張書(shū)敏， 徐鳳花*， 張?zhí)N琦， 吳 優(yōu)， 代 歡

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150010；2.華中師范大學(xué)海南附屬中學(xué)，海南?？?570100)

玉米秸稈纖維素降解菌系的篩選及培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化

張書(shū)敏1， 徐鳳花1*， 張?zhí)N琦1， 吳 優(yōu)1， 代 歡2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150010；2.華中師范大學(xué)海南附屬中學(xué)，海南海口 570100)

[目的]為加速玉米秸稈的降解，減輕對(duì)環(huán)境的壓力，篩選玉米秸稈纖維素降解菌系，并使其大量擴(kuò)繁，為玉米秸稈纖維素降解提供菌種資源。[方法]將富集培養(yǎng)的18組菌系以玉米秸稈為限制性因素，在30 ℃搖床馴化至18代酶活穩(wěn)定，篩選出4組酶活較高的菌系，對(duì)優(yōu)良菌系進(jìn)行培養(yǎng)基碳氮源單因素試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化。[結(jié)果]18代時(shí)，菌系3、6、12、16的羧甲基纖維素酶(CMC)酶活力分別為56.35、50.44、49.99、82.40 U/ mL，菌系16的響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源最佳比例為秸稈12.21 g/L、麩皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L時(shí)，酶活力最大為229.68 U/ mL，各因素對(duì)CMC酶活力的影響作用從大到小依次為豆粕、秸稈、麩皮，且秸稈與麩皮交互項(xiàng)對(duì)CMC酶活力的影響最為顯著。[結(jié)論]篩選出的菌系16能加速玉米秸稈的降解，在優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中酶活力較高。

纖維素；菌系；酶活；培養(yǎng)基；響應(yīng)面

我國(guó)玉米秸稈資源豐富，2013年全國(guó)玉米秸稈總量為2.4億余t，居全國(guó)各類農(nóng)作物秸稈量之首[1]。黑龍江省是我國(guó)重要的商品糧基地，農(nóng)作物種植面積0.140億hm2，其中玉米種植面積0.073億hm2，秸稈達(dá)3 600余萬(wàn)t[2]。玉米秸稈纖維素含量高，難降解，大量秸稈資源被廢棄或焚燒，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。纖維素可被某些產(chǎn)纖維素酶的微生物水解生成纖維素二糖或葡萄糖[3]。單菌株酶系單一，酶活力不高，因此篩選高效纖維素降解菌系是解決這一問(wèn)題的有效途徑。筆者以羧甲基纖維素酶(CMC)活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出一組高效纖維素降解菌系，確定其最佳碳氮源配比，以期為菌系大量富集提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 秸稈：取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地。復(fù)合菌系：取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院應(yīng)用微生物研究室。蛋白胨玉米秸稈纖維素培養(yǎng)基：蛋白胨14.0 g，氯化鈉14.0 g，碳酸鈣5.6 g，酵母粉2.8 g，蒸餾水2 800 mL。于121 ℃滅菌30 min。將培養(yǎng)基分裝18個(gè)三角瓶，每瓶裝150 mL，每個(gè)三角瓶中加入3 g秸稈(秸稈分為粗、中、細(xì)3種，先稱總重量54 g,之后將粗、中、細(xì)各分為18份，加入培養(yǎng)基內(nèi)),再于121 ℃滅菌30 min。儀器設(shè)備：恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；分光光度計(jì)，四平電子技術(shù)研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素降解菌系的馴化與篩選。將東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院應(yīng)用微生物研究室富集培養(yǎng)的18組菌系采用蛋白胨玉米秸稈纖維素培養(yǎng)基進(jìn)行定向馴化培養(yǎng)，于第4天測(cè)定各代次CMC酶活力，通過(guò)比較CMC酶活力確定最優(yōu)菌系。

1.2.2 菌系產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化。

1.2.2.1 誘導(dǎo)碳源的優(yōu)化。配置玉米秸稈粉含量為4、8、12、16、20 g/L的培養(yǎng)基，接入復(fù)合菌系發(fā)酵，測(cè)定CMC酶活力，優(yōu)化適宜用量。

1.2.2.2 輔助碳源的優(yōu)化。在確定玉米秸稈粉用量的基礎(chǔ)上，以麩皮為輔助碳源，配置麩皮含量為5、10、15、20、25 g/L的培養(yǎng)基，發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定CMC酶活力，優(yōu)化適宜用量。

1.2.2.3 氮源的優(yōu)化。培養(yǎng)基豆粕粉用量為4、8、12、16、20 g/L，測(cè)定CMC酶活力，優(yōu)化適宜用量。

1.2.2.4 培養(yǎng)基響應(yīng)面的優(yōu)化。為研究碳氮源最適用量及交互組合的最佳配比，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行碳氮源響應(yīng)面優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design(BBD)模型設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，以秸稈(A)、麩皮(B)、豆粕(C)為自變量，以CMC酶活力為唯一響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平

1.2.3 CMC酶活力測(cè)定。

1.2.3.1 CMC酶活力計(jì)算公式。CMC酶活力=葡萄糖用量×稀釋倍數(shù)×5.56/(酶液量×反應(yīng)時(shí)間)

1.2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取8支試管(20 mL)，編號(hào)后加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和蒸餾水，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液(表2)。

表2 葡萄糖溶液的配制

將溶液搖勻后，向各試管加入1 mL NaOH和2 mL 3,5-二硝基水楊酸，搖勻后，沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容，在波長(zhǎng)540 nm處，以1號(hào)試管溶液調(diào)0，測(cè)定其他試管溶液的吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 DNS顯色法測(cè)定CMC酶活力。取20 mL試管，3次重復(fù)，做好標(biāo)記。于5 000 r/min離心25 min，取1 mL到試管中，加入4 mL CMC溶液，于45 ℃水浴保溫15 min,然后加入1 mL NaOH和2 mL DNS。取1個(gè)試管(不加酶液)作為空白對(duì)照，按照上述步驟進(jìn)行。所有試管沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容,于540 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌系的馴化與選育 經(jīng)過(guò)蛋白胨玉米秸稈纖維素培養(yǎng)基18代繼代培養(yǎng)獲得菌系3、菌系6、菌系12、菌系16(圖1)。從圖1可見(jiàn)，4組菌系的CMC酶活力均隨著馴化代次的增加而升高，10代以上的CMC酶活力趨于穩(wěn)定，18代時(shí)菌系3、6、12、16的CMC酶活力分別為56.35、50.44、49.99、82.40 U/mL，較第1代分別提高了39%、30%、28%、64%。由此可知，菌系16為最優(yōu)菌系。

圖1 不同代次菌系的CMC酶活力Fig.1 The CMCase activity of strains at different generations

2.2 菌系產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)碳源玉米秸稈粉對(duì)CMC酶活力的影響。從圖2可見(jiàn)，隨著玉米秸稈粉用量的增加，CMC酶活力呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)玉米秸稈粉為12 g/L時(shí)，CMC酶活力最高，達(dá)到150.89 U/mL；當(dāng)玉米秸稈粉用量大于12 g/L時(shí)，CMC酶活力反而逐漸降低。這可能是由于玉米秸稈粉用量的增加，培養(yǎng)基固形物濃度增大，導(dǎo)致發(fā)酵底物黏度提高，影響溶氧濃度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞和代謝物的擴(kuò)散，不利于微生物生長(zhǎng)，從而使CMC酶活力降低。還可能是因?yàn)橛衩捉斩挿塾昧康脑黾樱瑢?dǎo)致碳氮比值增大，影響微生物的生長(zhǎng)，以致酶活力降低。

圖2 玉米秸稈粉對(duì)菌系16 CMC酶活力的影響Fig.2 Effects of corn straw powder dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.2 輔助碳源麩皮對(duì)CMC酶活力的影響。從圖3可見(jiàn)，隨著麩皮用量的增加，CMC酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)麩皮用量為15 g/L時(shí)，CMC酶活力最高，達(dá)161.91 U/mL；當(dāng)麩皮用量大于15 g/L時(shí)，CMC酶活力反而降低。這與徐海等[4]的研究結(jié)果一致。這是由于麩皮主要成分是淀粉，用量增加，水解產(chǎn)生的還原糖量也相應(yīng)增加，當(dāng)麩皮用量過(guò)大會(huì)對(duì)纖維素酶的形成產(chǎn)生抑制。

圖3 麩皮對(duì)菌系16CMC酶活力的影響Fig.3 Effects of bran dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.3 氮源豆粕對(duì)CMC酶活力的影響。從圖4可見(jiàn)，隨著豆粕用量的增加，CMC酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)豆粕用量為12 g/L時(shí)，CMC酶活力最高，達(dá)190.96 U/mL；當(dāng)豆粕用量大于12 g/L時(shí)，CMC酶活力反而降低。

圖4 豆粕對(duì)菌系16 CMC酶活力的影響Fig.4 Effects of soybean meal dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化。試驗(yàn)包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型方程：R1=+211.170 3+17.743 8A+9.595 9B+33.091 6C+19.954 8AB-6.671 8AC-4.515 5BC-33.442 7A2-36.479 4B2-16.037 9C2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸分析顯示，F(xiàn)模型=13.88，P模型=0.004 9；FA=13.85，PA=0.013 7；FB=4.05，PB=0.100 3；FC=48.16，PC=0.001 0；FAB=8.76，PAB=0.031 5；FAC=0.98，PAC=0.367 9;FBC=0.45，PBC=0.532 8;FA2=22.70,PA2=0.005 0;FB2=27.01,PB2=0.003 5;FC2=5.22,PC2=0.071 1;F失定=9.95,P失擬=0.092 7。菌系16 CMC酶活力模型P=0.004 9,F=13.880 0，P失擬=0.092 7,R2=0.961 5，表明該模型與實(shí)際情況擬合良好，A、C、AB、A2、B2的P<0.05，說(shuō)明這些獨(dú)立項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)菌系16的CMC酶活力的影響顯著。在獨(dú)立項(xiàng)中，A、C的P<0.05，但C的F值最大，P值最小，說(shuō)明在獨(dú)立項(xiàng)中C對(duì)菌系16CMC酶活力發(fā)揮作用最顯著。在交互項(xiàng)中，AB組合P值最小，說(shuō)明AB對(duì)菌系16的CMC酶活力發(fā)揮作用顯著。由此可知，在CMC酶活力響應(yīng)面分析試驗(yàn)中，各變量對(duì)CMC酶活力影響作用由大到小依次為豆粕、秸稈、麩皮。

不同交互項(xiàng)對(duì)菌系16 CMC酶活力影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖5～7。圖5、6是秸稈、麩皮保持固定時(shí)，麩皮和豆粕及秸稈和豆粕交互作用對(duì)CMC酶活力的影響，曲面坡度都較緩，且在回歸分析中交互項(xiàng)的P>0.05，因此豆粕和麩皮及豆粕和秸稈的交互組合CMC對(duì)酶活力的影響不顯著。從圖7可見(jiàn)，豆粕保持固定的情況下，CMC酶活力隨著秸稈與麩皮用量的增加而不斷提高，當(dāng)?shù)竭_(dá)極值之后隨著秸稈與麩皮含量的增加而下降，在回歸分析中，交互項(xiàng)的P<0.05，表明秸稈與麩皮交互組合對(duì)CMC酶活力的影響顯著。

圖5 豆粕與麩皮交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction between soybean meal and wheat bran

圖6 豆粕和秸稈相互作用的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of interaction between soybean meal and straw

利用Design-Expert 8.0.6軟件計(jì)算得到最佳培養(yǎng)基的參數(shù)：秸稈12.21 g/L、麩皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L，CMC

圖7 秸稈和麩皮交互作用的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of interaction between straw and bran

酶活力的預(yù)測(cè)值為229.68 U/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，CMC酶活為229.14 U/mL，相對(duì)誤差為2.364%，表明利用該優(yōu)化方法得到的產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基配方可靠。

3 結(jié)論與討論

(1)該試驗(yàn)富集培養(yǎng)的18組菌系以玉米秸稈為限制性

因素馴化至18代，篩選出4組CMC酶活力較高的菌系。結(jié)果表明，CMC酶活力隨著馴化代次的增加而逐漸提高，10代以上趨于穩(wěn)定，18代時(shí)菌系16的CMC酶活力最高，達(dá)82.40 U/mL。

(2)采用響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果確定最佳碳源、氮源配比為秸稈12.21 g/L、麩皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L，酶活驗(yàn)證值為229.14 U/mL，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.364%，表明試驗(yàn)可靠。各因素對(duì)CMC酶活力的影響從大到小依次為豆粕、秸稈、麩皮，且秸稈與麩皮交互項(xiàng)對(duì)CMC酶活力的影響最為顯著。

[1] 左旭,王紅彥,王亞靜，等.中國(guó)玉米秸稈資源量估算及其自然適宜性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃,2015，36(6):5-10，29.

[2] 遲德龍,劉波.談黑龍江玉米秸稈綜合利用[J].農(nóng)機(jī)使用與維修,2015(7):27-28.

[3] 周俊強(qiáng),邱忠平,韓云平,等.纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶特性[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2010，4(3):705-708.

[4] 徐海,錢衛(wèi),朱明田,等.酸水解麩皮對(duì)斜臥青霉產(chǎn)纖維素酶的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1997(1):15-17.

Screening of Corn Straw Cellulose Degradation Strains and Optimization of Medium Carbon and Nitrogen Source

ZHANG Shu-min, XU Feng-hua*, ZHANG Yun-qi et al

(College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150010)

[Objective] To accelerate the degradation of corn straw, to reduce the pressure on the environment, to screen the corn straw cellulose degradation strains, to provide the strain resources for corn straw cellulose degradation.[Method] The 18 groups of strains cultured in the laboratory were used as the restrictive factors of corn straw.They were domesticated to 18 generation at 30 ℃until the CMCase was reach stable.Four groups with relatively high CMCase activity were screened.Single factor test on medium carbon and nitrogen source was carried out for fine strains.Response surface method was used to optimize the carbon and nitrogen source.[Result] At 18 generation, the CMCase of strains 3, 6, 12 and 16 were 56.35, 50.44, 49.99 and 82.4 U/ mL, respectively.The response surface optimization of strains 16 confirmed carbon and nitrogen optimum ratio of medium were 12.21 g/L straw, 14.53 g/L bran, 12.97 g/L soybean meal, and the maximum of CMCase was 229.678 U/ mL.Factors influencing the CMCase activity was in the order of soybean meal, straw, bran.And bran and straw interaction had the most significant impact on the CMCase.[Conclusion] The strains 16 screened can accelerate the degradation of corn straw, and enhance the CMCase activity in optimized culture medium.

Cellulose; Strains; CMCase activity; Culture medium; Response surface

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD14B06)；哈爾濱市科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014DBD3BN307)。

張書(shū)敏(1992- )，女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)廢棄物無(wú)害化處理與肥料化利用。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

2016-09-15

S 182

A

0517-6611(2016)34-0082-03