張術(shù)戀，楊梅松竹，楊 瀚，白 霞，吳 丹

（吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000）

高濃度葡萄糖對人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響*

張術(shù)戀，楊梅松竹△，楊 瀚，白 霞，吳 丹

（吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000）

目的探討高濃度葡萄糖（高糖）對人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法體外培養(yǎng)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞，在不同濃度葡萄糖（5.5、11.0、22.0 mmol/L）培養(yǎng)基進(jìn)行處理，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）檢測SGC-7901細(xì)胞的增殖率，采用劃痕實(shí)驗檢測SGC-7901細(xì)胞的遷移指數(shù)（MI），采用Transwell實(shí)驗檢測SGC-7901細(xì)胞的侵襲力。結(jié)果24、48、72 h各時間點(diǎn)5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組光密度值均有不同程度上升，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），隨葡萄糖濃度的增高和作用時間的延長，SGC-7901細(xì)胞增殖率逐漸增大。5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組24 h MI分別為 0.394±0.058、0.510±0.044、0.615± 0.039，48 h MI分別為0.548±0.058、0.685±0.009、0.782±0.038；隨葡萄糖濃度的增高和作用時間的延長，SGC-7901細(xì)胞MI逐漸增大，22.0、11.0mmol/L葡萄糖組明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組的穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（45±5）、（71±4）、（90±10）個，隨葡萄糖濃度的增高，發(fā)生侵襲的SGC-7901細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論高糖環(huán)境可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞遷移、侵襲能力。

胃腫瘤； 比色法； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞運(yùn)動； 腫瘤侵潤； 葡萄糖； 培養(yǎng)基

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤總發(fā)病率的10%，死亡率的8%[1]。胃癌被認(rèn)為是一種多因素疾病，其發(fā)生與多種病因有關(guān)。近年來，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病與腫瘤之間存在密切聯(lián)系[2-3]。有相關(guān)研究顯示，糖尿病或高濃度葡萄糖（高糖）對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后等產(chǎn)生一定的影響[4]，其中包括胃癌相關(guān)物質(zhì)代謝、耐藥性、患者生存率等方面的研究[5-7]，但糖尿病或高糖與胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的研究甚少。本研究通過體外實(shí)驗，探討高糖對人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為闡明高糖與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗室細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑 胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），無糖型RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），葡萄糖、甘露醇（石藥銀湖制藥有限公司），青-鏈霉素溶液、胰酶細(xì)胞消化液[賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司]，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（江蘇碧云天生物科技有限公司），Transwell小室（康寧公司），matrigel基質(zhì)膠（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗分組及細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)[8]應(yīng)用5.5、11.0、22.0 mmol/L 3種葡萄糖濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行處理。其中5.5 mmol/L代表生理葡萄糖濃度，11.0、22.0 mmol/L代表高糖濃度。SGC-7901細(xì)胞使用含10%胎牛血清、葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.2.2 MTT實(shí)驗檢測 SGC-7901細(xì)胞增殖情況 將SGC-7901細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔細(xì)胞濃度為5×104mL-1，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。每組設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組。分別用不同因素處理，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。每孔加入20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加200μL二甲基亞砜，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀490nm波長測定光密度（OD）值，計算各組細(xì)胞的增殖率，細(xì)胞增殖率=（處理組/對照組-1）×100%。

1.2.3 劃痕實(shí)驗檢測 SGC-7901細(xì)胞遷移能力 將SGC-7901細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔細(xì)胞濃度為1×106mL-1，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞長滿后，用10 μl Tip頭在培養(yǎng)板底部劃痕，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗掉脫落細(xì)胞，測量劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距，拍照并記為0 h。加入不同因素處理后繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48 h測量并拍照。計算遷移指數(shù)（MI），MI=1-各時間點(diǎn)劃痕距離/0 h劃痕距離。

1.2.4 Transwell實(shí)驗檢測SGC-7901細(xì)胞侵襲情況 將Matrigel膠稀釋鋪于Transwell板上層小室內(nèi)，SGC-7901細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液接種于上室內(nèi)，每孔細(xì)胞濃度為1×105mL-1，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。分別于下室中加入不同處理因素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用棉簽擦拭掉上室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野拍照并計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用重復(fù)測量方差分析或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗結(jié)果顯示，24、48、72 h各時間點(diǎn)5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組的OD值均有不同程度上升，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組與5.5 mmol/L葡萄糖組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的增高和作用時間的延長，SGC-7901細(xì)胞增殖率逐漸增大。見表1、圖1。

2.2 高糖對SGC-7901細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗結(jié)果顯示，5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組24 h平均MI分別為0.394±0.058、0.510±0.044、0.615±0.039，48 h分別為0.548±0.058、0.685±0.009、0.782±0.038。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增高和作用時間的延長，SGC-7901細(xì)胞MI逐漸增大，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組與5.5 mmol/L葡萄糖組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、3。

表1 高糖對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（n=3）

圖1 高糖對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（n=3）

圖2 高糖對SGC-7901細(xì)胞遷移的影響（n=3）

2.3 高糖對SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響 Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示，5.5、11.0、22.0 mmol/L葡萄糖組的平均穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（45±5）、（71±4）、（90±10）個，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增高，發(fā)生侵襲的SGC-7901細(xì)胞數(shù)量顯著增加，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組與5.5 mmol/L葡萄糖組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖3 高糖對SGC-7901細(xì)胞遷移的影響（n=3）

圖4 高糖對SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響（n=3）

圖5 高糖對SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響（n=3）

3 討 論

糖尿病已成為嚴(yán)重危害人類健康的全身性代謝疾病，其患病率呈逐年上升趨勢[9]。流行病學(xué)調(diào)查表明，糖尿病或高糖可增加機(jī)體罹患結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮癌、乳腺癌等腫瘤的風(fēng)險[10-11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病是胃癌的危險因素之一[12-13]，糖尿病患者胃癌的發(fā)生率顯著高于健康人群[14]。增殖、遷移、侵襲能力是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究檢測高糖環(huán)境下人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)特性的變化。

研究表明，高糖環(huán)境下，胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖能力明顯增加，其機(jī)制可能是高糖通過增加胃癌細(xì)胞的熱能產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝[15]。高糖作用24、48、72 h均可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，作用72h時細(xì)胞增殖率明顯高于對照組[16]。Zhao等[17]在高糖條件下胃癌對化療耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)，高糖條件可促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并降低對化療藥物的敏感性。隨著葡萄糖濃度的升高，5-氟尿嘧啶對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率逐漸下降，尤其以高濃度組（9000mg/L）效果最明顯[18]。本研究中，MTT實(shí)驗顯示，24、48、72 h各時間點(diǎn)22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組的OD值均明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組。隨葡萄糖濃度從5.5 mmol/L升高至22.0 mmol/L，SGC-7901細(xì)胞24 h增殖率由22.31%上升至33.16%，48 h增殖率由23.96%上升至38.31%，72 h增殖率由27.74%上升至47.08%，表明高糖條件可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖，與上述文獻(xiàn)報道相似。

惡性腫瘤的一個顯著特征是具有遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖通過上調(diào)水通道蛋白3的表達(dá)促進(jìn)胃癌MGC-803、SGC-7901細(xì)胞遷移，從而調(diào)控胃癌惡性進(jìn)展[19]。高糖能夠通過上調(diào)人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和MMP-2的表達(dá)、下調(diào)上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲能力[20]。本研究應(yīng)用劃痕實(shí)驗檢測高糖環(huán)境下SGC-7901細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果顯示，隨葡萄糖濃度從5.5 mmol/L升高至 22.0mmol/L，SGC-7901細(xì)胞24 h MI由0.394± 0.058上升至0.615±0.039，48 h MI由0.548±0.058上升至0.782±0.038，各時間點(diǎn)22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組MI均明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組，表明高糖條件可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的提高。Transwell實(shí)驗顯示，24h時穿膜細(xì)胞數(shù)量由5.5mmol/L葡萄糖組的（45±5）個上升至22 mmol/L葡萄糖組的（90±10）個，22.0、11.0 mmol/L葡萄糖組的穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯高于5.5 mmol/L葡萄糖組，SGC-7901細(xì)胞侵襲能力隨著葡萄糖濃度的增高而上升，高糖條件可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的提高。

綜上所述，高糖環(huán)境可促進(jìn)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞遷移、侵襲能力，為說明高糖促進(jìn)胃癌發(fā)生及進(jìn)展提供了實(shí)驗依據(jù)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Effects of high glucose on proliferation，migration and invasion of gastric gland carcinoma SGC-7901 cells*

Zhang Shulian，Yang Meisongzhu△，Yang Han，Bai Xia，Wu Dan
（Medical College of Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of high glucose on the proliferation，migration and invasion of gastric gland carcinoma SGC-7901 cells.MethodsSGC-7901 cells were cultured in vitro and treated by medium at different glucose concentrations of 5.5，11.0，22.0 mmol/L.MTT method was applied to detect the proliferation rate，the scratch test was performed to test the migrate index（MI），and the Transwell test was used to evaluate the invasiveness.ResultsThe optical density（OD）values were increased in each time point（24，48，72 h）and each glucose group（5.5，11.0，22.0 mmol/L）.The OD values in 24，48，72 h in the 22.0，11.0 mmol/L glucose groups were obviously higher than those in the 5.5 mmol/L glucose group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.With the glucose concentration increase and action time prolongation，the SGC-7901 cell proliferation rate was increased gradually.The 24 h MI in the 5.5，11.0，22.0 mmol/L glucose groups were 0.394±0.058，0.510± 0.044 and 0.615±0.039 respectively，and the 48 h MI were 0.548±0.058，0.685±0.009 and 0.782±0.038 respectively.With the glucose concentration increase and action time prolongation，the SGC-7901 cell MI was increased gradually.The MI in the 22.0，11.0 mmol/Lglucose groups were obviously higher than those in the 5.5mmol/L glucose group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The numbers of transmembrane cells in the 5.5，11.0 and 22.0 mmol/L glucose groups were 45±5，71±4 and 90±10 respectively.With the increase of glucose concentration，the invasive SGC-7901 cells number was increased gradually.The invasive cells number in the 22.0 and 11.0 mmol/L glucose groups were obviously higher than those in the 5.5 mmol/L group glu cose group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe high glucose environment could promote the proliferation of SGC-7901 cells，and improve their migration and invasion abilities.

Stomach neoplasms； Colorimetry； Cell proliferation； Cell movement； Neoplasm invasiveness；Glucose； Culture media

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.009

：A

：1009-5519（2016）24-3767-03

2016-10-28）

吉首大學(xué)2013年大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗計劃項目（JSU-CX-2013-29）；吉首大學(xué)2013年度校級科研項目（13JDX009）；2014年度湖南省衛(wèi)生廳科研基金項目（C2014-14）。

張術(shù)戀（1993-），本科，主要從事臨床醫(yī)學(xué)工作。

△通訊作者，E-mail：yangmeisongzhu@163.com。