曾志燎，鄧清連，茹開卓

（1.深圳市野生動物救護中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

2014—2015年深圳野生鳥類禽流感流行病學監(jiān)測

曾志燎1，鄧清連2，茹開卓1

（1.深圳市野生動物救護中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

為調(diào)查深圳野生鳥類的禽流感感染情況，于2014年1月～2015年4月采集了678只野鳥的569份糞便，62份肛門拭子，26份咽肛拭子和21份血樣。采用病原分離鑒定法、AIV-Ag（通用型）抗原速測卡膠體金法、熒光RT-PCR試驗對樣品拭子進行病原學檢測。采用血凝抑制實驗（HI）對血清樣品進行H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9等5種血清型AIV抗體檢測。結(jié)果顯示：26份咽肛拭子分離出1株H9N2亞型禽流感病毒，陽性率為3.85%；糞便和拭子樣品的抗原檢測全部陰性；血清樣品中H5（Re-4）陽性數(shù)1份，陽性率為9.09%；H9陽性數(shù)7份，陽性率為63.64%；未檢出H5（Re-6）、H5（Re-7）及H7陽性抗體。

野生鳥類；禽流感；流行病學

禽流行性感冒，簡稱禽流感（Avian Influenza，AI），是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一種急性高度接觸性傳染病，其宿主范圍比較廣，包括豬，人，馬，貓科動物，海洋哺乳動物以及幾乎所有的家禽和野生鳥類等[1]。21世紀初，泰國和中國等多個亞洲國家的不同種野生鳥類都曾因為感染禽流感而大批量死亡，并且經(jīng)過病原的分離與鑒定[2]，都為同一個亞型的高致病性禽流感（Highly pathogenic avain influenza，HPAI），而隨后歐洲的部分國家和地區(qū)也相繼爆發(fā)了同一亞型的高致病性禽流感[3]。目前有學者認為野生鳥類有可能是禽流感跨地域傳播的病原攜帶者[4]，因此，進一步了解野生鳥類的禽流感病毒流行情況，有利于禽流感的防控工作。

全球八條候鳥遷徙路線中有三條途徑我國，而深圳正處于“東亞/澳大利亞遷徙線”上。每年的候鳥遷徙之際，深圳地區(qū)將會有成千上萬只野生鳥途徑或者停留補充食材。迄今為止，記錄到的野生鳥類主要有鷺、鷗、雁等389種，分別占全國和全球鳥類的33.33%和3.33%。關(guān)于野生鳥類，我國依舊缺乏有效的免疫以及疫病監(jiān)測措施，本研究于2014年1月-2015年4月對深圳地區(qū)3個鳥類疫病監(jiān)測點（深圳灣公園、鐵崗水庫、海上田園）野鳥、救護基地的678只野鳥禽流感感染和帶毒情況進行了檢測，旨在掌握深圳地區(qū)野生鳥類感染禽流感的情況，進而對禽流感的預防和控制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高速臺式冷凍離心機、PCR儀、熒光PCR檢測儀、微量加樣器、96孔V型微量反應板、組織勻漿器。

1.1.2 實驗試劑 75%乙醇；0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）；H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；阿氏（Alsevers）液；雞紅細胞懸液；AIV標準抗原購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2014年1月至2015年4月從深圳灣公園、鐵崗水庫、海上田園、救護基地及緩沖區(qū)采集鳥糞569份、鳥肛拭子62份、鳥咽肛拭子26份、鳥血清21份（野鳥樣品詳細分類見表1）。

1.2.2 樣品處理 采集的糞便樣品用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）浸泡，4 000 r/min離心15 min后取上清備用。棉拭樣品用含有抗菌素且pH為7.4～7.6的Hanks液浸泡，迅速送達實驗室，通過反復在管壁擠壓棉拭子將病毒液擠壓出，將擠壓后的棉拭子進行無害化處理，為了打碎黏液，應該用無菌的毛細吸管反復吹打擠壓后的溶液。將黏液置于4 ℃待其自然沉淀5～10 min后離心取上清液備用。鳥血樣用霍亂菌培養(yǎng)液等受體破壞酶（RDE）或高碘酸鈉法去除待檢血清中的非特異性凝集抑制因子，按照體積比為4：1加受體破壞酶和待檢血清，37 ℃恒溫水浴16～18 h，然后56 ℃水浴50 min（破壞殘余RDE的活性），4 000 r/min離心后取上清，再加入終濃度為100 mL/L的測定用雞紅細胞懸液，搖勻，4 ℃過夜，1 000 r/min離心5 min，取上清置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 野鳥樣品詳細分類

1.2.3 病毒的分離培養(yǎng) 采集的咽肛拭子先浸在滅菌生理鹽水中，將咽肛拭子在管壁反復擠壓后取出，充分振蕩管中液體，加入適量抗生素，室溫靜置作用30 min，4 000 rpm離心5 min，取上清液，經(jīng)尿囊腔接種9～11 d SPF雞胚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6 d，棄去24 h污染死胚。將死亡或瀕死雞胚置4 ℃ 4 h以上，剖檢，觀察胚胎病變并收獲尿囊液，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA（步驟參照RNA提取試劑盒進行），所有剩余樣品-70 ℃保存。

1.2.4 AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測卡膠體金法

將采集好的肛拭子樣品插入裝有試驗稀釋液的采樣管中，不斷攪拌拭子直至樣品溶解到試驗稀釋液中；用試劑盒配的一次性滴管吸取采樣管中的上清液；加4～5滴到速測卡上的樣品孔中；20～30 min后讀取檢測結(jié)果。

1.2.5 H 5、H 7和H 9亞型禽流感病毒熒光R T-P C R和R T-P C R檢測方法 將采集的5 6 9份糞便處理后樣品參照G B/T 1 9 4 3 8.2-2004《H5亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法》、GB/ T19438.3-2004《H7亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法》和GB/T19438.4-2004《H9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法》進行RT-PCR和熒光RT-PCR檢測。

1.2.6 血凝抑制試驗 HI試驗參照GB/T 18936—2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》進行。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng)結(jié)果

通過對采集的26份咽肛拭子進行SPF雞胚傳代培養(yǎng)病毒分離試驗分離病毒，結(jié)果分離出1株禽流感病毒，經(jīng)HI及測序分析鑒定為H9N2亞型禽流感病毒。

2.2 AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測卡膠體金法檢測結(jié)果

采集的野鳥肛拭子62份通過AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測卡快速檢測方法檢測，結(jié)果均為陰性。

2.3 H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR和RT-PCR檢測結(jié)果

569份糞便處理后的樣品進行熒光RT-PCR檢測H5和H7亞型病毒核酸，結(jié)果均為陰性；通過RTPCR檢測H9亞型病毒核酸，結(jié)果均為陰性。

2.4 野鳥血清中AIV抗體HI試驗檢測結(jié)果

2014年1月～2015年4月采集野鳥血清21份，經(jīng)HI試驗對不同亞型AIV抗體H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9的檢測，在受檢的8種鳥類的21份血清中共檢出兩種不同亞型AIV陽性抗體共8份，陽性率為38.10%。其中，H5（Re-4）陽性數(shù)1份，陽性率為4.76%；H9陽性數(shù)7份，陽性率為33.33%；H5（Re-6）、H5（Re-7）、H7陽性數(shù)均為0。

3 討論

一是禽流感的病原是A型流感病毒，其宿主范圍特別廣，幾乎所有的家禽和野鳥都能感染，據(jù)報道，禽流感的血凝素亞型（H1-H16）和神經(jīng)氨酸酶亞型（N1-N9）都可以在野生鳥類檢測到[5]，且大多數(shù)的HA/NA組合也都能在野生鳥類檢測到。鳥類包括野生鳥類具有遷徙的習性，在遷徙的過程中，都有可能把自身攜帶的禽流感病毒帶至遷徙途徑之地，或者在遷徙逗留的地方攜帶上禽流感病毒，稱為病毒攜帶者，在來年返程的過程中將禽流感病毒帶回，這樣循環(huán)往復的遷徙習性就導致了禽流感病毒的跨地域傳播。而禽流感宿主范圍廣的原因?qū)е铝巳魏蔚囊吧B類都可以成為病原攜帶者，所以，野生鳥類在禽流感的傳播方面有著不可忽視的作用。特別是深圳，深圳處于世界8大鳥類遷徙主要路線的第5條“東亞/澳大利亞遷徙線”上[6]，每年都會有大量的野生鳥類途徑深圳或停留深圳，給深圳地區(qū)的禽流感疫情帶來了潛在的威脅。禽流感病毒的毒型較多，變異也比較迅速、頻繁，低致病性的毒株可以變異為高致病性的毒株[7]，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)都會帶來巨大的經(jīng)濟損失和精神折磨。

二是此調(diào)查研究對深圳地區(qū)的野鳥進行了禽流感疫情的監(jiān)測，通過病毒分離法分離出了一株H9N2亞型的禽流感，說明野鳥中確實存在禽流感病毒。每年的遷徙季節(jié)，都有許多野生鳥類停留在深圳的湖泊，濕地，公園等地方，與湖泊和濕地上的水源以及公園的人群接觸，極有可能成為病毒的傳播者或者攜帶者。在對其進行病原檢測時，檢出率并不高，一方面或許是因為所調(diào)查的深圳地區(qū)的野生鳥類中確實還未存在禽流感病毒攜帶者；另一方面或許是因為這些野生鳥類雖然攜帶有禽流感病毒，但是其處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，還未向外界排毒，所以絕大多數(shù)野生鳥類還檢測不出禽流感病毒，只有個別的野生鳥可以檢測到，但是，即便如此，也不能放松警惕，要時刻做好對野生鳥類禽流感病毒的監(jiān)測，建立一個更加完善的監(jiān)測體系勢在必行。

三是本研究對所采集的21份血樣利用HI試驗對不同亞型AIV抗體{H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9}進行檢測。其中有1份為H5N1（Re-4）亞型AIV抗體陽性，其宿主是紅綠金剛鸚鵡；1份為H9亞型AIV抗體陽性，宿主為雄性環(huán)頸雉；有6份雞血清H9亞型AIV抗體檢測結(jié)果為陽性。利用RTPCR方法檢測相同個體紅綠金剛鸚鵡肛拭子、雄性環(huán)頸雉咽肛拭子及雞咽肛拭子H5、H7、和H9亞型禽流感病毒，結(jié)果均為陰性。分析這些血清中檢測出AIV陽性抗體的原因，經(jīng)查實，這些鳥類并不是完全意義上的野生鳥類，有些是深圳海關(guān)查獲的非法入境的野生動物，有些事在國外經(jīng)人工光飼養(yǎng)出來的，隨著大群的野生鳥類而遷徙，因此，有可能是這些人工飼養(yǎng)的鳥類接種了禽流感疫苗。而禽流感病毒血清抗體檢出率高于病毒檢出率的原因，有可能是因為相比較而言抗體在體內(nèi)存留的時間比病毒存留時間長，所以在血清中檢出禽流感抗體的幾率比在咽肛拭子、糞便中檢出病毒的幾率大。

四是分離出禽流感病毒拭子樣品，用RT-PCR方法檢測結(jié)果是陰性，用雞胚傳代培養(yǎng)病毒分離方法檢測陽性，說明在樣品病毒含量較低的情況下，病毒分離傳統(tǒng)法比RT-PCR方法更靈敏，缺點是實驗周期較長。RT-PCR方法檢測時間短，可批量檢測樣品，適合應用于禽流感樣品日常監(jiān)測。

五是盡管近幾年來從野生鳥類中可分離到高致病力的禽流感病毒，但畢竟甚少，絕大多數(shù)野生鳥類源的流感病毒分離株為無致病力或低致病力病毒亞型，多呈無癥狀隱性感染，長期以來野生鳥類與禽流感病毒形成了相對穩(wěn)定的寄生關(guān)系，因此野生鳥類成為禽流感病毒持續(xù)感染、持續(xù)存在的主要儲存宿主。同國外一些國家相比，國內(nèi)關(guān)于野鳥的禽流感的監(jiān)測與檢測工作起步較晚，野鳥的疫病監(jiān)測體系不夠完善，我國目前迫切需要建立一個完整野鳥禽流感預警預報監(jiān)測體系。

[1]成進，沙依蘭古麗，夏俊，等.2009年～2011年新疆雁形目野生鳥類禽流感血清流行病學調(diào)查與分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，（12）：3-6.

[2]何維明，高玉鵬，姜艷芬，等.禽流感流行病學調(diào)查及病原分離鑒定初報[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2001，（3）：16-19.

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（編輯：李善祥）

S858.9

B

1006-799X(2016)20-0087-03

曾志燎（1985-），男，廣東河源人，獸醫(yī)師，主要從事野生動物救護及野生動物疫源疫病監(jiān)測工作。