何喜權(quán)

【摘 要】近年來(lái)，抗菌藥物的研發(fā)工作一直進(jìn)展緩慢。不過(guò)，最近發(fā)現(xiàn)的兩種可用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染的新型抗菌肽卻讓人眼前一亮。目前，全球?yàn)E用抗生素的情況嚴(yán)重，有學(xué)者曾憂(yōu)心地提出——由于人類(lèi)在與細(xì)菌的“軍備競(jìng)賽”中總是處于被動(dòng)和落后的態(tài)勢(shì)，當(dāng)有朝一日人類(lèi)研制的最強(qiáng)效的抗生素都因?yàn)槌?jí)細(xì)菌的存在而失效時(shí)，這個(gè)世界將會(huì)變成什么樣子呢？不過(guò)，最近科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種可用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染的新型抗菌肽，可望為一直進(jìn)展緩慢的抗菌藥物研發(fā)工作增添一份信心。

【關(guān)鍵詞】新型抗菌肽；抗菌；革蘭氏陽(yáng)性菌

[Abstract] Recently scientists have found a kind of can be used in the treatment of gram-positive bacteria infection of new antibacterial peptides， which is expected to work for antimicrobial drug development has been slow to add a confidence.

[Key words] a new antibacterial peptide； antibiosis； gram-positive bacterium

蠅類(lèi)的幼蟲(chóng)---蛆蟲(chóng)對(duì)感染創(chuàng)口的清潔作用很早就引起人們的注意。上世紀(jì)二、三十年代，在美國(guó)和歐洲一些國(guó)家蛆蟲(chóng)清創(chuàng)治療被廣泛應(yīng)用于各種化膿性感染的創(chuàng)面，包括：膿腫、燒傷、壞疽和慢性腿部潰瘍，取得了良好的臨床效果，臨床治愈率達(dá)到90%。但由于抗生素和各種滅菌溶液的問(wèn)世，活體蛆療熱很快就過(guò)去了。

由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，創(chuàng)面由于嚴(yán)重感染不愈合的現(xiàn)象增多。這些難治性頑固感染創(chuàng)面是臨床常見(jiàn)病，病因復(fù)雜，癥狀多變，創(chuàng)面久不愈合，重者致殘，給畜牧養(yǎng)殖帶來(lái)極大的不便，也給畜牧場(chǎng)主帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些病癥大都對(duì)抗生素不敏感，而且由于感染與腐爛，導(dǎo)致局部解剖結(jié)構(gòu)變異，神經(jīng)血管等重要組織外露，治療時(shí)，肉眼不能有效分辨壞死組織和正常組織，使手術(shù)清創(chuàng)達(dá)不到理想效果，而后影響生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，這類(lèi)病畜最后大多以只能淘汰為告終。

1 肽類(lèi)蛋白簡(jiǎn)介

1.1 肽類(lèi)蛋白相關(guān)概念

通過(guò)離子交換與分子篩層析技術(shù)將活體醫(yī)用無(wú)菌絲光綠蠅蛆蟲(chóng)血淋巴分泌物的有效抗菌成分提取出來(lái)，研究此提取液對(duì)感染創(chuàng)面常見(jiàn)細(xì)菌的抗菌作用，在國(guó)際上首次證實(shí)絲光綠蠅蛆蟲(chóng)血淋巴分泌物提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強(qiáng)的抗菌作用，其抗菌能力強(qiáng)于頭孢哌酮，該抗菌成分為新型抗菌肽類(lèi)蛋白物質(zhì)。

1.2 肽類(lèi)蛋白國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展

10年前，科學(xué)家們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由8種密切相關(guān)的酰基縮肽（ADEPs）組成的復(fù)合體具有抗葡萄球菌和抗鏈球菌的作用。最近，拜耳公司抗感染藥物研究部的哈瑞爾及其同事在《自然醫(yī)學(xué)》雜志上對(duì)上述復(fù)合體中的主要肽類(lèi)成分ADEP1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)描述。為了進(jìn)一步提高ADEP1的抗菌活性，研究者們還對(duì)ADEP1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，從而得到另外兩種?；s肽物質(zhì)ADEP2和ADEP4。同時(shí)，研究者們還在文章中公布了ADEP2和ADEP4的整個(gè)合成路線(xiàn)（Nature Med. 2005，11：1082～1087）。

在隨后進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中，研究者證實(shí)ADEP2和ADEP4的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性均比ADEP1有所提高。在幾種不同動(dòng)物模型上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，ADEP2和ADEP4治療糞腸球菌感染的療效與口惡唑烷酮類(lèi)抗菌藥物利奈唑胺相當(dāng)；此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)，ADEP4治療膿毒癥的治愈率可達(dá)到80%，治療肺炎鏈球菌感染的有效率也超過(guò)了利奈唑胺。

通過(guò)篩查耐ADEP1變異大腸桿菌庫(kù)，研究者們找到了ADEPs的作用靶點(diǎn)，即高度保守的細(xì)菌酪蛋白水解激酶（caseinolytic kinase，ClpP）的催化核心。進(jìn)一步的研究顯示，ADEPs可與ClpP相結(jié)合，同時(shí)還能使其他非活性Clp-蛋白酶復(fù)合體發(fā)生蛋白水解。上述研究結(jié)果表明，ADEPs主要是通過(guò)破壞細(xì)菌蛋白正常水解過(guò)程而發(fā)揮其抗菌作用的。

1.3 抗菌肽類(lèi)蛋白物質(zhì)的創(chuàng)新點(diǎn)

1.3.1 在國(guó)內(nèi)首次證實(shí)活體蛆蟲(chóng)分泌物對(duì)感染創(chuàng)面常見(jiàn)細(xì)菌具有有效的抑制作用 將具有活力的蛆蟲(chóng)蟲(chóng)體消毒處理后，對(duì)蛆蟲(chóng)體表經(jīng)細(xì)菌和病毒學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)無(wú)細(xì)菌和病毒存在，將消毒的蛆蟲(chóng)用于嚴(yán)重難治性感染創(chuàng)面的臨床治療，所有病例創(chuàng)面膿性壞死組織清除干凈，新鮮的肉芽組織迅速生長(zhǎng)，創(chuàng)面表面培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌。筆者認(rèn)為，蛆蟲(chóng)在潰瘍創(chuàng)面上爬行，吞食膿性壞死組織、清潔創(chuàng)面的同時(shí)，環(huán)境中的細(xì)菌也進(jìn)入蛆蟲(chóng)體內(nèi)，刺激蛆蟲(chóng)機(jī)體產(chǎn)生抗菌蛋白物質(zhì)，消滅細(xì)菌。

1.3.2 首創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)蛆蟲(chóng)生物清創(chuàng)的有效作用機(jī)理 我們通過(guò)研究首次證實(shí)活體蛆蟲(chóng)能夠有效促進(jìn)難治性頑固感染創(chuàng)面的愈合、預(yù)防細(xì)菌感染。發(fā)現(xiàn)蛆蟲(chóng)生物清創(chuàng)的有效作用如下：（1）創(chuàng)面滲出液對(duì)細(xì)菌有機(jī)械沖洗作用。由于活蛆的不斷蠕動(dòng)刺激創(chuàng)面產(chǎn)生漿液性滲出，創(chuàng)面定殖的細(xì)菌被不斷產(chǎn)生的滲出液機(jī)械沖洗，并由吸水性敷料吸附，在更換輔料的同時(shí)創(chuàng)面細(xì)菌隨之被清除。（2）蠅蛆蠕動(dòng)的機(jī)械刺激促使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原和纖維蛋白沉積，加速肉芽組織的生成。（3）創(chuàng)面壞死組織作為蠅蛆的食物被攝取或被酶解、液化。（4）蠅蛆攝取并消化創(chuàng)面定殖的細(xì)菌。

1.3.3 在國(guó)內(nèi)首次將活體蛆蟲(chóng)應(yīng)用于臨床頑固性難治感染創(chuàng)面的清創(chuàng)治療 潰瘍、外傷感染創(chuàng)面以及褥瘡等頑固性難治感染創(chuàng)面是臨床常見(jiàn)疾病，病因復(fù)雜，創(chuàng)面久不愈合，重者致殘，損害經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給畜主帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些病畜大都對(duì)抗生素不敏感，而且由于感染與腐爛，導(dǎo)致局部解剖結(jié)構(gòu)變異，神經(jīng)血管等重要組織外露、健康與壞死組織界限分辨不清，很難通過(guò)普通的外科清創(chuàng)術(shù)達(dá)到根治的目的，這類(lèi)病畜最后大多以淘汰告終。本項(xiàng)目在國(guó)內(nèi)首次將活體蛆蟲(chóng)應(yīng)用于臨床感染創(chuàng)面的清創(chuàng)治療，成功挽救了這類(lèi)病畜的肢體，有效修復(fù)了創(chuàng)面。給臨床外科清創(chuàng)提供了新的技術(shù)手段，為生物治療領(lǐng)域提供了新思路。國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用這種生物清創(chuàng)療法，本項(xiàng)目具有巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

2抗菌肽類(lèi)蛋白物質(zhì)在臨床試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 肽類(lèi)蛋白的制取與來(lái)源

2.1.1活體蛆蟲(chóng)的無(wú)菌處理 于喂養(yǎng)的2～3d取出蛆蟲(chóng)。先用生理鹽水反復(fù)沖洗，將幼蟲(chóng)分別放在3.5%甲醛生理鹽水溶液中5min；放入2%的雙氧水溶液中3min；放入5%的碘仿溶液中；放入5%的含氯的消毒液中；放入75%的酒精中3min，不影響蛆的生活力。我們?cè)O(shè)計(jì)連續(xù)用以上濃度的甲醛、雙氧水和含氯的消毒液對(duì)蛆進(jìn)行處理，每次處理完畢后用蒸餾水洗滌，對(duì)消毒的蛆體表面經(jīng)細(xì)菌和病毒學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)無(wú)細(xì)菌和病毒存在并且蛆的活力仍然存在，無(wú)菌狀態(tài)可用于活體臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。

活體蛆蟲(chóng)分泌物的獲取

2.1.2活體蛆蟲(chóng)分泌物（肽類(lèi)蛋白）的獲取 取適量蛆蟲(chóng)（600條），分為金葡菌誘導(dǎo)組（將300條幼蟲(chóng)與金葡菌共培養(yǎng)48h）和對(duì)照組，分別加入2倍體積TNE緩沖液（10 mM Tris-HCl， pH 7.5 ，150 mM NaCl， 5 mM EDTA，及蛋白酶抑制劑混合物含10μg/ml leupeptin，1μg/ml aprotinin，and 1mM PMSF，3mM Na3VO4）冰浴10min，充分勻漿勻漿液離心（12000Xg，4OC，10min） 取上清液，加3倍體積的TNE緩沖液，沸水浴2min離心（12000Xg， 4OC，10min）取上清液，即為粗提物。從粗提物中再通過(guò)過(guò)濾、離心等分離得到一種防御素。防御素是存在于動(dòng)物和高等植物中的一類(lèi)富含半胱氨酸的天然抗菌肽，它們對(duì)多種微生物均具有較強(qiáng)的防御能力，因此，防御素也是目前頗具吸引力的一類(lèi)新型候選抗菌藥物。

2.2 肽類(lèi)蛋白物質(zhì)的理化性質(zhì)

抗菌物質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定，在 100°加熱10min還能保持一定活力，對(duì)較大離子強(qiáng)度，較低或較高的PH都有較強(qiáng)的抗性的能力。

2.3 獸醫(yī)臨床試驗(yàn)結(jié)果與分析

快速活性測(cè)定方法：用金黃色葡萄球菌作為指示菌，采用平板抑菌圈法檢測(cè)抗菌物質(zhì)活性抑菌活力測(cè)定。 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上接種金黃色葡萄球菌，在直徑為四毫米的藥敏片上滴加抗菌提取物，370C，與金葡菌共培養(yǎng)18h，觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑。

3 結(jié)語(yǔ)與討論

結(jié)果分析表明?？股刂委熅哂芯植繚舛雀叩膬?yōu)點(diǎn)，但局部應(yīng)用容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，本實(shí)驗(yàn)中頭孢哌酮對(duì)從臨床分離培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌的抗菌作用較弱證明了這一點(diǎn)。昆蟲(chóng)具有特殊的免疫防御體系，多種昆蟲(chóng)受到外界有害刺激誘導(dǎo)時(shí)能產(chǎn)生體液免疫物質(zhì)。蒼蠅幼蟲(chóng)生活在病原微生物較多的環(huán)境中，但它自身則不得病，可見(jiàn)蠅體自身具有獨(dú)特的免疫防御體系。實(shí)驗(yàn)中采集的蛆蟲(chóng)血淋巴分泌物提取液對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，其抗菌能力強(qiáng)于頭孢哌酮。我們認(rèn)為有害細(xì)菌在一定程度上起到了誘導(dǎo)作用，刺激蛆蟲(chóng)的機(jī)體防御體系產(chǎn)生抵抗這種細(xì)菌的物質(zhì)。絲光綠蠅幼蟲(chóng)（蛆）主要生長(zhǎng)在腐尸和腐爛的魚(yú)肉等含有大量細(xì)菌的環(huán)境中，以腐敗組織為食物，對(duì)有血運(yùn)的活體組織無(wú)任何影響。國(guó)外一些學(xué)者利用絲光綠蠅幼蟲(chóng)的這一特性將其應(yīng)用于感染創(chuàng)面的修復(fù)治療中，取得良好效果。我們將具有活力的蛆蟲(chóng)蟲(chóng)體消毒處理后，對(duì)蛆蟲(chóng)體表經(jīng)細(xì)菌和病毒學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)無(wú)細(xì)菌和病毒存在，將消毒的蛆蟲(chóng)用于糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面的臨床治療，所有病例創(chuàng)面膿性壞死組織清除干凈，新鮮的肉芽組織迅速生長(zhǎng)，創(chuàng)面表面培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌。我們認(rèn)為，蛆蟲(chóng)在潰瘍創(chuàng)面上爬行，吞食膿性壞死組織、清潔創(chuàng)面的同時(shí)，環(huán)境中的金黃色葡萄球菌也進(jìn)入蛆蟲(chóng)體內(nèi)，刺激蛆蟲(chóng)機(jī)體產(chǎn)生某種抗菌蛋白物質(zhì)，消滅細(xì)菌。

蠅蛆僅僅蠶食腐敗組織，面對(duì)活組織無(wú)任何影響，其療效對(duì)病灶的血運(yùn)沒(méi)有要求，蛆蟲(chóng)容易得到而且非常經(jīng)濟(jì)。蛆蟲(chóng)療法是一種修復(fù)嚴(yán)重感染創(chuàng)面的、安全有效的生物擴(kuò)創(chuàng)療法。醫(yī)學(xué)的發(fā)展使我們對(duì)疾病的治療有了更多的選擇，但是當(dāng)代的醫(yī)師有時(shí)也會(huì)遇到特殊環(huán)境下的特殊患者的特殊傷口，需要特殊的治療，這種非常規(guī)的治療方法蛆療法，還需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Harald Labischinski.自然醫(yī)學(xué)[J].Nature Med. 2005，（11）：1082～1087.

[2] Hans-Henrik Kristensen.自然[J].Nature，2005，（437）：975～980 .

[3]李振.動(dòng)物藥理.國(guó)家“十一.五”規(guī)劃教材，參編，北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

[4]李端.藥理學(xué)（第六版）.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.