譚家郎，胡永霖，王成龍，楊占彪，朱雪梅

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014)

普陀山苔草植物絡(luò)合素合成酶CpPCS基因克隆及其在葉中的表達(dá)分析

譚家郎1，胡永霖1，王成龍2，楊占彪1，朱雪梅1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014)

以超富集植物普陀山苔草(Carexputuoshan)為材料，克隆其植物絡(luò)合素合酶基因CpPCS的cDNA全長序列。同時，對其進(jìn)行重金屬脅迫處理，研究該基因在葉中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明，該基因cDNA序列全長1 461 bp，可編碼486個氨基酸；與其它植物同源基因?qū)Ρ蕊@示，它們的氨基酸序列相似性在63%左右；通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，普陀山苔草CpPCS與小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)及蘆葦(Phragmitesaustralis)等單子葉植物親緣關(guān)系最近；熒光定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，CpPCS基因及CePCS基因受重金屬鉛鋅脅迫上調(diào)表達(dá)，其中在葉中的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。通過普陀山苔草植物絡(luò)合素合酶蛋白基因進(jìn)行了克隆鑒定，探討該基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系及其參與普陀山苔草重金屬脅迫的應(yīng)答模式，為進(jìn)一步培育重金屬污染土壤修復(fù)的植物奠定基礎(chǔ)。

普陀山苔草，植物絡(luò)合素合成酶(PCS)，基因克隆，序列分析

植物修復(fù)技術(shù)指利用超富集植物富集土壤中的重金屬，并將根系富集的重金屬運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜糠?，從而降低土壤中的重金屬水平[1]。其對土壤重金屬污染修復(fù)有著效果好、對環(huán)境干擾小、技術(shù)成本低、無二次污染和環(huán)境美學(xué)的兼容性等優(yōu)點(diǎn)[2]。在超富集植物的研究中，對抗重金屬脅迫的關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析,對篩選與利用超富集植物具有重要意義[1]。植物絡(luò)合素(phytochelatins,PCs)是細(xì)胞響應(yīng)重金屬脅迫而合成的一類巰基多肽化合物，也被叫做植物螯合肽，PCs不僅響應(yīng)鎘(Cd)的脅迫，而且能降低其它重金屬以及非金屬對植物的毒害作用，提高植物對這些元素的抗性，PCs還能夠維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中金屬離子濃度的平衡，它既可以螯合細(xì)胞中過量的金屬離子，保護(hù)細(xì)胞中酶的活性，同時也可以將這些金屬離子保存在細(xì)胞體內(nèi)，在植物體需要的合適時機(jī)釋放到細(xì)胞環(huán)境中[3]。植物絡(luò)合素合酶(phytochelatin synthases,PCS)是PCs合成途徑中的關(guān)鍵酶，首次在Grill和Zenk[4]的研究中發(fā)現(xiàn)，他們從膀胱麥瓶草(Silenecucublue)細(xì)胞中提純出一種酶，這種酶能夠以GSH為底物而催化合成PCs，被稱為PCs。因而，PCS基因成為植物富集土壤重金屬的關(guān)鍵因素之一，多年來一直受到學(xué)者們的重視。自1999年成功克隆擬南芥(Arabidopsisthaliana)、粟酒裂殖酵母(Ascomycetes)和小麥(Triticumaestivum)的AtPCS1、SpPCS及TaPCS13三個PCS基因以來[5-7]，已在多種生物中克隆分析了PCS基因，包括小麥、大蒜(Alliumsativum)、狗牙根(Cynodondactylon)、大豆(Glycinemax)、萵苣(Lactucasaliva)、百脈根(Lotuscorniculatus)、豆梨(Pyruscalleryana)、番茄(Lycopersiconesculentum)、印度芥菜(Brassicajuncea)、天藍(lán)遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)和蜈蚣草(Eremochloaciliaris)等[8-17]。將擬南芥AtPCS1基因轉(zhuǎn)入普通煙草后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的Cd積累量增加了兩倍[18]。在煙草中PCs過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株在水培條件下對Cd離子的吸收增加了9倍[19]。研究表明，植物絡(luò)合素合成酶對于植物富集重金屬研究具有重要的意義。

普陀山苔草(Carexputuoshan)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院朱雪梅團(tuán)隊(duì)最新發(fā)現(xiàn)的一種鉛超富集植物，其繁殖力強(qiáng)，能生長于大部分生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū)，且生物量大，是植物修復(fù)重金屬污染土壤的優(yōu)質(zhì)材料。其地上部分對重金屬鉛的富集量可達(dá)2 369.26 mg·kg-1，遠(yuǎn)超一般超富集植物標(biāo)準(zhǔn)，同時，當(dāng)鋅濃度為125 mg·L-1時，鉛富集達(dá)最大[20]。葉片是普陀山苔草地上部分的主體，分析不同脅迫條件下CpPCS基因在葉中的表達(dá)情況，對于深入理解超富集植物的富集機(jī)制具有十分重要的參考價值。因此，本研究以超富集植物普陀山苔草為研究對象，以苔草屬非超富集觀賞性植物金葉苔草(Carexevergold)為對照，首次嘗試從超富集植物——普陀山苔草中克隆PCS基因，并利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究鉛鋅復(fù)合脅迫下PCS基因的脅迫應(yīng)答響應(yīng)情況，對普陀山苔草的分子應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行初步探索，進(jìn)而為普陀山苔草的富集機(jī)理及重金屬抗性研究提供參考，并為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)高效的超富集轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

普陀山苔草采集于四川省雅安市漢源縣普陀山鉛鋅礦區(qū)。金葉苔草購于花草市場。

將已長出兩片以上真葉，長勢良好的普陀山苔草及金葉苔草幼苗移栽至塑料盆(盆口徑為13 cm，高為12 cm)中進(jìn)行砂培，每盆栽4株，每組處理3次重復(fù)。整個培養(yǎng)期間，每7 d澆一次Hoagland完全營養(yǎng)液(100 mL·盆-1)，每兩天澆一次去離子水(100 mL·盆-1)。對預(yù)培養(yǎng)14 d后的苔草進(jìn)行鉛鋅處理，重金屬溶液為100 mL·盆-1。

前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鋅(Zn)濃度為125 mg·L-1、鉛(Pb)濃度為600 mg·L-1時，普陀山苔草富集量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)超過了鉛超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)[20]。因此，脅迫的重金屬溶液濃度處理設(shè)置為0、Pb2+600 mg·L-1、Zn2+125 mg·L-1和Pb2+600 mg·L-1+ Zn2+125 mg·L-1。分別于脅迫后的0、12、24和36 h對苔草的葉片與根進(jìn)行取樣收集。各處理在每個時間點(diǎn)取3株樣為重復(fù)。取樣時，葉片用去離子水沖洗3次，吸干表面水分，液氮速凍，放于-70 ℃冰箱保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 超凈工作臺、研缽、移液器等試驗(yàn)用具的清潔均按RNA提取的常規(guī)方法處理，參考柱式植物RNAout 3.0 Kit操作手冊并稍加改進(jìn)，利用電泳和分光光度計檢測總RNA樣品。取1 μL苔草總RNA樣品，2%的非變性瓊脂糖凝膠電泳，觀察28S rRNA和18S rRNA的亮度比。取1 μL總RNA、9 μL 1×TE于比色皿，混勻，在RNA程序下測定樣品相應(yīng)值，樣品RNA含量(μg·mL-1)=40×OD260×n÷1 000。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfeCp Real Time)(Takara Code:RR047A)合成cDNA第一鏈。

1.2.2 兩種苔草CpPCS基因cDNA保守區(qū)及普陀山苔草全長克隆 植物絡(luò)合素合酶引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的大蒜(AAO13809.1)、小麥(AF093752.1)、水稻(AF439787.1)、蘆葦(AFU06381.1)等氨基酸保守序列，利用codehop設(shè)計簡并引物UP和DP。根據(jù)上述CpPCS基因的保守片段，設(shè)計3′-RACE引物和5′-RACE引物。序列拼接獲得基因全長序列，以此設(shè)計基因特異性引物CpPCS-5′和CpPCS-3′，克隆CpPCS基因的CDS片段。

CpPCS與CePCS基因保守片段的克隆:以合成的cDNA第一鏈為模板，用引物UP和DP擴(kuò)增CpPCS與CePCS基因的保守片段。反應(yīng)體系(25 μL)：Premix Taq Version 2.0 9.5 μL,ddH2O 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL 。反應(yīng)參數(shù)分別為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,57 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán);72 ℃ 10 min；94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,60 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán);72 ℃ 10 min。

CpPCS基因3′ 端cDNA的克隆:以3′ RACE-ready cDNA為模板，用引物P3R和試劑盒中通用引物擴(kuò)增CpPCS基因的3′片段。反應(yīng)體系(25 μL)：Premix Taq Version 2.0 9.5 μL,ddH2O 12.5 μL，上下游引物各1 μL，L cDNA模板1 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,50 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán);72 ℃ 10 min。

CpPCS基因5′ 端cDNA的克隆:以5′ RACE-ready cDNA為模板，用引物P5R和試劑盒中通用引物擴(kuò)增CpPCS基因的5′片段。反應(yīng)體系(25 μL)：Premix Taq Version 2.0 9.5 μL,ddH2O 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,54 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán);72 ℃ 10 min。

CpPCS基因CDS序列的克隆:利用擴(kuò)增CDS序列的基因特異引物CpPCS-3′和CpPCS-5′，以普陀山苔草cDNA第一鏈為模板，PrimeSTAR?Max DNA Polymerase擴(kuò)增CpPCS基因的CDS序列。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,56 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán);72 ℃ 10 min。

各輪PCR擴(kuò)增所用引物如表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，按TIANgel Maxi Purification Kit操作手冊，稍加改動，回收目的條帶。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物用于制備E.coli化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選及測序。

1.2.3CpPCS基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將得到的普陀山苔草CpPCS基因測序結(jié)果進(jìn)行拼接，利用Premier 5.0翻譯cDNA序列為氨基酸序列，在NCBI Conserved Domain Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)上搜索保守結(jié)構(gòu)域。 使用MEGA5.0軟件，通過鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ExPASy (http://www.expasy.org/tools/)在線軟件分析氨基酸序列的基本理化信息；使用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)分析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.2.4CpPCS及CePCS基因表達(dá)分析 取脅迫處理后的兩種苔草葉100 mg，RNA提取及反轉(zhuǎn)錄同1.2.1合成cDNA第一鏈。利用CpPCS及CePCS基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物PCSqf及PCSqr(表1)，內(nèi)參基因選用組蛋白基因H3(表1)，采用SYBR染料法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。

表1 引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段大小Table 1 Primer sequences and expected sizes of PCR products

反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，54 ℃ 25 s，+ Plate Read；GOTO 2，39 more times；Melt Curve 65.0 to 95.0 ℃，increment 0.5 ℃，5s，+ Plate Read；END。按照2-ΔΔCt法計算出待測基因相對表達(dá)量[21]，應(yīng)用SPSS及Origin整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpPCS基因全長cDNA克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到普陀山苔草CpPCS基因與金葉苔草CePCS基因的保守片段，依此設(shè)計RACE引物，PCR擴(kuò)增得到CpPCS基因兩端片段，進(jìn)而設(shè)計全長引物來擴(kuò)增CpPCS基因全長，得到完整的CpPCS基因CDS序列。

利用保守片段引物擴(kuò)增得到兩條441 bp的特異片段(圖1A)，序列分析其屬于植物絡(luò)合素合酶蛋白基因，5′ 和3′ -RACE分別擴(kuò)增出282和1 200 bp的片段(圖1B,C)，均含兩端序列的識別標(biāo)志，說明成功得到兩端，序列拼接，設(shè)計全長引物擴(kuò)增得到1 461 bp的片段(圖1D)。利用NCBI進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有典型的植物絡(luò)合素合酶蛋白基因特征，因此命名為CpPCS。

2.2 CpPCS基因的序列分析

普陀山苔草CpPCS基因的開放閱讀框由1 461個堿基組成，編碼一個含有486個氨基酸殘基的蛋白(圖2)。估計的相對分子質(zhì)量為53.87 kD，預(yù)測的等電點(diǎn)(pI)為5.67～7.77，預(yù)測脂肪系數(shù)為87.65，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為47.56，歸類于不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對，發(fā)現(xiàn)普陀山苔草與玉米(Zeamays,NP_001168641.1)、蘆葦(Phragmitesaustralis,AFU06381.1)、大蒜(AAO13809.1)、粉藍(lán)煙草(Nicotianaglauca,ABX10958.1)、苧麻(Boehmerianivea,AHC98018.1)的PCS氨基酸序列相似性分別為64%、63%、63%、63%和62%。

CpPCS屬于植物絡(luò)合素亞家族，與其它物種PCS氨基酸序列存在很高的保守性，其中N端保守性較高，該基因響應(yīng)重金屬，并對植物絡(luò)合過程起作用。CpPCS有19個半胱氨酸(Cys)殘基散布在基因的不同區(qū)域上(圖2中圓圈表示)，并組合成5個Cys-(Xaa)n-Cys(n=0～5)元件(包括3個Cys-Cys 元件，圖2中方框表示)，其中C371C372XXXC376XXC379是PCS蛋白質(zhì)典型的重金屬離子傳感器基因序列[22-23]，含有3個活性必需氨基酸(Cys56、His162和Asp182)(圖2中正六邊形表示)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The PCR amplification results

注：M1,Marker D 2 000 bp;M2,Marker D 5 000 bp;1,CpPCS保守區(qū);2,CePCS保守區(qū);B,3′端;C,5′端;D,CpPCS全長。

Note： M1, Marker D 2 000 bp; M2, Marker D 5 000 bp; 1, CpPCS conserved sequence; 2, CePCS conserved sequence; B, 3′ sequence,C, 5′ sequence; D, CpPCS full-length sequence.

以CpPCS的氨基酸序列構(gòu)建物種間的PCS蛋白進(jìn)化樹(圖3)可知，普陀山苔草CpPCS與小麥、水稻(Oryzasativa)及蘆葦?shù)葐巫尤~植物親緣關(guān)系最近。在 http://swissmodel.expasy.org上利用Automatic Modelling Mode預(yù)測了普陀山苔草 CpPCS蛋白的三維結(jié)構(gòu)，同時與擬南芥AtPCS1蛋白、蜈蚣草PvPCS蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這3種蛋白具有類似的空間結(jié)構(gòu)，并且可以預(yù)測，它們的功能在植物體中相似(圖4)。上述結(jié)果表明，本研究克隆得到的CpPCS基因的氨基酸序列所編碼的蛋白為植物絡(luò)合素合酶。

2.3 CpPCS及CePCS的表達(dá)分析

除Zn2+脅迫12 h以外，其它重金屬脅迫處理后CpPCS基因在葉中的相對表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，Pb2+脅迫處理12、24和36 h后，葉中的相對表達(dá)量提高到不脅迫時的2.50、2.19、3.45倍。Zn2+脅迫處理24和36 h后，葉中的相對表達(dá)量提高到不脅迫的1.94倍和4.53倍，Pb2++Zn2+復(fù)合脅迫處理12、24和36 h后，葉中的相對表達(dá)量提高到不脅迫時的2.85、2.29、12.58倍(圖5)。CePCS基因在金葉苔草葉中表達(dá)，重金屬脅迫下該基因相對表達(dá)量也顯著增加，Pb2+脅迫處理12、24、36 h后，葉中提高到不脅迫時的1.41、1.35、1.77倍，Zn2+脅迫處理12、24、36 h后，葉中提高到不脅迫時的1.01、1.92、7.16倍，Pb2++Zn2+復(fù)合脅迫處理12、24、36 h后，葉中提高到不脅迫時的1.35、2.36、9.175倍(圖5)。以上結(jié)果說明不同重金屬對其相對表達(dá)量的誘導(dǎo)能力為Pb2++Zn2+>Zn2+>Pb2+。

圖2 CpPCS核苷酸序列和其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotides sequence and predicted amino acids sequence of CpPCS gene

注：○，半胱氨酸殘基；?，Cys-(Xaa)n-Cys(n=0～5);，活性必需氨基酸。

Note: ○, cysteine residue; ?, Cys-(Xaa)n-Cys(n=0～5);, active essential amino acid.

圖3 不同物種PCS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PCS proteins from different species

圖4 蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Ppredicted 3D protein structure

注：普陀山苔草CpPCS (A),印度芥菜BjPCS1 (B),擬南芥AtPCS (C)

Note:CarexputuoshanCpPCS (A),BrassicajunceaBjPCS1 (B),ArabidopsisthalianaAtPCS (C)

圖5 重金屬脅迫下普陀山苔草CpPCS和CePCS基因在葉中的相對表達(dá)量Fig.5 Expression of CpPCS and CePCS gene in leaves of Carex putuoshan under heavy metal stress

注：不同小字母表示各處理間差異顯著 (P<0.05)。

Note： Different lower case letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level.

3 討論

3.1 CpPCSS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能

本研究克隆了普陀山苔草CpPCS基因，PCS蛋白氨基酸長度為465～506 aa，預(yù)測等電點(diǎn)為5.67～7.77；PCS蛋白主要定位于細(xì)胞核中；植物中PCS蛋白大多為不穩(wěn)定蛋白，PCS蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲以及延伸鏈等元件組成，空間構(gòu)架極其相似。本研究得到的CpPCS蛋白為不穩(wěn)定蛋白，具有親水性并且有兩個跨膜區(qū)域，具有一個典型的植物絡(luò)合素合成酶功能域。BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，該基因與其它植物PCS基因氨基酸序列同源性達(dá)60%以上，其中與小麥ZmPCS基因同源性達(dá)64%，表明該基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性；氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)PCS蛋白的N端在不同物種之間具有高度的保守性，同源性高達(dá)40%～50%，而C端卻是多變的[24]，Cys殘基的位置和排列方式(特別是 N 末端區(qū)域)對植物絡(luò)合素合酶蛋白活性和鎘耐受能力非常重要。這種Cys的排列類似于MT中Cys的排列方式[25-26]。 相鄰的Cys元件是螯合重金屬離子的重要功能元件，有研究表明[27]，將酵母PCS基因中Cys173突變?yōu)锳la173后，其結(jié)合Cd離子的活性完全消失，并且降低了PCs的合成效率。C358C359XXXC363XXC366基序是植物絡(luò)合素合酶的重金屬離子傳感器[28]，在百脈根LjPCS1和豆梨PcPCS1蛋白中表現(xiàn)為C368C369RETC373MKC376和C369C370QETC374VKC377形式，而苧麻BnPCS1蛋白中表現(xiàn)與豆梨完全相同[29]，而普陀山苔草CpPCS蛋白中表現(xiàn)為C371C372KETC376VKC379。推測該基序在普陀山苔草中同樣行使重金屬離子傳感器功能，響應(yīng)重金屬脅迫的重要功能元件。通過三維結(jié)構(gòu)預(yù)測可以看出，普陀山苔草PCS與擬南芥和印度芥菜具有相似的空間構(gòu)架，它從側(cè)面印證PCS蛋白是普陀山苔草的重金屬富集機(jī)制的重要組成部分。

3.2 CpPCS及CePCS的脅迫應(yīng)答

葉片是普陀山苔草地上部分的主體，同時也是普陀山苔草PCS基因的主要合成部位。分析不同脅迫條件下CpPCS基因在葉中的表達(dá)情況，對于深入理解超富集植物的富集機(jī)制具有十分重要的參考價值。qRT-PCR分析表明，CpPCS基因受重金屬鉛鋅脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中在葉中的表達(dá)量顯著增加，這與豆梨PcPCS1[13]、蘿卜(Raphanussativus)RsPCS[30]基因的表達(dá)特征一致。這可能是普陀山苔草地上部分富集量高的原因之一。

單一鉛鋅脅迫下，CpPCS及CePCS的表達(dá)量大部分隨著時間變化呈現(xiàn)先升高后略微降低再升高的趨勢，這說明鉛鋅處理均會誘導(dǎo)CpPCS及CePCS的表達(dá)，且鋅處理下表達(dá)量稍高，這與李慧等[13]及姜倩倩等[31]的研究相符合。而在鉛鋅符合復(fù)合脅迫下，兩種苔草PCS基因均高表達(dá)，特別是普陀山苔草葉片CpPCS基因表達(dá)量達(dá)到空白對照組的12倍，是相同處理下金葉苔草的8倍。從一方面來說，在鉛鋅脅迫環(huán)境下，鉛鋅均可能是普陀山苔草中CpPCS的誘導(dǎo)因素之一，復(fù)合脅迫下鉛鋅的誘導(dǎo)產(chǎn)生協(xié)同作用，使普陀山苔草CpPCS大量表達(dá)，刺激了植物絡(luò)合素高效快速的合成，才使得普陀山苔草能在高濃度的鉛脅迫下有很強(qiáng)的耐性，這可能是普陀山苔草富集作用的原因之一。從另一方面來說，則可能是普陀山苔草CpPCS大量表達(dá)，刺激了植物絡(luò)合素高效快速的合成，使得雖然普陀山苔草不富集鋅卻能耐受鋅的毒害。這說明CpPCS是鉛鋅脅迫下重要的解毒基因與富集基因。

References：

[1] 李翠，王慶海，肖波.3種草本能源植物對Zn脅迫的生理響應(yīng)與積累特性.草業(yè)科學(xué)，2013，30(10)：1555-1560. Li C,Wang Q H,Xiao B.Effects of Zn stress on physiological response and accumulation of three herbs.Pratacultural Science，2013，30(10)：1555-1560.(in Chinese)

[2] 李惠英，戶正榮，傅金民.不同基因型高羊茅的耐鉛與鉛富集特性.草業(yè)科學(xué)，2014，31(7)：1269-1274. Li H Y,Hu Z R,Fu J M.Lead tolerance and accumulation of different tall fescue genotypes.Pratacultural Science，2014，31(7)：1269-1274.(in Chinese)

[3] Javier R，Loreto N，Marina G，Joaquín A，Manuel B.Functional characterization of an unusual phytochelatin synthase，LjPCS3，ofLotusjaponicus.Plant Physiology，2008，148(1)：536-545.

[4] Grill E，Zenk M H.Phytochelatins：The principal heavy-metal complexing peptides of higher plants.Science，1985，230：674-676.

[5] Vatamaniuk O K，Mari S，Lu Y P，Rea P A.AtPCS1，a phytochelatin synthase fromArabidopsis：Isolation and in vitro reconstitution.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96(12)：7110-7115.

[6] Ha S B，Smith A P，Howden R，Dietrich W M，Bugg S，O'Connell M J，Goldsbrough P B，Cobbett C S.Phytochelatin synthase genes fromArabidopsisand the yeastSchizosaccharomycespombe.Plant Cell，1999，11(6)：1153-1163.

[7] Clemens S，Kim E J，Neumann D，Schroeder J I.Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast.Embo Journal，1999，18(12)：3325-3333.

[8] 姜瑛楠.大蒜中植物絡(luò)合素合酶基因的克隆及功能分析.北京：中國科學(xué)院植物研究所碩士學(xué)位論文，2003. Jiang Y N.The cloning and function analyzing of a phytochelatin synthase gene fromAlliumsativum.Master Thesis.Beijing：Institute of Botany，the Chinese Academy of Sciences，2003.(in Chinese)

[9] Li J，Guo J，Xu W，Ma M.Enhanced cadmium accumulation in transgenic tobacco expressing the phytochelatin synthase gene ofCynodondactylonL.Journal of Integrative Plant Biology，2006，48(8)：928-937.

[10] Matjaz O，Page J E，Zenk M H，Kutchan T M.Molecular characterization of the homo-phytochelatin synthase of soybeanGlycinemax：Relation to phytochelatin synthase.Journal of Biological Chemistry，2002，277(7)：4747-4754.

[11] He Z，Li J，Zhang H，Ma M.Different effects of calcium and lanthanum on the expression of phytochelatin synthase gene and cadmium absorption inLactucasativa.Plant Science 2005，168(2)：309-318.

[12] Singh J P，Bansal N P，Goto T，Lamon J，Choi S R，Mahmoud M M，Link G.Combustion Formation of Ti2AIC MAX Phase by Electro-Plasma Processing.Hoboken:John Wiley & Sons，Inc.，2012：1213-1221.

[13] 李慧，叢郁，王宏偉，盛寶龍，藺經(jīng)，常有宏.豆梨植物鉻合素酶PcPCS1基因克降及其表達(dá)分析.園藝學(xué)報，2010，37(6)：880-890. Hui L，Cong Y，Wang H W，Sheng B L，Lin J，Chang Y H.Molecular cloning and expression analysis of a phytochelatin synthase Gene，PcPCS1，fromPyruscalleryanaDcne.Acta Horticulturae Sinica，2010，37(6)：880-890.(in Chinese)

[14] 李慧，叢郁，常有宏.番茄植物絡(luò)合素合酶基因全長cDNA的克隆及其表達(dá)特點(diǎn).江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26(1)：136-142. Li H，Cong Y，Chang Y H.Cloning of phytochelatin synthase gene(LePCS1) from tomato seedlings and its expression characteristics under heavy metal stress.Jiangsu Journal of Agriculture，2010，26(1)：136-142.(in Chinese)

[15] Heiss S，Wachter A J，Cobbett C，Rausch T.Phytochelatin synthase (PCS) protein is induced inBrassicajuncealeaves after prolonged Cd exposure.Journal of Experimental Botany，2003，54：1833-1839.

[16] Stephen E，Ingar L，Beth A，Leon K.Phytochelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulatorThlaspicaerulescens(J.& C.Presl).Planta，2002，214(4)：635-640.

[17] Zhao F J，Wang J R，Barker J H A，Schat H，Bleeker P M，Mcgrath S P.The role of phytochelatins in arsenic tolerance in the hyperaccumulatorPterisvittata.New Phytologist，2003，159(2)：403-410.

[18] Pomponi M，Censi V，Girolamo V D，Paolis A D，Toppi L S D，Aromolo R，Costantino P，Cardarelli M.Overexpression ofArabidopsisphytochelatin synthase in tobacco plants enhances Cd2+tolerance and accumulation but not translocation to the shoot.Planta，2006，223(2)：180-190.

[19] Carmina G，Roc R，Antonio D H，Walker D J，Bernal M P，Ramón S，Juan N A.A plant genetically modified that accumulates Pb is especially promising for phytoremediation.Biochemical & Biophysical Research Communications，2003，303(2)：440-445.

[20] 黃金龍.鉛鋅脅迫下普陀山苔草(Carexputuoshanensis)的富集特性及生理代謝研究. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014. Huang J L.Study on accumulation characteristics and physiological metabolism ofCarexputuoshanensisunder Pb-Zn stress.Master Thesis.Ya’an：Sichuan Agricultural University，2014.(in Chinese)

[21] Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔGMethod.Methods，2001，25(4)：402-408.

[22] 柳玉霞，王曉桐，蘇旭東，代亮，張志毅，徐吉臣.毛白楊植物絡(luò)合素合酶(PtPCS)基因克隆及其表達(dá)研究.分子植物育種，2012，10(2)：174-183. Liu Y X,Wang X T,Su X D,Dai L,Zhang Z Y,Xu J C.Cloning and expression analysis of a phytochelatin synthase gene (PtPCS)inPopulustomentosaCarr.Molecular Plant Breeding，2012，10(2)：174-183.(in Chinese)

[23] Matsumoto S，Vestergaard M D，Konishi T，Nishikori S，Shiraki K，Tsuji N，Hirata K，Takagi，M.Role of C-terminal Cys-rich region of phytochelatin synthase in tolerance to cadmium ion toxicity.Journal of Plant Biochemistry & Biotechnology，2009，18(2)：175-180.

[24] Andreas A T，Leker R R，F(xiàn)rank S，Hoeppner D J，Rea R，Poser S W，Rueger M A，Soo-Kyung B，Raja K，Mckay R D G.Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.Nature，2006，442：823-826.

[25] Rea P A.Phytochelatin synthase，papain’s cousin，in stereo.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(3)：507-508.

[26] Pal R，Rai J P N.Phytochelatins:Peptides involved in heavy metal detoxification.Applied Biochemistry & Biotechnology，2009，160(3)：945-963.

[27] Ruotolo R，Peracchi A，Bolchi A，Infusini G，Amoresano A，Ottonello S.Domain organization of phytochelatin synthase.Journal of Biological Chemistry 2004，279，14686-14693.

[28] Vestergaard M，Matsumoto S，Nishikori S，Shiraki K，Hirata K，Takagi M.Chelation of cadmium ions by phytochelatin synthase：Role of the cystein-rich C-terminal.Analytical Sciences，2008，24(2)：277-281.

[29] Zhu S J，Shi Z Y，Wei-Lin Y U，Zhou J H，Jie Y C，Ramie I O，University H A.Cloning and characterization of theBnPCS1 gene from ramie(BoehmerianiveaL.).Journal of Plant Genetic Resources，2014，15(3)：582-588.

[30] 賀曉燕.蘿卜鎘脅迫響應(yīng)相關(guān)基因克隆及其表達(dá)分析.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011. He X Y.Cloning and expression of responsive genes related to cadmium stress in radish (RaphanussativusL.).Master Thesis.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2011.(in Chinese)

[31] 姜倩倩,孫曉莉,曹慧,鄒巖梅,束懷瑞.湖北海棠植物絡(luò)合酷MhPCS基因克隆及表達(dá)分析.果樹學(xué)報,2013(3):341-347. Jiang Q Q，Sun X L，Cao H，Zou Y M，Shu H R.Isolation and expression analysis of a phytochelatin synthase gene(MhPCS)fromMalushupehensis.Journal of Fruit Science，2013(3):341-347.(in Chinese)

(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Cloning and expression analysis ofCpPCSfromCarexputuoshan

Tan Jia-lang1, Hu Yong-lin1, Wang Cheng-long2, Yang Zhan-biao1, Zhu Xue-mei1

(1.College of Environmental Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2.College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The hyperaccumulatorCarexputuoshanwas used as cloning material for the phytochelatin synthase (PCS) gene, and to characterize its expression following heavy metal stress. The results showed that the cDNA ofCpPCSwas 1 461 bp in length, and it encoded 486 amino acids with a molecular weight of 53.86 kDa and pI value of 6.12. As compared to other plants, the amino acid sequence similarity was approximately 63%. Phylogenetic analysis of PCS proteins from different species showed those ofC.putuoshanwere most closely related to those ofOryzasativaandTriticumaestivum. Real-time quantitative PCR analysis indicated thatCpPCSandCePCS(Carexoshimensis'Evergold') genes were expressed in the leaves. TheCpPCSandCePCSgenes were up-regulated in Pb and Zn treatments. Additionally, we investigatedCpPCSstructure, phylogenetic relationships, and gene expression patterns. Our results indicated thatCpPCSmight play an important role in heavy metal stress, and could be further utilized in plants.

Carexputuoshan; phytochelatin synthase (PCS); gene cloning; sequence analysis

Yang Zhan-biao E-mail:yzb195@126.com

2016-02-21接受日期：2016-06-14

四川省科技支撐計劃項(xiàng)目(2008FZ0180)

譚家郎(1991-)，男，湖南漣源人，在讀碩士生，主要從事污染生態(tài)學(xué)研究。E-mail：tanjia1991@qq.com

楊占彪(1979-)，男，甘肅會寧人，副教授，博士，主要從事污染生態(tài)學(xué)研究。E-mail：yzb195@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0073

Q943.2

A

1001-0629(2016)12-2503-08*

譚家郎,胡永霖,王成龍,楊占彪,朱雪梅.普陀山苔草植物絡(luò)合素合成酶CpPCS基因克隆及其在葉中的表達(dá)分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(12)：2503-2510.

Tan J L,Hu Y L,Wang C L,Yang Z B,Zhu X M.Cloning and expression analysis ofCpPCSfromCarexputuoshan.Pratacultural Science，2016,33(12)：2503-2510.