張傳志曹洪輝 李修建 蔡 明 周 庾 胡曉波 盧衛(wèi)忠 張?zhí)?/p>

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400016）

·研究報(bào)告·

淫羊藿苷/殼聚糖/血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料治療兔橈骨骨缺損療效的實(shí)驗(yàn)研究*

張傳志△曹洪輝 李修建 蔡 明 周 庾 胡曉波 盧衛(wèi)忠 張?zhí)?/p>

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400016）

目的觀察淫羊藿苷/殼聚糖/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料提高骨缺損愈合的療效。方法

淫羊藿苷 富血小板血漿 生長(zhǎng)因子 骨缺損 骨修復(fù)

骨缺損指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)、以及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因。典型的缺損局部臨床表現(xiàn)，結(jié)合X線檢查，即可明確診斷［1］。盡管骨折治療的方式與方法有較大的進(jìn)步，但是骨缺損的發(fā)生頻率仍然較高。骨缺損是臨床治療中的一個(gè)棘手問(wèn)題和挑戰(zhàn)，往往給患者及社會(huì)帶到沉重負(fù)擔(dān)。促進(jìn)骨缺損修復(fù)，從而縮短臨床治療時(shí)間和保留患者肢體功能，避免和減少勞動(dòng)力喪失，降低醫(yī)療費(fèi)用等均具有重要意義。研究表明血小板血漿（PRP）、中藥淫羊藿苷能夠促進(jìn)骨修復(fù)［2-3］，復(fù)合兩種物質(zhì)是否更進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)效應(yīng)及是否可行尚未見(jiàn)報(bào)道。我們推測(cè)，如果能夠通過(guò)工程技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建殼聚糖富血小板血漿載藥微球和淫羊藿苷羥基磷灰石支架，同時(shí)實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子和中藥淫羊藿局部緩放釋放，可能更有效影響骨缺損的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)基于上述設(shè)想，通過(guò)構(gòu)建淫羊藿苷/血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA），并且移植入骨缺損模型局部，通過(guò)常規(guī)X線攝片、組織形態(tài)光學(xué)檢查及生物力學(xué)試驗(yàn)等方法檢測(cè)EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料對(duì)兔骨缺損修復(fù)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 由動(dòng)物購(gòu)買于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。選取健康新西蘭大白兔48只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雄性，普通級(jí)飼養(yǎng)。所有兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組16只：模型組（行骨缺損手術(shù)）；PRP/CS/HA組（行骨缺損手術(shù)，植入微球羥基磷灰石復(fù)合材料）；EP/ PRP/CS/HA組（行骨缺損手術(shù)，植入淫羊藿苷微球羥基磷灰石復(fù)合材料）；術(shù)后均觀察共12周。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)重慶市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范及指南進(jìn)行。所有動(dòng)物均給予人文關(guān)懷。

1.2 儀器與試劑 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康FD-1A-80；恒溫震蕩機(jī)，萬(wàn)合儀器THZ-D；萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，上海企想檢測(cè)儀器有限公司QX-W600；切片機(jī)，德國(guó)SLEE冷凍切片機(jī)MNT；倒置光學(xué)顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器廠XDS-200C；X線機(jī)，北京島津醫(yī)療有限公司BR-120M。羥基磷灰石，Amresco，上海信裕生物科技有限公司；殼聚糖，MERCK MILLIPORE，上海鈺博生物科技有限公司；淫羊藿苷，Amresco，上海信裕生物科技有限公司；乙酸，重慶齊星化工；2%NaOH，重慶齊星化工；無(wú)水酒精，重慶齊星化工；水合氯醛，重慶齊星化工；Span80，天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；異丙醇，重慶齊星化工；無(wú)水乙醚，重慶齊星化工；華創(chuàng)防AO鋼板，廣州華正醫(yī)療；五水頭孢唑啉，深圳華潤(rùn)九新藥業(yè)有限公司；EDTA，重慶齊星化工；多聚甲醛，重慶齊星化工；二甲苯，重慶齊星化工。

1.3 材料制備與模型構(gòu)建 1）EP/CS/HA復(fù)合支架材料。精確稱量HA、CS（HA∶CS）的比例5∶5質(zhì)量比）的粉體后，放入盛有淫羊藿溶液（淫羊藿的質(zhì)量占總質(zhì)量的10%）的燒杯中，加入一定量蒸餾水，使有機(jī)相濃度介于2.5%~10%（W/V）之間，再加入一定量的乙酸溶液，使CS充分溶解。將該混合物于40℃水浴中充分?jǐn)嚢璩扇橐籂詈螅暡ㄌ幚硐龤馀?。將此乳液傾入金屬模具（Φ4 mm×15 mm），在4℃的冰箱中冷藏過(guò)夜，然后分別在-20℃、-80℃下預(yù)冷凍48 h后，真空冷凍干燥48 h，得EP/CS/HA復(fù)合支架材料。用含2%NaOH的乙醇溶液浸泡2 h中和乙酸，蒸餾水沖洗，二次冷凍干燥后備用［4］。所有支架材料均采用20 kGy60Co輻照滅菌消毒標(biāo)記備用。2）富血小板血漿微球（CS-PRP）構(gòu)建。采用水合氯醛腹腔注射的方法進(jìn)行麻醉 （10%，400 mg體質(zhì)量）。先給予總量的2/3，根據(jù)麻醉效果追加麻藥。麻醉成功后兔取俯臥位，四肢綁縛固定。備皮消毒，從兔耳中央動(dòng)脈抽取5 mL血，裝在預(yù)先放有0.5 mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的10 mL離心管中，參照文獻(xiàn)［5］法進(jìn)行PRP提?。簩⑿迈r血分2次離心，第1次離心200 g×10 min，吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至另一離心管，平衡后再次離心200 g× 10 min，此時(shí)離心管中液體分為兩層，吸取約3/4上清液棄掉，搖勻剩余液體，即為PRP（約0.5 mL），搖勻，備用。將殼聚糖溶于5%的醋酸溶液中，得到3%的殼聚糖溶液；PRP加入3%的殼聚糖溶液10 mL中并充分?jǐn)嚢瑁w積比1∶1），制成殼聚糖/PRP混合液。在500 mL燒杯中加入100 mL無(wú)菌液體石蠟，1 mL Span80，一定速度磁攪拌下逐滴加入殼聚糖/PRP混合液10 mL，使水油比達(dá)到1∶10，常溫下攪拌，乳化15 min。反應(yīng)完成用3號(hào)砂芯漏斗真空抽濾，用異丙醇、無(wú)水乙醚反復(fù)沖洗，靜置備用。制作過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。3）淫羊藿苷/殼聚糖/血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/ CS/HA）構(gòu)建。將富血小板血漿微球（CS-PRP）置入一定量PBS緩沖液中，淹沒(méi)Ep/CS/HA復(fù)合支架材料，恒溫勻速震蕩1 h備用。

1.4 手術(shù)方法 按照參考文獻(xiàn)［6］的方法建立兔橈骨骨缺損模型。實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)分組，所有兔手術(shù)操作都是由有經(jīng)驗(yàn)的骨科醫(yī)生在無(wú)菌環(huán)境下完成。腹腔內(nèi)注射注射用五水頭孢唑啉（按100 mg/kg給予）。備皮，碘伏消毒，鋪巾。以兔雙側(cè)橈骨中分為中心做約6 cm的縱向背側(cè)切口。逐層解剖暴露橈骨。根據(jù)兔橈骨“s”形將6孔鋼板（華創(chuàng)仿AO寵物用鋼板）塑形貼伏滿意后將鋼板置入背外側(cè)，依次于遠(yuǎn)近兩端鉆孔測(cè)深，遠(yuǎn)端1枚螺釘初步固定鋼板不鎖緊，將鋼板向下移開(kāi)，于遠(yuǎn)近螺釘孔等距用線鋸截骨，斷端間截骨長(zhǎng)度1.5 cm，并注意去除截骨邊緣骨膜組織和橈尺骨間膜。將鋼板復(fù)位，逐一安放螺釘，骨缺損模型完成。根據(jù)試驗(yàn)分組于左側(cè)植入EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料或PRP/CS/HA復(fù)合材料；右側(cè)空白對(duì)照。依次縫合肌肉，皮膚。術(shù)后次日，第3日再次給予相同劑量五水頭孢唑啉2次。傷口換藥每2日1次。

1.5 術(shù)后常規(guī)觀察 1）術(shù)后常規(guī)觀察新西蘭兔在手術(shù)后的進(jìn)食多少、傷口感染或愈合等情況。2）X線攝片檢查。第12周時(shí)間點(diǎn)，A組、B組、C組麻醉下進(jìn)行x線檢查（52 kV，1.4 mAs），并根據(jù)結(jié)果對(duì)不同分組骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行研判。3）生物力學(xué)檢測(cè)。10%水合氯醛麻醉，空氣栓塞法處死兔后取橈骨全長(zhǎng)，剔除所有軟組織并去除鋼板螺釘，采用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定骨痂進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)。隨機(jī)選取3個(gè)組的6個(gè)骨樣本。4）組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。取3組骨痂置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。進(jìn)一步使用10%EDTA脫鈣處理，以達(dá)到針刺入效果為準(zhǔn)。后繼使用70%，80%，70%，90%，95%，100%酒精梯度脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明處理后，然后石蠟包埋，按層厚100 μm切片。石蠟切片用VG染色、H&E染色與三色染色后，普通倒置顯微鏡下觀察（100×）。通過(guò)HE組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)檢測(cè)方法，以評(píng)估不同療效。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（s）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)飲食、傷口感染情況的影響 所有術(shù)后感染發(fā)生在術(shù)后3 d至1周出現(xiàn)感染。模型組感染數(shù)為5例，陰性數(shù)為11例，感染率為45.5%。PRP/CS/HA為感染數(shù)為3例，陰性數(shù)為13例，感染率為23.0%。EP/PRP/ CS/HA感染數(shù)為1例，陰性數(shù)為15例，感染率為6.3%。EP/PRP/CS/HA組感染率與模型組、PRP/CS/HA組相比較，感染率明顯降低（P＜0.01），所有感染動(dòng)物剔除實(shí)驗(yàn)。

2.2 術(shù)后12周影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果 12周時(shí)，X線提示模型組：斷端間有低信號(hào)組織生長(zhǎng)，形態(tài)欠規(guī)則；PRP/ CS/HA組有較多骨痂生長(zhǎng)，骨折線稍模糊，但骨痂密度較正常骨結(jié)構(gòu)偏低，無(wú)明顯塑形改建表現(xiàn)；Ep/PRP/ CS/HA組則顯示骨痂生長(zhǎng)良好，斷端間骨折線消失，可見(jiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

圖1 X線片觀察不同組間骨折愈合情況

2.3 術(shù)后12周組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 A組 可見(jiàn)較多脂肪組織和纖維組織結(jié)果，少許骨性組織。B組較多骨痂形成。 C組可見(jiàn)較多骨痂形成，排列較為緊密，骨痂成同向排列。

圖2 HE染色觀察不同組間骨折愈合情況（染色，倍數(shù)）

2.4 生物力學(xué)結(jié)果 所有測(cè)定標(biāo)本均從橈骨缺損中間部位斷裂，斷端不整齊。生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大抗壓強(qiáng)度PRP/CS/HA組為 （88.83±2.32）Mpa，與EP/PRP/CS/HA組的（95.67±3.83）Mpa間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和模型組的（4.86±1.02）Mpa差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PRP/CS/HA組的斷裂彎曲度為（2.05±0.24）mm，與 EP/PRP/CS/HA組的（2.92± 0.38）mm間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和模型組的（1.56±0.33）mm差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。說(shuō)明B、C組均能促進(jìn)骨修復(fù)和重塑，從而提高抗彎曲力度。

3 討 論

骨缺損在臨床診療中常常面臨可供骨移植材料不夠、患處成骨能力下降的困境，如何在提供有效的容易來(lái)源的骨移植材料并提高成骨能力是擺在所有醫(yī)務(wù)人員面前的難題。由于骨缺損的修復(fù)需要有移植材料相容性同時(shí)具有骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及骨祖細(xì)胞，如果一種移植復(fù)合物結(jié)合了全部三種骨再生所需要的成分，可望為骨缺損治療帶來(lái)莫大好處。目前，傳統(tǒng)吻合血管的自體/異體骨移植、人工合成替代物移植等多種方法成為臨床常用的骨缺損修復(fù)技術(shù)［7］。但是這些視為金標(biāo)準(zhǔn)的方法應(yīng)用過(guò)程中存在重大缺陷，如易出現(xiàn)并發(fā)癥的供骨區(qū)、有限的供體來(lái)源、而無(wú)活性的異體骨雖然不受數(shù)量的限制，但是存在排異和傳染疾病的可能。近年，骨組織工程技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究給骨缺損的治療帶來(lái)無(wú)限發(fā)展前景。這些組織工程技術(shù)包括多種生物元素，如骨傳導(dǎo)性支架、緩釋誘導(dǎo)成骨生長(zhǎng)因子、負(fù)載具有成骨潛能的細(xì)胞以及組織工程骨血管化或充足的血供等［8-12］?？梢?jiàn)，組織工程技術(shù)成為修復(fù)骨缺損的趨勢(shì)，積極開(kāi)發(fā)與研究不同因素的治療技術(shù)成為骨缺損治療的重要內(nèi)容。

骨感染一直是骨科的重要難題，常常同時(shí)并存骨缺損。若能控制感染同時(shí)實(shí)現(xiàn)骨缺損的修復(fù)可以大大減少患者肢體功能受限的時(shí)間和減少醫(yī)療費(fèi)用。淫羊藿苷是提取自小窠科植物中藥淫羊蕾的天然黃酮類化合物，是淫羊藿的主要生物活性成分。系列研究表明淫羊藿苷具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗抑郁、抗炎等作用。劉天明等研究表明淫羊藿苷能夠提高金黃色葡萄球菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，提高淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期的百分率，促進(jìn)淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-10的分泌，對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用［13］。本研究中因手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，3組兔均發(fā)生不同程度的術(shù)后感染，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的Ep/PRP/CS/HA復(fù)合移植物在術(shù)后感染較其他組明顯減低。考慮該移植物緩慢釋放的淫羊藿苷通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，一定程度上抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而減低了術(shù)后感染，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主骨；肝藏血，主筋。精血互生、肝腎同源，筋骨相連、肝腎同治并補(bǔ)，可使精充血旺、骨健筋強(qiáng)。腎有掌控骨骼生長(zhǎng)的功能，腎精充足，那么人的骨質(zhì)就會(huì)得到很好的滋養(yǎng)，骨骼發(fā)育就好，骨質(zhì)就致密；如果腎精不足，那么骨骼就失去滋養(yǎng)。淫羊藿性溫，味辛，歸肝腎兩經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕之功，是常用中藥。《本經(jīng)》曰“主陰痿絕傷，莖中痛。利小便，益氣力，強(qiáng)志”?！度杖A子本草》言“治一切冷風(fēng)勞氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力，丈筋骨攣急，四肢不任”。文獻(xiàn)研究表明，淫羊藿可以有效影響兔頜骨骨缺損的愈合時(shí)期［14］。淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞調(diào)亡的影響有明顯作用［15］。中藥淫羊藿苷可以有效影響干預(yù)人工關(guān)節(jié)磨損微粒誘導(dǎo)的骨溶解現(xiàn)象［16］，說(shuō)明中藥淫羊藿苷可能有效影響骨代謝、骨修復(fù)過(guò)程，目前推測(cè)其機(jī)理為調(diào)整下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能，并呈現(xiàn)性激素作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)酶、激素水平，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成等。

生長(zhǎng)因子對(duì)成骨細(xì)胞分化增殖有重要調(diào)節(jié)作用，如BMP、TGF-β、bFGF、IGF、PDGF等，但目前多為單一生長(zhǎng)因子作用觀察，部分研究［17］嘗試聯(lián)合兩種以上生長(zhǎng)因子進(jìn)行研究，均證實(shí)生長(zhǎng)因子不同程度上促進(jìn)了骨修復(fù)。但是，體內(nèi)骨修復(fù)過(guò)程中多種生長(zhǎng)因子序貫、長(zhǎng)程作用卻成為當(dāng)前認(rèn)為是促進(jìn)骨修復(fù)的關(guān)鍵因素。因此，如何改變當(dāng)前的單一生長(zhǎng)因子的作用，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子長(zhǎng)時(shí)間，模仿機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)因子作用模式仍是組織工程困難所在，也是目前組織工程研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。富含血小板血漿（PRP）是自體源性、濃縮的含血小板的血漿，是全血經(jīng)過(guò)分離而得到的血小板濃縮物。在PRP形成富含血小板凝膠（PRG）的過(guò)程中，血小板通過(guò)脫顆粒作用釋放血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2、IGF、表皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，其濃度約為體內(nèi)正常濃度的3~8倍。因此研究人員［18-20］嘗試將PRP復(fù)合到各種支架載體上探討骨修復(fù)，取得一定成果，如鐘達(dá)將PRP和支架復(fù)合后證實(shí)成骨效應(yīng)類似自體髂骨［21］，許永偉利用殼聚糖制備PRP載藥微球，獲得了生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)程釋放并促進(jìn)頜骨缺損的修復(fù)［22］。

如果構(gòu)建一種復(fù)合移植材料，同時(shí)實(shí)現(xiàn)中藥淫羊藿苷和生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)程作用，可能有望明顯促進(jìn)骨的修復(fù)重建。本研究表明，Ep/PRP/CS/HA復(fù)合移植物在兔骨缺損模型12周時(shí)影像學(xué)檢查提示骨痂生長(zhǎng)良好，骨折線模糊消失，骨小梁顯現(xiàn)，組織學(xué)檢查提示骨成熟度較高，術(shù)后12周的抗壓強(qiáng)度相比PRP/CS/HA及模型組更強(qiáng)，斷裂彎曲度比后兩者更大，具有良好的力學(xué)特征，提示該復(fù)合材料實(shí)現(xiàn)了上述成分的緩釋和長(zhǎng)程作用。該新方法有望為骨缺損修復(fù)提供手術(shù)中的理想支架材料，但修復(fù)材料在血管化和骨爬行替代并在新的力學(xué)環(huán)境中逐漸適應(yīng)自身改造后骨的生物力學(xué)性能才會(huì)得到明顯改善，所以該材料的血管化及骨再生過(guò)程等問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。其次，中藥淫羊藿苷成分非單一成分，構(gòu)建支架中如何選擇使用劑量保證不出現(xiàn)副作用仍需進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究說(shuō)明Ep/PRP/CS/HA復(fù)合材料能夠減少骨缺損感染率，提高骨缺損修復(fù)。結(jié)合中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)代西醫(yī)的研究成果，進(jìn)行組織工程移植物的構(gòu)建可能是未來(lái)的可行發(fā)展方向。但是這種局部應(yīng)用的副作用及不足之處，仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

［1］ 金黎明，劉萬(wàn)順，韓寶芹.骨缺損治療方法的研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（1）：144-146.

［2］ Okuda K，Kawase T，Momose M，et al.Platelet-Rich plasma contains high levels of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-beta and modulates the proliferation of periodongtally related cell in vitro［J］.J Periodontol，2003，74（6）：849.

［3］ Jian Huang，Lan Yuan，Xi Wang，et al.Icariin and its glycosides enhance osteoblastic，but suppress osteoclastic，differentiation and activity in vitro［J］.Life Science，2007，87：832-840.

［4］ 吳濤，南開(kāi)輝，陳景帝，等.可控釋淫羊藿苷的仿生組裝骨誘導(dǎo)修復(fù)材料［J］.科學(xué)通報(bào)，2009，54（9）：1198-1206.

［5］ Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation［J］.J Oral Maxillofac Surg，2000，58（3）：297-300.

［6］ 覃昱，裴國(guó)獻(xiàn)，金丹，等.帶血供肌瓣復(fù)合BMP微球修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2004，22（60）：656.

［7］ 黃永棟，姜衛(wèi)平.骨缺損的臨床治療進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（13），1984-1986.

［8］ Ehrler DM，Vaccaro AR.The use of allograft bone in lumbar spine surgery［J］.Clin Orthop，2000，89（371）：38-45.

［9］ 楊志明，黃富國(guó)，秦廷武，等.生物衍生組織工程骨植骨的初步臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16（5）：311-314.

［10］陳偉良，藕小平，王建廣，等.人頜骨骨膜成骨細(xì)胞復(fù)合異體部分脫鈣骨的成骨實(shí)驗(yàn)研究［J］.口腔頜面外科雜志，2004，14（2）：112-114.

［11］牛玉梅，陳野，李艷萍.犬自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)HA-TCP修復(fù)牙槽骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2012，28（1）：9-11.

［12］楊為中，周大利，尹光福.磷酸鈣/BMP復(fù)合生物活性骨水泥水化性能及誘導(dǎo)成骨特性研究［J］.無(wú)機(jī)材料學(xué)報(bào)，2005，20（5）：1174-1180.

［13］劉天明.淫羊藿苷對(duì)體外金黃色葡萄球菌感染小鼠巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)［J］.飼料研究，2016，39（7）：40-44.

［14］裴玉巖，劉繼光，李凌志，等.淫羊藿對(duì)骨質(zhì)疏松家兔頜骨骨缺損愈合的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（1）：93-94.

［15］張立娟，雷濤，張秀珍.淫羊藿對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，29（1）：30-34.

［16］王俊，朱旭日，張超，等.中藥淫羊藿苷干預(yù)人工關(guān)節(jié)磨損微粒誘導(dǎo)的骨溶解［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18（17）：2625-2631.

［17］左愛(ài)軍，梁東春，王寶利，等.rhBMP-2對(duì)殼聚糖復(fù)合成骨細(xì)胞后的成骨活性影響［J］.中國(guó)生物工程雜志，2006，26（5）：33-37.

［18］Pieri F，Lucarelli E，Corinaldesi G，et al.Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the healing of standardized bone defects in the alveolar ridge：a comparative histomorphometric study in minipigs［J］.J Oral Maxillofac Surg，2009，67（2）：265-272.

［19］Howes R，Bowness JM，Grotendorst GR，et al.Platelet-derived growth factor enhances demineralized bone matrix-induced cartilage and bone formation［J］.Calcif Tissue Int，1988，42（1）：34-38.

［20］黃愛(ài)文，金丹，裴國(guó)獻(xiàn).復(fù)合PRP的可注射型組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（14）：1374-1377.

［21］鐘達(dá).強(qiáng)化磷酸三鈣/富血小板血漿凝膠復(fù)合支架材料的制備及在體內(nèi)成骨的研究［D］.長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2008.

［22］許永偉，周永勝，馮海蘭.緩釋人富血小板血漿生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的制備［J］.口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志，2010，11（3）：139-141.

An Experimental Study on the Efficacy of Combined Graft（Epimedium-Chitosan-Hydroxyapatite Loaded with Platelet Rich Plasma Microspheres）on Bone Defect Formation

ZHANG Chuanzhi，CAO Honghui，LI Xiujian，et al. Department of Orthopaedics，Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400016，China.

Objective：To study the efficacy of using combined graft（epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）for bone defect repairing.Methods：48 New Zealand white rabbits with radius bone defect were randomly divided into three groups：Group A：blank control group：bone defect operation；Group B：combined graft group（chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）；Group C：（Epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）.All animals were fixed with plate.Bone repairing efficacy was assessed by hematoxylin eosin histology，X-ray radiography and biomechanical testing methods in 12 weeks after operation.Results：Compared with Group A，X ray showed fracture line began to blur with increased callus（woven bone）in the 12th week in experimental group B and bone fracture line blurred with increased mature stage callus in group C.The postoperative infection rate was lower in group C and had significant difference as compared with the former two groups（P<0.01）.Biomechanical testing showed increased callus bending strength in both group B and group C as compared with group A with statistical significant difference.There were no statistical significant difference between group B and C.Hematoxylin eosin histology showed mainly fibrous connective tissue in group A while massive bone tissue formed in group B and C with mature stage bone tissue in group C.Conclusion：The combined graft（epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）is expected to be a possible method in bone defect treatment as it shows enhanced bone repairing.

Epimedium；Platelet-rich plasma（PRP）；Bone growth factor；Bone defects；Bone restoration

R683

A

1004-745X（2016）12-2245-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.012

2016-09-15）

重慶市衛(wèi)計(jì)委面上項(xiàng)目基金資助（2013-2-089）

△通信作者（電子郵箱：zhangchuanzhi838@sina.com）

48只新西蘭大白兔隨機(jī)分成3組：A組模型組 （行骨缺損手術(shù)）；B組富血小板微球羥基磷灰石PRP/CS/HA（行骨缺損手術(shù)，植入PRP/CS/HA復(fù)合材料）；C組淫羊藿苷血小板血漿微球羥基磷灰石復(fù)合材料EP/PRP/ CS/HA（行骨缺損手術(shù)，植入EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料）。均植入6孔鋼板（華創(chuàng)仿AO寵物用鋼板）；術(shù)后均觀察12周。通過(guò)HE組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)、x線攝片、生物力學(xué)檢測(cè)等檢測(cè)方法，以評(píng)估不同療效。結(jié)果與A組相比，12周時(shí)，X線提示B組骨折線稍模糊，骨痂密度開(kāi)始增加；C組則顯示骨折線模糊，骨痂生長(zhǎng)良好，骨成熟度較高；同時(shí)感染率較前兩組明顯降低（P＜0.01）；生物力學(xué)結(jié)果顯示，與A組相比，B組、C組顯示骨痂強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)用顯著差異，與A組相比生物力學(xué)均差異明顯（P＜0.05）。組織形態(tài)學(xué)顯示A組以纖維結(jié)締組織為主，B組、C組則見(jiàn)大量骨組織形成，其中C組骨痂成熟度較高（P＜0.05）。結(jié)論EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料具有促進(jìn)骨折愈合作用，有望成為一種治療骨缺損的良好方法。