楊雅婷 綜述 于子優(yōu) 張文杰 審校

miR-26a促骨再生機(jī)制及其應(yīng)用研究進(jìn)展

楊雅婷 綜述 于子優(yōu) 張文杰 審校

誘導(dǎo)自身骨再生是修復(fù)大面積骨缺損的理想手段。miRNAs作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，能夠調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)。研究表明，miRNA-26a（miR-26a）能夠同時(shí)促進(jìn)與成骨-成血管相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨再生。闡明miR-26a在干細(xì)胞成骨分化中的具體分子機(jī)制，有助于開發(fā)促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的新靶點(diǎn)。本文就目前miR-26a促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控機(jī)制和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

miR-26a 間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化

骨創(chuàng)傷或骨腫瘤等引起的大面積骨缺損，理想的修復(fù)方法是誘導(dǎo)自身骨再生。近年來，干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展使得利用多種來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell，MSC）分化成骨變?yōu)榭赡?。傳統(tǒng)的促進(jìn)MSC成骨分化的方法為添加成骨相關(guān)調(diào)節(jié)因子，如BMP2等，雖能夠促進(jìn)骨再生，但存在添加物降解過快以及難以控制再生程度等問題。此外，外源性干預(yù)手段可能會(huì)打破骨重建過程中骨形成與骨吸收之間的平衡，以及血管新生與血管改建之間的平衡，從而導(dǎo)致過量新生骨生長(zhǎng)，也有可能因大量不成熟的血管形成而造成血管高壓及血管微滲漏[1-2]。開發(fā)促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的新靶點(diǎn)，在最大程度上模擬自然狀態(tài)下的成骨分化調(diào)控，已成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

miRNA是由22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)或阻遏翻譯[3]。近年的研究表明，miRNA對(duì)成骨與成血管相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]，與多種信號(hào)通路共同構(gòu)成了干細(xì)胞成骨-成血管分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[5-6]。研究認(rèn)為，miR-26a能夠調(diào)控多條成骨分化通路，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)源性成骨-成血管相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的表達(dá)，在不同來源的干細(xì)胞中發(fā)揮其促成骨分化潛能[7]。闡明miR-26a在干細(xì)胞成骨分化中的具體分子機(jī)制，有助于開發(fā)骨組織工程修復(fù)的新靶點(diǎn)。本文就目前miR-26a在促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)通路方面的研究以及相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 miR-26a調(diào)控干細(xì)胞成骨分化的通路

miR-26a調(diào)控干細(xì)胞成骨分化的通路比較復(fù)雜，大致涉及 Sma-Mad族蛋白 1（SMAD1）、erbB2轉(zhuǎn)錄因子（transducer of ErbB2，Tob1）、WNT（Wg-int1）、糖原合成酶激酶 3β（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）等，不同研究應(yīng)用了不同來源的MSC開展了探索[8-14]。

1.1 SMAD1

Luzi等[14]觀察到人脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Humanadipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hADSCs） 在成骨分化過程中mir-26a表達(dá)增加，而SMAD1蛋白的表達(dá)則與之相反，通過2'-O-甲基-反義RNA能夠增加SMAD1表達(dá)水平，使hADSCs中成骨標(biāo)志基因上調(diào)，由此推測(cè)，mir-26a通過作用于SMAD1蛋白在hADSCs成骨分化過程中扮演重要角色。在另一項(xiàng)對(duì)hADSCs和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs） 成骨分化的研究中，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和功能試驗(yàn)，明確了mir-26a通過潛在靶向性作用于GSK3β和Smad1來調(diào)節(jié)WNT和BMP信號(hào)通路。其中，綜合比較分析顯示，在ADSCs成骨分化中抑制Smad1以抑制BMP通路引起的干擾分化過程占主導(dǎo)[11]。此外，Luzi等在對(duì)調(diào)控SMAD1上游的Menin的研究中也報(bào)道了mir-26a參與的調(diào)節(jié)過程。Menin是多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子 1（Multiple endocrine neoplasia 1，MEN1）抑癌基因的產(chǎn)物，具有廣泛調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能[15]。通過采用熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3/miR-26a，證實(shí)了Menin-miR-26a的特異性相互作用，通過小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）將hADSCs中MEN1沉默會(huì)引起miR-26a的下調(diào)，最終導(dǎo)致SMAD1蛋白的上調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著mir-26a的減少SMAD1蛋白出現(xiàn)上調(diào)，證明SMAD1是mir-26a在hADSCs成骨分化中的直接靶點(diǎn)[10]。分析hADSCs成骨分化階段Menin及其mRNA的表達(dá)，兩者都有所上升，與成骨標(biāo)記基因如RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）等平行變化。 染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）分析顯示，Menin占據(jù)miR-26a基因啟動(dòng)子，因而誘導(dǎo)它的表達(dá)，明確了Menin是一種miR-26a的正向調(diào)節(jié)因子。這些研究證實(shí)，Menin轉(zhuǎn)錄因子和miR-26a之間有直接相互作用，這在hADSCs成骨過程中可能起到關(guān)鍵作用，為miRNAs在骨疾病中的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。研究表明，在地塞米松誘導(dǎo)的hADSCs成骨分化過程中，Menin是一種對(duì)miR-26a直接調(diào)控，對(duì)SMAD1蛋白間接調(diào)控（通過miR-26a）的調(diào)控因子[16]。

1.2 Tob1

李巖等在卵巢摘除（Ovariectomy，OVX）骨質(zhì)疏松疾病模型中發(fā)現(xiàn)，miR-26a通過功能性的靶向作用于Tob1，逆轉(zhuǎn)了OVX-MSC的成骨能力缺陷。在OVX-MSC中上調(diào)miR-26a的表達(dá)，使成骨分化的關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）OCN表達(dá)增高，預(yù)測(cè) Tob1的非編碼區(qū)（3‘UTR）存在miR-26a的結(jié)合位點(diǎn)。將OVX-MSC與Sham-MSC成骨誘導(dǎo)分化后，觀察到在兩種細(xì)胞中Tob1的表達(dá)均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。將建立的野生型或突變型的報(bào)告基因載體與miR-26a mimics共轉(zhuǎn)染至MSC后，觀察到miR-26a的過表達(dá)明顯抑制了野生型Tob1報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，而對(duì)突變型并無(wú)改變。同時(shí)，觀察到miR-26a的過表達(dá)明顯抑制Tob1蛋白在MSC中的表達(dá)，而對(duì)其基因表達(dá)無(wú)明顯影響，細(xì)胞中成骨分化相關(guān)的關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子隨Tob1表達(dá)的升高而明顯下降[8]。該研究證明了miR-26a是通過功能性直接作用于Tob1，部分逆轉(zhuǎn)了OVX-MSC的成骨能力缺陷。這種逆轉(zhuǎn)能力在體內(nèi)異位骨以及原位顱骨缺損修復(fù)中都得到了證實(shí)。此外，在對(duì)非限制性成體干細(xì)胞（Unrestricted somatic stem cells，USSC）成骨分化的研究中，生物信息靶向基因預(yù)測(cè)miR-26a抑制成骨的蛋白轉(zhuǎn)錄編碼，隨后證實(shí)Tob1也是靶點(diǎn)之一[13]。

1.3 WNT

miR-26a在WNT通路中的作用尚存在爭(zhēng)議。在Su等[11]的研究中，通過生物信息和功能試驗(yàn)，明確了miR-26a通過潛在靶向性作用于GSK3β和Smad1來調(diào)節(jié)WNT和BMP信號(hào)通路。綜合比較分析顯示，WNT信號(hào)通路在BMSCs成骨分化中較BMP信號(hào)通路占主導(dǎo)，而后者在ADSCs成骨分化中起更大作用。這種分離的激活模式以及在信號(hào)通路中的作用，說明miR-26a主要靶向作用于GSK-3β以激活WNT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的成骨分化，而在ADSCs成骨分化中則抑制Smad1，從而抑制BMP通路以干擾分化過程。但Li等[12]的研究認(rèn)為，miR-26a-5p上調(diào)后通過直接靶向作用于Wnt5a的3＇非轉(zhuǎn)錄區(qū)（UTR）而抑制成骨分化，進(jìn)而下調(diào)Wnt/Ca2+信號(hào)通路，生物數(shù)據(jù)算法提出Wnt5a的3＇UTR段是miR-26a-5p的潛在靶點(diǎn)，通過采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析和綠色熒光蛋白/紅色熒光蛋白（GFP/RFP）染色試驗(yàn)證實(shí)了這一預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p抑制Wnt5a，抑制鈣離子流和蛋白激酶C，進(jìn)而抑制ADSCs的成骨分化。相比之下，miR-26a-5p的抑制可以激活這些信號(hào)蛋白，促進(jìn)成骨分化。

1.4 GSK-3β

有研究表明，Gsk-3β存在miR-26a的結(jié)合位點(diǎn)，而抑制GSK-3β可促進(jìn)骨修復(fù)，顯著提高OVX小鼠的礦物沉積率（Mineral apposition rate，MAR）和骨礦物質(zhì)密度（Bone mineral density，BMD）[17-18]。為探究GSK-3β在調(diào)節(jié)成骨活性中的角色，沉默小鼠 MSCs和成骨細(xì)胞（Osteoblasts，Obs）中 GSK-3β的表達(dá)后，Runx2和OCN蛋白水平明顯升高。通過添加miR-26a的模擬物和抑制劑，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-26a在其中的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，Runx2、OCN、Gsk-3β的表達(dá)在miR-26a過表達(dá)細(xì)胞中提高，在miR-26a抑制組中降低，證實(shí)了miR-26a通過功能性靶向作用于GSK-3β，上調(diào)成骨細(xì)胞活性[9]。ADSCs和BMSCs成骨分化的比較研究也證實(shí)，miR-26a主要靶向作用于GSK3β以激活WNT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的成骨分化[11]。

1.5 其他

在miR-26a表達(dá)變化與成骨相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子、成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，BMP2、RUNX2及OCN等與miR-26a的表達(dá)水平變化一致，通過堿性磷酸酶與茜素紅染色觀察到，miR-26a過表達(dá)有效促進(jìn)了BMSC的磷酸酶活性與礦化能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，成骨相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（RUNX2，OCN）與成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管生成素）在蛋白水平的表達(dá)也隨著miR-26a表達(dá)的上調(diào)與下調(diào)而上升與下降[8]。上述結(jié)果表明，miR-26a體外可以在BMSCs細(xì)胞中有效地從基因與蛋白兩個(gè)水平促進(jìn)成骨-成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與分泌。

除了影響成骨、成血管關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，在miRNAs對(duì)USSC成骨分化的功能性影響研究中，還闡述了內(nèi)源性CDK6和HDAC4的水平在USSC成骨分化過程中下調(diào)，減少了隨后mir-26a的異位表達(dá)。通過Alizarin-Red染色和鈣離子釋放試驗(yàn)表明，過表達(dá)mir-26a能顯著加快USSC的成骨分化，推測(cè)可能由成骨抑制蛋白，如周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases，CDK6）和組蛋白去乙酰化酶 4（Histone deacetylase 4，HDAC4）介導(dǎo)。證實(shí)成骨抑制因子CDK6、重組人 β-連環(huán)素蛋白互作蛋白 1（CTNNBIP1）、HDAC4 和 TOB1，還有SMAD1也是miR-26a的靶點(diǎn)[13]。

2 miR-26a在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用

miRNAs有望作為骨缺損修復(fù)的新靶點(diǎn)。與傳統(tǒng)的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子治療相比，調(diào)節(jié)單個(gè)水平的miRNAs有望同時(shí)影響骨修復(fù)中的多條途徑。miRNAs治療可以通過直接給予miRNAs的模擬物或抑制物，但通常這些帶負(fù)電的小分子不能輕易通過同為負(fù)電的細(xì)胞膜[19]，而裸露的miRNAs在體內(nèi)很快就會(huì)被降解。因此，找到合適的載體及遞送系統(tǒng)將miRNAs高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中，是目前miRNAs治療面臨的最大問題。以miR-26a在骨缺損動(dòng)物模型中的應(yīng)用為例，近年來已在miR-26a遞送體系方面有所突破，并聯(lián)合支架材料的應(yīng)用，在骨缺損修復(fù)中展現(xiàn)了良好效果。Wang等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，ASCs被透明質(zhì)酸（HA）支架吸收后，可作為新型組織工程骨替代品嵌入脛骨極限缺損的大鼠。隨著miR-26a的轉(zhuǎn)入，成骨相關(guān)基因表達(dá)極大上調(diào)，ALP的產(chǎn)生、膠原的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)礦化都有所增加。HE染色觀察到新骨形成，而細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和增殖并未受到明顯影響。組織學(xué)評(píng)估觀察到，附著于多孔HA支架的修飾細(xì)胞明顯促進(jìn)了新骨在缺損區(qū)域的形成。李巖等[8]基于聚醚、聚酯材料，利用聚合和點(diǎn)擊化學(xué)方法，合成出生物可降解的效率高、毒性小的陽(yáng)離子miRNA轉(zhuǎn)染體系（線性LPs和超支化HPs），可以在miRNAs穿過細(xì)胞膜時(shí)不被降解，進(jìn)入細(xì)胞后囊泡膨脹和破解，miRNAs進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。隨后，通過將上述miRNAs轉(zhuǎn)染體系包裹于聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）緩釋微球中，再將微球附著于左旋聚乳酸（PLLA）納米多孔支架上，構(gòu)建了miRNAs局部緩釋體系。在5 cm脛骨極限缺損模型中，原位植入緩釋體系的實(shí)驗(yàn)組活體micro-CT顯示骨缺損完全修復(fù) （對(duì)照組僅有少量或中等量的骨修復(fù)）。該結(jié)果經(jīng)過micro-CT對(duì)新生骨量的半定量檢測(cè)進(jìn)一步得到確認(rèn)。HE染色觀察到實(shí)驗(yàn)組中新生骨量及新生血管的密度與數(shù)量都遠(yuǎn)高于兩個(gè)對(duì)照組。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該miRNAs緩釋體系能夠在體內(nèi)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)對(duì)Agomir-26a的有效緩釋，并同時(shí)保持其良好的生物學(xué)活性，進(jìn)而有效轉(zhuǎn)染至缺損區(qū)周圍細(xì)胞，促進(jìn)缺損區(qū)周圍機(jī)體自身細(xì)胞中的成骨-成血管相關(guān)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與分泌，最終以內(nèi)源性的調(diào)節(jié)手段實(shí)現(xiàn)最理想的骨缺損修復(fù)效果。而在Zhang等[9]的無(wú)細(xì)胞3D支架和兩階段遞送研究中，短的PEG鏈和一個(gè)低分子量的正電PEI結(jié)合在一個(gè)疏水分子核心的外殼上，miRNAs引起進(jìn)一步的自我募集，形成一個(gè)納米級(jí)球形外殼，被內(nèi)外兩層親水PEG層夾成三明治結(jié)構(gòu)。這些穩(wěn)定攜帶miR-26a的多聚體被包裹在可生物降解的多聚體微粒（MS）中，克服了現(xiàn)有miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)體系的不受控釋放引起的問題。這種兩段式miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)策略使得在受控持續(xù)釋放的基礎(chǔ)上保有高轉(zhuǎn)染率。此外，為防止miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的靶向外效應(yīng)，通過把MS移到一個(gè)納米纖維無(wú)細(xì)胞3D支架上，可以從時(shí)空上控制內(nèi)源細(xì)胞的活化，從而再生修復(fù)骨質(zhì)疏松的老鼠的顱骨缺損。

3 展望

遞送系統(tǒng)和細(xì)胞來源的缺乏是目前miR-26a應(yīng)用于骨缺損治療的主要瓶頸。移植過程中，設(shè)計(jì)的骨架不僅受制于骨細(xì)胞，還要應(yīng)對(duì)炎癥和成血管細(xì)胞滲透。支架降解引起的不良反應(yīng)在用較大劑量進(jìn)行缺損骨骼修復(fù)時(shí)可能會(huì)被放大，而修復(fù)大面積骨缺損可能會(huì)用到超生理劑量的miR-26a，從而可引發(fā)不可預(yù)知的結(jié)果。因此，炎癥和成血管細(xì)胞是如何受到miR-26a調(diào)控，以及又是如何作用于成骨過程等問題，仍需進(jìn)一步研究[21]。BMSCs雖然能分化成多個(gè)細(xì)胞系卻難以大量獲得，盡管體外擴(kuò)增可以增加細(xì)胞數(shù)量，但長(zhǎng)期增殖和持續(xù)傳代，對(duì)BMSCs的正常功能存在有害效應(yīng)[20]。相比之下，源自脂肪組織的ADSCs易大量獲取，被認(rèn)為是干細(xì)胞的更可靠來源。然而，盡管能被HA支架或其他支架吸收，ADSCs的成骨分化能力整體受限。研究表明，miRNAs是強(qiáng)大的內(nèi)源性治療分子，可以同時(shí)調(diào)控多種靶基因，在體內(nèi)的應(yīng)用可以更好模擬自然調(diào)節(jié)通路，正如其在細(xì)胞中本身的功能，具有改善ADSCs功能的潛力[20]。但是，目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a在BMSCs和ADSCs兩種細(xì)胞中的功能有著重疊和矛盾，提示在MSC細(xì)胞分化中有著不同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)解路徑[8]。因此，很多在BMSCs、USSC中的關(guān)于miR-26a促進(jìn)成骨機(jī)制的研究，需要進(jìn)一步在ADSCs中進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。此外，miR-26a在ADSCs成骨分化中扮演的角色以及ADSCs成骨分化的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明，相關(guān)通路的明確可以為骨組織再生修復(fù)提供新靶點(diǎn)和新方法。

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The Molecular Mechanism and Application of miR-26a in Bone Regeneration

YANG Yating,YU Ziyou,ZHANG Wenjie．Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

【Summary】The ideal means to repair large-sized bone defects is to induce bone regeneration.MicroRNAs(miRNAs),as a modulator at a post-transcriptional level,can regulate the expression of a series of target genes.A number of studies have shown that miR-26a could promote the expression of multiple key growth factors related to osteogenesis and angiogenesis,and further improve the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone formation.Clarifying the molecular mechanism of miR-26a in promoting osteogenic differentiation of stem cells could provide potential targets for bone regeneration.The mechanism and current progresses of miR-26a in promoting osteogenic differentiation and bone regeneration were reviewed.

miR-26a;mesenchymal stem cell; osteogenic differentiation

Q813.1+2

B

1673－0364（2017）06－0346－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.013

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。

2017年8月23日；

2017年10月10日）