，與綠色木霉TR-8研究結(jié)果[26]一致，但營養(yǎng)生長最適碳源為甘露醇，與綠色木霉TR-8、哈茨木霉gz-2、棘孢木霉T31、長枝木霉TICC菌株營養(yǎng)生長最佳碳源分別為葡萄糖和麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的研究結(jié)果[26-29]有差異。有報道認為天門冬酰胺是綠色木霉TR-8菌絲生長和孢子產(chǎn)生的最佳氮源[26]，而本研究結(jié)果表明，俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2營養(yǎng)生長最適氮源為蛋白胨，在供試的7種氮源中，培養(yǎng)6 d未觀測到該菌株產(chǎn)孢，究竟是何原因，還有待于進一步試驗。

俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2對溫度和酸堿度的適應(yīng)范圍較寬，其在10～35 ℃內(nèi)均可生長，菌絲最適宜擴展和產(chǎn)孢溫度均為20 ℃；菌絲最適營養(yǎng)生長的pH值為7.0，產(chǎn)孢最適酸堿度為8.0，與前人對綠色木霉、長枝木霉、棘孢木霉等的研究結(jié)果有差異[25-29]，哈茨木霉gz-2、棘孢木霉T31、綠色木霉TR-8菌株菌絲營養(yǎng)生長最適pH分別為5.0、6.0和7.0，產(chǎn)孢最適pH依次為5.0、6.0和7.0，而長枝木霉菌株TICC菌絲營養(yǎng)生長最適pH值為5.0，pH在3～7內(nèi)均有利于產(chǎn)孢，且各pH值間無顯著差異。當pH 為3.0和4.0時，PDA平板不凝固或凝固較差，未取得相關(guān)試驗數(shù)據(jù)，這并不代表該菌株在pH值低于5.0時不能生長，需制成液體培養(yǎng)基進一步測試。本研究中，俄羅斯木霉菌株孢子的致死溫度為68 ℃、10 min，表明該菌株具有一定的耐熱性。這可能與本研究所用菌株分離來自景泰地區(qū)有關(guān)，景泰縣位于甘肅中部，地處黃土高原與騰格里沙漠過渡地帶，特殊的生境決定了來自該地區(qū)的菌株在生物學(xué)特性等方面也存在特異性[27]。俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2在完全黑暗條件下，菌絲營養(yǎng)生長最快，產(chǎn)孢量最高，該結(jié)果與光照處理對綠色木霉菌絲生長影響不明顯的結(jié)果[26]較一致，但可明顯促進產(chǎn)孢的研究結(jié)果不一致，這是否與菌株長期處于黑暗狀態(tài)且適應(yīng)其生存環(huán)境相一致，需進一步開展相關(guān)研究。

本研究中的俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2為崔巖等[14]報道的國內(nèi)新記錄種，本研究首次報道了其最佳碳源、氮源、溫度、光照及酸堿度。但有關(guān)俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2對馬鈴薯干腐病菌和黑痣病菌的拮抗作用機理及發(fā)酵培養(yǎng)，有待于進一步研究。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Biological characteristics ofTrichodermarossicumstrain GAU 1-X-2

Guo Cheng1, Zhang Xin-rui1, Zhang Jun-gao2, Li Min-quan1, Xu Sheng-jun1, Wang Tian-yu2

(1.Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China；2.Pratacultural College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The biological characteristics ofTrichodermarossicumstrain GAU 1-X-2 were examined using different carbon and nitrogen sources, pH, temperature, and other factors. The results indicated thatT.rossicumcould grow under temperatures of 10-35 ℃ and pH of 5.0-12.0, with optimal conditions of 20 ℃ and pH 7.0, although the highest sporulation occurred at pH 8.0. Mannitol was the optimum carbon source for hypha growth, but dextrose was the best for spore production. Peptone was the optimum nitrogen source for mycelia, but conidiophores were not observed after six days in the seven nitrogen sources. The best mycelia growth and the largest sporulation occurred with 24 h of darkness. The lethal spore temperature was 68 ℃ for 10 min.

Trichodermarossicum; biological characteristics; hypha growth; sporulation

Zhang Xin-rui E-mail:13809316820@163.com Li Min-quan E-mail:lmq@gsau.edu.cm

2015-12-22接受日期：2016-04-22

甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW2014-16、GNSW-2013-32)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“作物根腐病綜全治理技術(shù)”(201503112)；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中青年基金項目(2014GAAS25)

郭成(1985-)，男，甘肅會寧人，助理研究員，在讀博士生，主要從事玉米病害及微生物多樣性研究。E-mail:gsguoch@126.com

張新瑞(1963-)，男，甘肅武山人，研究員，博士，主要從事作物病害綜合治理研究。E-mail:13809316820@163.com 李敏權(quán)(1962-)，男，甘肅寧縣人，研究員，博士，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail:lmq@gsau.edu.cm

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0732

S567.301;Q945.79

A

1001-0629(2016)12-2391-07*

郭成,張新瑞,張軍高,李敏權(quán)，徐生軍,王天玉.俄羅斯木霉菌株GAU 1-X-2的生物學(xué)特性.草業(yè)科學(xué),2016,33(12)：2391-2397.

Guo C,Zhang X R,Zhang J G,Li M Q,Xu S J,Wang T Y.Biological characteristics ofTrichodermarossicumstrain GAU 1-X-2.Pratacultural Science，2016,33(12)：2391-2397.