顏 峻，胡柳芝，王文彬，謝中國，鄧愛華

(湖南文理學院生命科學學院，水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，動物學湖南省高校重點實驗室，湖南常德 415000)

正交試驗法優(yōu)選鱧腸總黃酮提取工藝

顏 峻，胡柳芝，王文彬*，謝中國，鄧愛華

(湖南文理學院生命科學學院，水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，動物學湖南省高校重點實驗室，湖南常德 415000)

[目的]優(yōu)化鱧腸總黃酮的提取工藝。[方法]采用單因素試驗和正交試驗法，以總黃酮提取率為評價指標，研究了乙醇濃度、提取時間、提取溫度、溶劑用量4種因素對總黃酮提取的影響。[結果]各因素對鱧腸總黃酮提取率的影響從大到小依次溶劑用量、乙醇濃度、提取時間、提取溫度；最佳提取工藝為乙醇濃度40%、提取時間2 h、提取溫度80 ℃、溶劑用量25倍，此條件下鱧腸總黃酮平均提取率達71.01%。[結論]該提取工藝簡單可行，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，可為鱧腸總黃酮的工業(yè)化生產提供參考。

鱧腸；總黃酮；正交試驗；提取工藝

鱧腸(EcliptaprostrataL.)，別名旱蓮草、墨旱蓮、烏田草、蓮子草等，為菊科(Asteraceae)鱧腸屬(Eclipta)植物[1]。鱧腸屬約有4種，我國僅鱧腸1種，各省區(qū)均有分布，主產于江蘇、江西、浙江、廣東等地，喜生于濕潤之處，見于路邊、田邊、塘邊及河岸，亦生于潮濕荒地或撂荒的水田中，常與馬齒覓、白花蛇舌草、千金子等伴生[1-2]?！侗静菥V目》記載，鱧腸全草入藥，味甘酸，性涼，入肝腎二經，無毒；具有滋補肝腎、涼血、止血、消腫、強壯之功效，可治各種吐血、腸出血等癥。鱧腸莖葉柔嫩，各類家畜喜食，民間常用作豬飼料。金燮理等[3]研究表明鱧腸可防治草魚細菌性腸炎??；Christybapita等[4]研究魚體病發(fā)現(xiàn)鱧腸葉水提物可以顯著提高機體非特異性免疫的能力，緩解病情；Citarasu等[5]研究也證明鱧腸及其他5種藥材合用有利于免疫反應，可以治療對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)感染的疾病。

鱧腸含有的黃酮類主要有槲皮素(quercitrin)、木樨草素(luteolin)、luteolin-7-O-glucoside、芹菜素(apigenin)、蒙花苷等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗血管增生、消炎、抗應變性和抗病毒的功效[6-7]。有研究認為，墨旱蓮止血、調節(jié)免疫的有效成分為黃酮類[8-9]。近年來，國內外對黃酮類成分的研究逐漸增多，而不同植物黃酮類化合物的提取工藝也有所不同[10-15]。有關鱧腸總黃酮的不同提取研究也有報道[16-20]。筆者以鱧腸總黃酮提取率為評價指標，通過正交試驗優(yōu)化鱧腸總黃酮提取的最佳工藝條件，以期為鱧腸應用于水產養(yǎng)殖中防治草食性魚類細菌性腸炎等病癥試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材 鱧腸，購于常德市九芝堂藥材公司(河北產的藥材)；蘆丁標準品(純度>95%)，購自BBI生命科學有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為國產分析純(AR)。

1.2 儀器 UV-2000 紫外-可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；HH-S4 電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；RE-52C 旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責任公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；FW-100 型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；AUX-220電子天平，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立。以蘆丁為對照品，精確稱取120 ℃減壓干燥至質量恒定的蘆丁50 mg，用95%乙醇溶解并定容至25 mL，精確吸取10 mL于100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.20 mg/mL 的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液1、2、3、4、5 mL于25 mL 容量瓶中，各加30%乙醇溶液至6 mL；再加0.05 g/mL 亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加0.10 g/mL 硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；再加0.04 g/mL 氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，用30%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min備用。取制備的蘆丁對照品溶液，參照文獻[21]方法在紫外-可見分光光度計500 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、蘆丁標準溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 鱧腸總黃酮的提取與含量測定。

1.3.2.1 提取。先將鱧腸樣品烘干、粉碎、過篩和封存。準確稱取1 g，在乙醇濃度50%、提取時間3 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶50條件下回流提取，趁熱過濾，將濾渣繼續(xù)回流，重復3 次，將3 次濾液合并，濃縮至浸膏狀，用50%乙醇定容至100 mL即得供試品溶液。

1.3.2.2 含量測定。取0.5 mL鱧腸置于25 mL 容量瓶中，參照“1.3.1”方法進行測定，得到其在500 nm處吸光度A，根據(jù)回歸方程計算鱧腸浸提液中總黃酮含量，并以此來計算各組試驗中總黃酮的提取率：總黃酮的提取率=W1/W×100%，式中，W1為各試驗因素提取鱧腸中黃酮類化合物的含量(mg)；W為鱧腸中的總黃酮含量(mg)。

1.3.3 單因素試驗。

1.3.3.1 乙醇濃度對鱧腸總黃酮提取率的影響。準確稱取鱧腸粉末1 g，在溶劑用量20倍、水浴溫度60 ℃、提取時間2 h、提取次數(shù)1次的條件下，分別加入濃度為30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液提取。在8 000 r/min轉速下離心10 min，精密吸取上清液0.5 mL，參照“1.3.1”方法進行測定，得到500 nm的吸光度，并計算鱧腸總黃酮的含量。

1.3.3.2 提取時間對鱧腸總黃酮提取率的影響。準確稱取鱧腸粉末1 g，在溶劑用量20倍、水浴溫度60 ℃、乙醇濃度50%、提取次數(shù)1次的條件下，分別提取1、2、3和4 h。在8 000 r/min轉速下離心10 min，精密吸取上清液0.5 mL，參照“1.3.1”方法進行測定，得到500 nm的吸光度，并計算鱧腸總黃酮的含量。

1.3.3.3 提取溫度對鱧腸總黃酮提取率的影響。稱取鱧腸粉末約1 g，在乙醇濃度50%、溶劑用量20倍、提取時間2 h、提取次數(shù)1次的條件下，分別在40、50、60、70 和80 ℃水浴加熱提取。在8 000 r/min轉速下離心10 min，精密吸取上清液0.5 mL，參照“1.3.1”方法進行測定，得到500 nm的吸光度，并計算鱧腸總黃酮的含量。

1.3.3.4 溶劑用量對鱧腸總黃酮提取率的影響。準確稱取鱧腸粉末1 g，在乙醇濃度50%、水浴溫度70 ℃、提取時間2 h、提取次數(shù)1次的條件下，分別在溶劑用量為10、15、20、25、30(倍)的乙醇中提取。在8 000 r/min轉速下離心10 min，精密吸取上清液0.5 mL，參照“1.3.1”方法進行測定，得到500 nm的吸光度，并計算鱧腸總黃酮的含量。

1.3.4 正交試驗。提取黃酮類化合物過程中受多個因素影響，為了確定鱧腸中總黃酮的最佳提取工藝，以乙醇-水為提取介質，用回流提取方法，將乙醇濃度(%)、提取時間(h)、提取溫度(℃)、溶劑用量(倍)作為考察對象設計四因素三水平的正交試驗L9( 34)，每個試驗重復3次，取平均值作為結果，對回流提取工藝條件用極方差分析進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制 以吸光度為縱坐標、蘆丁標準溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線(圖1)，得蘆丁吸光度(A)與濃度(C)的線性回歸方程：A=10.075C+0.005 4(R2=0.999 5)，表明蘆丁質量濃度為0.008～0.040 mg/mL與吸光度的線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對鱧腸總黃酮提取率的影響。由圖2可見，因乙醇濃度為50%時黃酮類化合物的提取率達到最高，故選擇40%、50%和60%進行正交試驗。

圖2 乙醇濃度對鱧腸總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from Eclipta prostrata L.

2.2.2 提取時間對鱧腸總黃酮提取率的影響。從圖3可看出，雖提取時間越長，提取越充分，提取率就越高。但從節(jié)省能源角度考慮，提取時間不能過長，且在2.0 h有一個拐點。故選擇1.0、1.5和2.0 h進行正交試驗。

圖3 提取時間對鱧腸總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Eclipta prostrata L.

2.2.3 提取溫度對鱧腸總黃酮提取率的影響。由圖4可見，在溫度70 ℃時黃酮類化合物的提取率達到最高，故選擇60、70 和80 ℃進行正交試驗。

圖4 提取溫度對鱧腸總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Eclipta prostrata L.

2.2.4 溶劑用量對鱧腸總黃酮提取率的影響。從圖5可看出，隨著溶劑用量的增大，鱧腸黃酮類化合物的提取率持續(xù)增高，但在15倍時有一個拐點，之后增高變緩。故選擇溶劑用量15、20和25倍進行正交試驗。

2.3 正交試驗 由表1可知，各因素對鱧腸總黃酮提取率的影響從大到小依次為D、A、B、C，即溶劑用量的影響最大，其次是乙醇濃度，提取溫度的影響最小。根據(jù)極方差分析得到總黃酮提取工藝的最佳組合為A1B3C3D3，即乙醇濃度40%、提取時間2 h、提取溫度80 ℃、溶劑用量25倍。

圖5 溶劑用量對鱧腸總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of solvent dosage on extraction rate of total flavonoids from Eclipta prostrata L.

直觀分析得到鱧腸總黃酮提取的最佳工藝條件也為A1B3C3D3。由于極方差分析結果與直觀分析結果相同，故無需再進行驗證試驗。可見，鱧腸總黃酮提取的最佳提取工藝條件為A1B3C3D3，此條件下鱧腸總黃酮平均提取率達71.01%。

表1 正交試驗結果

3 結論與討論

采用L9(34)正交試驗設計，以總黃酮提取率為評價指標，優(yōu)化了鱧腸總黃酮的醇提工藝。結果表明，在乙醇濃度40%、溶劑用量25倍、提取溫度80 ℃、提取時間2 h的條件下，鱧腸中總黃酮平均提取率達71.01%，其中溶劑用量和乙醇濃度對總黃酮提取率的影響較為顯著。該提取工藝簡單可行，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，可為鱧腸總黃酮的工業(yè)化生產提供參考。

該試驗結果與林朝朋等[16]、吳巖斌等[20]的研究結果比較，提取時間、乙醇濃度和溶劑用量等最佳醇提工藝條件有所不同，該試驗得出的鱧腸總黃酮最佳提取工藝是相對合適的。首先，由于鱧腸總黃酮既可用乙醇提取，也可用水提取，且2種方法的提取得率很接近[16]，因此，用40%乙醇濃度提取則似乎兼顧了醇、水2種方法；在提取時間上，除超聲提取外，時間太短固然不行，2 h似乎更適中，可以兼顧效率與節(jié)能；在溶劑用量上，25倍比30倍更經濟，可少浪費乙醇和純水。

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Optimization of Extraction Process for Total Flavonoids fromEcliptaprostrataL.

YAN Jun, HU Liu-zhi, WANG Wen-bin*et al

(Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Key Laboratory of Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area of Hunan Province, Zoology Key Laboratory of Hunan Higher Education, College of life science, Hunan University of Arts and Science, Changde,Hunan 415000)

[Objective] The research aimed to optimize the extraction process of total flavonoids ofEcliptaprostrataL..[Method]Using single factor test and orthogonal test,the extraction rate of total flavonoids was taken as the evaluation index,the effects of ethanol concentration, extraction time, extraction temperature and solvent dosage on the extraction of total flavonoids were studied.[Result]The effects of various factors on the extraction rate of total flavonoids from big to small were as follows: solvent dosage, ethanol concentration, extraction time, extraction temperature.The optimum extraction conditions were ethanol concentration 40%, extraction time 2 h, extraction temperature 80 ℃ and solvent dosage 25 times. The average extraction rate of total flavonoids was 71.01%.[Conclusion]The extraction process is simple and feasible, it has good stability and repeatability, which can provide reference for the industrial production of total flavonoids ofEcliptaprostrataL..

EcliptaprostrataL.;Total flavonoids;Orthogonal test;Extraction process

湖南省“十二五”重點建設學科(動物學)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目“水生生物資源保育與利用”；湖南文理學院“范蠡”本科創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目。

顏峻(1995-)，男，湖南衡陽人，本科生，專業(yè)：生物科學。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導師，從事水產動物疾病學研究。

2016-11-09

S 567.21+9

A

0517-6611(2016)34-0125-03