陶春雨，鄭 鑫，王一樵，巴鶴臻，謝鯤鵬（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116081）

三十烷醇對蛹蟲草菌絲生長和多糖含量的影響

陶春雨，鄭 鑫，王一樵，巴鶴臻，謝鯤鵬*
（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116081）

研究了三十烷醇（TA）在不同濃度下對蛹蟲草液體培養(yǎng)的影響，通過測定菌絲球大小和密度、菌絲體生物量、直徑和蟲草多糖的含量，確定了TA的最佳使用濃度，并對各濃度下蛹蟲草的生長情況進行了分析與討論。結果表明，與對照組相比，當TA質(zhì)量濃度為0．5 mg·L-1時，菌絲體濕重提高了45．17%，菌絲體干重增加了44．49%，胞外多糖提高了173．1%，胞內(nèi)多糖增加了305．7%。當TA質(zhì)量濃度超過0．5 mg·L-1時，促進作用均越來越小，當TA質(zhì)量濃度超過1．0 mg·L-1時，上述各項指標均小于對照組。

三十烷醇；蛹蟲草；液體培養(yǎng)；蟲草多糖

蛹蟲草（Cordyceps militaris）也稱北冬蟲夏草，為子囊菌亞門 （Ascomycotina） 子囊菌綱 （Ascomycetes） 肉座菌目 （Hypocreaceae） 蟲草屬（Cordyceps）真菌，具有極高的藥用價值[1]。從蛹蟲草中提取的活性物質(zhì)具有降血壓、抗腫瘤、抗疲勞和調(diào)節(jié)免疫功能等重要作用[2]。其中，蟲草多糖是蛹蟲草的主要活性成分[3]。但野生蛹蟲草在自然界中較為稀少，導致蟲草多糖價格昂貴。三十烷醇（TA）是1種天然、無毒、高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，已廣泛應用于農(nóng)作物增產(chǎn)、花卉培養(yǎng)、食用菌栽培，并取得了良好的效果[4]。液體培養(yǎng)具有可控性強、周期短、易于放大產(chǎn)量等特點，并且蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲體的化學組成與野生蛹蟲草接近，可用于蟲草多糖的提取[5]。

目前較多研究將TA應用于金針菇、草菇、鳳尾菇、平菇等的增產(chǎn)實驗中[6]，但TA對蛹蟲草液體培養(yǎng)影響的研究較少。本實驗旨在探究TA對蛹蟲草液體培養(yǎng)的影響效果，并且確定作用于蛹蟲草液體培養(yǎng)的最佳TA濃度，從而提高了其產(chǎn)量和營養(yǎng)成分的含量。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

蛹蟲草菌種，由遼寧師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

三十烷醇（分析純），由遼寧師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、硫酸鎂1．5 g、磷酸二氫鉀3 g、維生素B110 mg，pH6。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂1．5 g、磷酸二氫鉀3 g、維生素B110 mg、pH6[7]。

1.3 培養(yǎng)方法

1．3．1 菌株活化

將保藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d。待菌種長滿斜面，用接種鏟取出1塊2 cm2的菌種接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱靜置48 h，再置于25℃、120 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)5 d，制備好液體菌種用于液體培養(yǎng)實驗。

1．3．2 液體培養(yǎng)

將TA添加到液體培養(yǎng)基中，使TA的終質(zhì)量濃度分別為0、0．25 mg·L-1、0．5 mg·L-1、0．75 mg·L-1、1．0 mg·L-1，每個濃度設置3個重復。250 mL三角瓶裝液100 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫后按5%接種量接入液體菌種，于 25℃、120 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)3 d[8]。

1.4 測定方法

1．4．1 菌絲球大小和密度的觀察

液體培養(yǎng)結束后，觀察并比較不同濃度TA對菌絲球大小和密度的影響。

1．4．2 菌絲體生物量的測定

濕重：取20 mL培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心20 min，水洗，再離心，重復3次。收集菌絲體，電子天平稱量。

干重：按上述方法離心、水洗，沉淀物60℃烘干至恒重，冷卻到常溫，電子天平稱量[3]。

1．4．3 菌絲粗細的測定

取液體培養(yǎng)后的菌絲體，制成水浸片，置于400倍顯微鏡下觀察。

1．4．4 多糖的提取和測定

胞外多糖的提?。簩⑴囵B(yǎng)液4 000 r·min-1離心20 min，上清液常壓蒸發(fā)濃縮至20%，濃縮溫度不超過100℃，濃縮液中加入3倍體積95%的乙醇醇析12 h，4 000 r·min-1離心10 min，沉淀用無水乙醇、丙酮各洗1次，60℃烘干，得灰白色粗多糖[9]。

胞內(nèi)多糖的提?。簩⒑娓芍梁阒氐木z體粉碎，稱取粉末5 g加入25 mL蒸餾水中，于95℃～100℃水浴浸提2 h，用蒸餾水定容至25 mL，加入3倍體積的無水乙醇，于4℃靜置沉淀12 h，4 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀為多糖[10]。

多糖的測定：苯酚-硫酸比色法[7]。

2 結果與討論

2.1 TA對蛹蟲草菌絲球大小和密度的影響

不同濃度TA對蛹蟲草菌絲球大小和密度的影響見圖1。

圖1 添加不同濃度TA后菌球大小及密度Fig．1 Fungus ball size and density after adding different concentrations of TA

由圖1可明顯觀察到，添加TA后，菌絲球均有所增大。根據(jù)渾濁程度可判斷出，TA質(zhì)量濃度在0．25 mg·L-1～0．75 mg·L-1時，菌絲球密度增加，其中TA為0．5 mg·L-1時，密度最大。Ries S．K．的研究表明[11]，TA能被植物很快吸收，提高細胞對磷酸鹽和硝酸根離子的吸收，增加核酸含量，促進蛋白質(zhì)合成，進而促進植物的生長。但當TA濃度增大到1 mg·L-1時，菌絲球密度小于對照組。目前，將TA應用于蛹蟲草液體培養(yǎng)的報道十分罕見，作用機理更是鮮有報道，尚待進一步探究。

2.2 TA對蛹蟲草生物量的影響

2．2．1 TA對濕重的影響

添加不同濃度的TA，對蛹蟲草濕重的影響，見圖2。

由圖2可知，TA質(zhì)量濃度為0．25 mg·L-1、0．5 mg·L-1和0．75 mg·L-1時菌絲體濕重大于對照組，其中以濃度0．5 mg·L-1時菌絲體濕重最重。此時在每20毫升培養(yǎng)液中，實驗組比對照組的菌絲體濕重增加8．55 g，提高了45．17%。根據(jù)Roger Hangarter[12]對TA生理作用的研究，TA可促進植物對水份和礦物質(zhì)的吸收，提高代謝強度，促進光合作用，增強抗病能力。王謙等[13]的實驗也驗證了TA具有以上生理效應，同時將TA應用于大球蓋菇菌的液體培養(yǎng)，結果表明，一定濃度范圍內(nèi)的TA可使菌絲體濕重增加，濃度過高促進作用減小，甚至抑制菌絲體生長。

圖2 TA對蛹蟲草濕重的影響Fig．2 Effects of TA on the wet weight of Cordyceps militaris

2．2．2 TA對干重的影響

添加不同濃度的TA，對蛹蟲草干重的影響，見圖3。

圖3 TA對蛹蟲草干重的影響Fig．3 Effects of TA on the dry weight of Cordyceps militaris

由圖3可知，TA質(zhì)量濃度為0．25 mg·L-1、0．5 mg·L-1和0．75 mg·L-1時菌株干重均大于對照組，濃度0．5 mg·L-1時達到最大，即每20毫升培養(yǎng)液中，與對照組相比菌絲體干重增加 5．33 g，提高了44．49%。而添加1 mg·L-1TA的菌絲體干重小于對照組。王金山等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TA可促進干物質(zhì)的運輸積累，增加植物體內(nèi)氨基酸、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量，增加農(nóng)作物產(chǎn)量。

2.3 TA對菌絲直徑的影響

在放大倍數(shù)400倍顯微鏡下，觀察添加不同質(zhì)量濃度TA后，蛹蟲草菌絲直徑的變化見圖4。

圖4 添加不同濃度TA后菌絲直徑Fig．4 Hyphae thickness after adding different concentrations of TA

由圖4可知，TA質(zhì)量濃度在0．25 mg·L-1～0．75 mg·L-1時，菌絲直徑均稍有增加。濃度0．5 mg·L-1時，菌絲直徑最大；1 mg·L-1時，菌絲直徑與對照組相比無明顯變化。Ries S．K．等[11]得出，TA可使植物細胞數(shù)目增加，促進細胞伸長，還可緩解和改善水淹、干旱情況下出現(xiàn)的生長速率下降等現(xiàn)象。這與周勁松等[15]將TA應用于黃綠蜜環(huán)菌的研究結果相似，即TA在一定濃度范圍內(nèi)可促進黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長，且隨濃度的增高促進效果加強，但濃度過高時對菌絲細胞生長有抑制作用。

2.4 TA對蛹蟲草多糖含量的影響

2．4．1 TA對蛹蟲草胞外多糖含量的影響

將添加了不同質(zhì)量濃度TA的培養(yǎng)液離心，取上清液，并稀釋50倍，測定490 nm處吸光值，由多糖標準曲線得到相應胞外多糖含量。具體結果見表1。

表1 胞外多糖含量測定結果Tab．1 Determination results of extracellular polysaccharide content

由表1可見，TA質(zhì)量濃度在0．25 mg·L-1～0．75 mg·L-1時，實驗組胞外多糖的含量均高于對照組，由此可見，TA有明顯地促進胞外多糖積累的作用。尤其在質(zhì)量濃度0．5 mg·L-1時，胞外多糖含量達到最大，為99．12 mg/100mg，比對照組提高了173．1%。而TA濃度為1 mg·L-1時，實驗組胞外多糖的含量少于對照組，說明較高濃度的TA會抑制胞外多糖的積累。

此外，羅建成等[16]將TA應用在靈芝的搖床培養(yǎng)中，結果顯示在一定含量范圍內(nèi)，TA能促進菌絲體生長并明顯提高胞外粗多糖含量，這可能是因為TA可改善細胞的通透性。

2．4．2 TA對蛹蟲草胞內(nèi)多糖含量的影響

將添加了不同質(zhì)量濃度TA的培養(yǎng)液離心，取沉淀烘干至恒重，并將浸提得到的胞內(nèi)多糖稀釋50倍，測定490 nm處吸光值，由多糖標準曲線得到相應的胞內(nèi)多糖含量。具體結果見表2。

如表2所示，加入TA后，胞內(nèi)多糖含量明顯增加，在濃度0．25 mg·L-1～0．75 mg·L-1時，TA對胞內(nèi)多糖累積的促進作用十分明顯。在質(zhì)量濃度為0．5 mg·L-1時，促進作用最強，5g菌絲體粉末中胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量達到最大值126．01 mg，比對照組提高了305．7%。但當濃度為1 mg·L-1時，開始起抑制作用。已有研究結果表示，TA能夠提高藻類細胞硝酸還原酶、淀粉酶等多種酶的活性，并有利于氮素吸收、轉(zhuǎn)化和利用[17]；葡萄糖和NH4＋有利于蛹蟲草胞內(nèi)多糖的積累，半乳糖對胞外多糖合成最有利[18]。由此可推測，TA通過增強相關酶的活性間接促進蛹蟲草胞內(nèi)多糖的積累。然而，TA對蛹蟲草胞外、胞內(nèi)多糖的影響效果和影響機制鮮有報道。

3 結論

本實驗將不同質(zhì)量濃度TA應用于蛹蟲草的液體培養(yǎng)，考察其對蛹蟲草有效成分累積的影響。實驗表明，與對照組相比，向液體培養(yǎng)基中添加0．25 mg·L-1～0．75 mg·L-1TA時，均起促進作用，濃度0．5 mg·L-1時促進作用最明顯，菌絲球大小和密度均達到最大；濕重提高了45．17%，干重提高了44．49%；菌絲直徑最大；胞外、胞內(nèi)多糖的含量分別比對照組提高了173．1%和305．7%；當TA質(zhì)量濃度為1 mg·L-1時，抑制蛹蟲草菌絲的生長。

目前，TA及其制劑作為一種無毒害、無污染、成本低、效益高的廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，越來越多地被應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。TA是1種“綠色”農(nóng)藥，能夠提高食用菌等多種作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。本實驗的結果為蛹蟲草大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了啟示，同時，對食用菌栽培中要合理利用植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)給予了指導。

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Influence of Triacontanol on Hyphae Growth and Polysaccharide Content of Cordyceps militaris

TAO Chun-yu,ZHENG Xin,WANG Yi-qiao,BA He-zhen,XIE Kun-peng
（Liaoning Normal University,Dalian 116081,China）

The effect of different concentrations of triacontanol（TA）on Cordyceps militaris strains of liquid culture were studied．By measuring the fungus ball size,mycelium biomass and density,diameter and Cordyceps polysaccharide content,the best use of quality concentrations of TA were determined,and C.militaris growth conditions under different concentrations are analyzed and discussed．The results showed that compared with the control group,when TA quality concentration was 0．5 mg·L-1, wet weight of mycelium increased by 45．17%．Dry weight increased by 44．49%．The content of extracellular polysaccharide and intracellular polysaccharides increased by 173．1%,305．7%,respectively．Above the indicators,with the increase of quality concentration of TA,promoting effect were smaller and smaller,when the quality concentration of TA was more than 1 mg·L-1,the above-mentioned indexes was less than the control group．

triacontanol;Cordyceps militaris;liquid culture;Cordyceps polysaccharide

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0059-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．014

陶春雨（1994-），女，在讀本科生，研究方向：食用菌的液體培養(yǎng)。E-mail:tcy0321＠163．com

*通信作者：謝鯤鵬（1976-），男，碩士，講師，主要從事微生物及食用菌的教學和科研工作。E-mail:xkp_1995＠sina．com

2016-11-20