耿新倩，王從容

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200233)

糖尿病是繼惡性腫瘤、心腦血管病之后的第三大慢性非傳染性疾病，其患病率呈逐年升高趨勢(shì)。據(jù)估計(jì)，全球糖尿病患病人數(shù)將從2015年的4.15億上升到2040年的6.42億[1]。糖尿病主要由胰島B細(xì)胞功能受損和(或)胰島素生物作用缺陷所致，隨病程進(jìn)展可發(fā)生心血管疾病、視網(wǎng)膜病變等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，大量研究主要從分子、代謝產(chǎn)物、免疫等多個(gè)方面探究糖尿病發(fā)病機(jī)制，但具體機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，因而尋找新方法深入研究其病理生理機(jī)制具有重大意義。

生物力學(xué)現(xiàn)已發(fā)展成有助于研究人類疾病的新興領(lǐng)域。研究表明，疾病不僅引起人體生物功能改變，還可導(dǎo)致病變細(xì)胞表面形貌和力學(xué)特征異常[3,4]。

因此，了解細(xì)胞力學(xué)性能可以為病因?qū)W研究提供新視角。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)具有皮牛級(jí)力學(xué)分辨率和納米級(jí)空間分辨率，能在近生理狀態(tài)下研究細(xì)胞和組織超微結(jié)構(gòu)[5,6]。通過在納米尺度下觀察樣品形貌特征和測(cè)量其楊氏模量等力學(xué)參數(shù)[7]，并將其與疾病相關(guān)聯(lián)，可為疾病的早期監(jiān)測(cè)及病理機(jī)制研究提供有力線索。本文主要就AFM在糖尿病及其并發(fā)癥研究中的相關(guān)應(yīng)用作一綜述。

1 AFM的工作原理及檢測(cè)特性

AFM是1986年由Binnig等[6]首次提出，主要由壓電掃描器、微懸臂和針尖、光學(xué)偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)及電反饋系統(tǒng)四個(gè)核心部件構(gòu)成；根據(jù)針尖與樣品相互作用力的不同形式，其工作模式分為3種：接觸模式、非接觸模式和輕敲模式。

AFM最基本的功能是通過探測(cè)彈性微懸臂上裝載的納米級(jí)針尖與被測(cè)樣品間的相互作用力而獲得樣品表面形貌信息，對(duì)表面進(jìn)行整體圖像分析即可得到樣品的高度、寬度、表面粗糙度等參數(shù)[8]。AFM的另一個(gè)重要功能是通過測(cè)量微懸臂和樣品間作用力隨距離的變化而獲得力-距離曲線。運(yùn)用合適的模型將記錄的力-距離曲線擬合成相應(yīng)的力-壓痕曲線，根據(jù)后者可獲得所測(cè)樣品區(qū)域的彈性模量及黏附力等信息[9]。AFM綜合高分辨率成像和力-距離曲線測(cè)量特點(diǎn)，可得到傳統(tǒng)測(cè)量手段無法獲得的參數(shù)，諸如樣品表面粗糙度、高度等形貌參數(shù)及黏彈力等力學(xué)性能。

2 AFM在糖尿病研究中的應(yīng)用

糖尿病與氧化應(yīng)激緊密相關(guān)，外周血紅細(xì)胞尤其容易受到氧化應(yīng)激損害。2010年，Jin等[10]運(yùn)用AFM測(cè)量紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與年齡匹配的正常人相比，糖尿病患者的紅細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表面粗糙度增加[(690.2±71.7)vs(1333.5±55.2)nm]，而細(xì)胞的峰谷差和細(xì)胞表面積/體積比減?。辉诹W(xué)性能方面，糖尿病患者紅細(xì)胞硬度[(1.53±0.41)×105vs(1.78±0.39)×105N/m2]和黏附力[(420±25)vs(510±63)pN]均增加。另一項(xiàng)針對(duì)2型糖尿病的研究亦發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的紅細(xì)胞膜楊氏模量較健康人增大，說明該病變細(xì)胞硬度增大，變形性減小[11]。紅細(xì)胞表面積/體積比減小、硬度增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變形能力下降，引起血液黏度增高、阻力增大、組織缺氧等，這可能是2型糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率和死亡率高于非糖尿病者的重要原因。

Zhang等[12]運(yùn)用單分子力譜技術(shù)，通過將胰島素修飾在AFM探針上，研究1型糖尿病酮癥酸中毒患者紅細(xì)胞膜上胰島素受體與胰島素的相互作用。與正常人相比，患者紅細(xì)胞膜上的胰島素受體與胰島素間結(jié)合率[(17±3)%vs(12±2)%]和結(jié)合力均下降，且結(jié)合后復(fù)合物穩(wěn)定性亦降低，揭示胰島素受體功能缺陷。該技術(shù)從單分子水平為1型糖尿病酮癥酸中毒致病機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，具有傳統(tǒng)研究技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性。

3 AFM在糖尿病并發(fā)癥研究中的應(yīng)用

3.1 糖尿病心血管疾病

糖尿病是公認(rèn)的心血管疾病危險(xiǎn)因素之一。2014年Benech等[13]首次利用AFM研究糖尿病動(dòng)物左心室心肌細(xì)胞的力學(xué)性能，研究者在近生理狀態(tài)下測(cè)量從糖尿病小鼠中分離的心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)糖尿病組心肌細(xì)胞表觀彈性模量比正常對(duì)照組高112%[(91±14)vs(43±7)kPa，P<0.01]；且糖尿病組心肌細(xì)胞的硬度和黏附力均大于對(duì)照組。該研究從納米水平表明糖尿病會(huì)影響心肌細(xì)胞的力學(xué)性能。2014年,Akhtar等[14]對(duì)大鼠主動(dòng)脈纖維素微纖絲進(jìn)行AFM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的微纖絲長度減小、延展性降低，但微纖絲上典型重復(fù)距離數(shù)增大[(57.2±0.6)vs(59.2±0.8)nm]。由此可見高血糖狀態(tài)下血管存在大分子積累損害，并且由于微纖絲在組織中有較長的半衰期，因此,其可能會(huì)成為糖尿病病程進(jìn)展中組織重塑的結(jié)構(gòu)生物標(biāo)志物。

3.2 糖尿病腎病

糖尿病腎病是糖尿病微血管病變引起的一種長期并發(fā)癥。有明確證據(jù)表明轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是導(dǎo)致早期腎小管損傷的最主要介質(zhì)[15]。2012年Hills等[16]發(fā)現(xiàn)高糖處理HK2細(xì)胞可增加其TGF-β1的分泌，且TGF-β1可使細(xì)胞最大分離力減少20%，分離能降低53%，即TGF-β1可降低兩個(gè)細(xì)胞間的黏附力。此研究表明，糖尿病狀態(tài)下TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使近端小管細(xì)胞黏附力和細(xì)胞間通訊缺失，并且這些改變出現(xiàn)在明顯腎臟損害之前。2016年,Siamantouras等[15]利用AFM研究糖尿病腎病，亦發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后的HK2細(xì)胞黏附力降低，運(yùn)用赫茲模型根據(jù)力-距離曲線計(jì)算出細(xì)胞的彈性模量后發(fā)現(xiàn)其彈性模量增加70%，即細(xì)胞硬度增大。TGF-β1可能通過影響細(xì)胞骨架重組而導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)性能發(fā)生變化，顯性糖尿病腎病出現(xiàn)之前，腎臟上皮細(xì)胞力學(xué)性能就已發(fā)生明顯改變，因此，AFM有望成為早期診斷糖尿病腎病的強(qiáng)大工具。

3.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變

研究表明，約25%的1型或2型糖尿病患者會(huì)發(fā)生視網(wǎng)膜病變，導(dǎo)致視力下降甚至失明[17]。To等[18]對(duì)13例糖尿病患者捐贈(zèng)的眼球進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)界膜變厚，硬度增大[(37.9±1.2)vs(24.3±1.2)kPa]。這些變化可能與糖尿病患者視網(wǎng)膜含有較高密度的蛋白和含水量較低有關(guān)，使得基底膜易碎，從而發(fā)生視網(wǎng)膜病變。

此外，視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活是糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谥陵P(guān)重要的步驟。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，糖尿病鼠的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)表達(dá)水平增高[19]。2016年,Yang等[20]研究視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖組內(nèi)皮下基質(zhì)硬度是正常含糖組的2倍，而經(jīng)LOX抑制劑處理后，增加的基質(zhì)硬度水平有所下降。因此，這可能是高糖狀態(tài)下LOX表達(dá)上調(diào)、從而使內(nèi)皮下基底膜硬度增加、進(jìn)而激活內(nèi)皮細(xì)胞引起視網(wǎng)膜炎癥、最終發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子生物學(xué)機(jī)制。

3.4 糖尿病神經(jīng)病變

糖尿病神經(jīng)病變亦是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，可累及約50%的1型或2型糖尿病患者[21]。Wang等[22]運(yùn)用AFM從納米水平研究糖尿病鼠神經(jīng)發(fā)生的細(xì)微結(jié)構(gòu)改變。研究者對(duì)鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)膜、外膜及尾部肌腱的膠原纖維進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠的膠原纖維直徑均比對(duì)照鼠大；并且糖尿病病程越長，神經(jīng)和肌腱中膠原纖維的變化越明顯。糖尿病時(shí)神經(jīng)的這種結(jié)構(gòu)改變可能與神經(jīng)內(nèi)膜壓力和力學(xué)性能變化有關(guān)，尚需要更多的AFM研究來進(jìn)一步證實(shí)。

3.5 糖尿病皮膚病變

糖尿病也會(huì)造成皮膚損害，約30%～70%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生皮膚病變[23]。2016年，Argyropoulos等[24]對(duì)糖尿病患者(45～62歲)和年齡與之匹配的正常人活檢得到的皮膚進(jìn)行研究，并使用AFM測(cè)量真皮層的納米級(jí)形態(tài)和力學(xué)性能，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者真皮層膠原纖維排列紊亂，粗糙度比正常人增加176%。在力學(xué)性能方面，與正常人相比，糖尿病患者膠原纖維的牽引力、抗拉強(qiáng)度分別增加182%和197%，但變形性降低58%。以上數(shù)據(jù)表明，糖尿病患者皮膚真皮層結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，這些改變可能是發(fā)生糖尿病的早期征象及其內(nèi)部并發(fā)癥[25]的預(yù)警信號(hào)，對(duì)臨床醫(yī)師早期開展糖尿病篩查具有提示作用。

3.6 糖尿病骨骼病變

糖尿病對(duì)多器官系統(tǒng)可產(chǎn)生不利影響，糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)亦增加[26]。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Hammond等[27]運(yùn)用AFM觀察來自脛骨和肌腱的膠原纖維，均發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的膠原纖維間距比正常大鼠更寬、移位更大，且兩者有顯著性差異(P<0.05)，此變化在肌腱中更明顯。該研究揭示，糖尿病會(huì)誘導(dǎo)骨骼中膠原纖維發(fā)生形態(tài)改變，推測(cè)可能亦存在相關(guān)力學(xué)性能改變，從而使糖尿病患者的骨骼質(zhì)量改變，進(jìn)而增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。

4 展 望

綜上所述，利用AFM研究細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)的表面微觀形貌和納米級(jí)機(jī)械性能，有利于從納米水平了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，輔助疾病的早期診斷，并為疾病的臨床研究及治療提供新依據(jù)和新思路。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和進(jìn)展，AFM在糖尿病的研究中必將發(fā)揮更加重要的作用。

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