李田田，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

BVDV P7蛋白的原核表達及其生物信息學分析

李田田，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

為了對BVDV-1 P7蛋白進行原核表達及生物信息學分析，采用RT-PCR的方法擴增BVDV NADL株BVDV-1 P7的ORF，擴增產(chǎn)物經(jīng)BamH I、Sal I雙酶切后插入原核表達載體pEGX4T-1（+），構建P7基因原核表達載體并將其轉(zhuǎn)化至工程菌E.coli BL21（DE3）中進行誘導表達，并對其進行生物信息學預測。結(jié)果表明，成功擴增并構建了BVDV NADL株的BVDV-1 P7原核表達載體，命名pEGX4T-1-P7。SDS-PAGE和Western blot表明，在分子質(zhì)量34 kDa的位置出現(xiàn)與預期大小一致的蛋白條帶；生物信息學結(jié)果表明在P7蛋白有信號肽，存在疏水區(qū)。該研究成功的表達了P7蛋白，該蛋白是一個疏水性蛋白，為其進一步的功能研究奠定了堅實的基礎。

BVDV；P7基因；原核表達；生物信息學

牛病毒性腹瀉粘膜病病毒（Bovine Viral Diarrhea-mucosal Disease Virus，BVDV）是引起牛病毒性腹瀉粘膜病的病原。歐美牛體中普遍存在輕性或隱性感染，與豬瘟病毒（HCV）、羊邊界病病毒（BDV）具有同一種抗原有交叉反應，牛體中的抗體檢出率高[1]。BVDV可以感染綿羊、豬、駱駝、山羊和其他野生動物，宿主廣泛，其中牛的感染最多。是一種人畜共患病，近年來已經(jīng)有報道。其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、母畜流產(chǎn)、胎兒畸形、咳嗽、腹瀉等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的損失[2]。

BVDV根據(jù)能否引起細胞病變分為兩種生物型：非致細胞病變型（NCP型）和致細胞病變型（CP型），雖然有明顯的抗原異質(zhì)性和顯著的種間遺傳，但BVDV僅有一種血清型。BVDV為單股正鏈RNA病毒，有囊膜，基因組全長約12.3～12.5 kb，5’端無“帽子”結(jié)構。編碼一個高分子質(zhì)量的多聚蛋白，該蛋白被加工成11種蛋白質(zhì)。其中有4種是結(jié)構蛋白，剩余7種為非結(jié)構蛋白。BVDV基因組中編碼這11種蛋白質(zhì)的基因相對位置為Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[3]。P7這個小的多肽將E2和NS2/3隔離開，相對分子質(zhì)量為6～7 kDa，主要由疏水性氨基酸組成。不同的瘟病毒屬的P7蛋白的疏水區(qū)和預測結(jié)構是保守的。P7蛋白是一種病毒孔蛋白，病毒孔蛋白是一種參與病毒復制周期的包含膜通透性修飾和促進病毒釋放的病毒蛋白，是最小的內(nèi)膜蛋白，在病毒的裝配和促進透化作用上起作用。

實驗對BVDV-1 P7基因進行了克隆，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡分析重組P7蛋白表達后的反應原性，并對P7基因的生物信息學進行分析，為更好的研究BVDV病毒孔蛋白的機制提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

BVDV-1 NADL株病毒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種

pEGX4T-1質(zhì)粒、大腸桿菌E.coli BL21由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶，DNA Marker DL2000，蛋白Marker，T4 DNA連接酶等均購自大連寶生物工程公司。小量質(zhì)粒提取試劑盒、微量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BVDV P7的基因擴增

根據(jù)GenBank公布的BVDV-1 NADL分離株P7基因序列（登錄號：AJ133738）和原核表達空載體pEGX4T-1（＋）序列，設計合成一對寡聚核苷酸引物F1/F2（forward primer：CG GGATCC ATG ATT CAG TAT GGA TCA GGG GAA GTG G；reverse primer：GC GTCGAC TTA GGC CTT TAC CAC ATC CCC AAT C），引入BamHⅠ、SalⅠ酶切位點。設計引物送北京華大生物工程公司合成。

將淋巴組織總RNA（Trizol法提取）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板擴增BVDV-1 P7基因片段，采用50 μL反應體系：其中包括5 μL模版，5 μL 10× Buffer，5 μL dNTPmix，0.5 μL Taq酶，上下游引物各1 μL，加水50 μL。以上樣品混均后并瞬離。PCR反應條件：96℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)，72℃5 min。吸取2 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（濃度為1%）檢測并用膠回收試劑盒回收剩余產(chǎn)物。

1.2.2 pEGX4T-1-P7原核表達載體的構建

將回收后的上述擴增產(chǎn)物和pEGX4T-1質(zhì)粒分別用BamHI和SalI雙酶切。分別回收目的片段和載體片段，16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。進行重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定，取酶切鑒定正確的送華大基因測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒pEGX4T-1-P7轉(zhuǎn)化E.coli BL21

取上述測序結(jié)果鑒定正確的pEGX4T-1-P7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化制備好的E.coli BL21感受態(tài)細胞進行誘導表達。

1.2.4 SDS-PAGE鑒定

表達菌E.coli BL21在42℃誘導10 h后，從試管中吸取5 mL菌液，室溫12 000 rpm離心1 min后棄上清液，用PBS振蕩重懸沉淀，5 000 r·min-137℃離心45 min；再次棄去上清液；反復3次。反復凍融3次，離心將上清液和沉淀分開，用裂解液把沉淀重懸。將上清和沉淀加入Buffer混勻，煮沸10 min后放入-20℃冰箱，以備后續(xù)使用。將空載體轉(zhuǎn)化后相同條件誘導菌作為實驗的陰性對照。

制備SDS-PAGE凝膠，上樣，考馬斯亮藍染色后終止。

1.2.5 重組蛋白Western blot分析

取15 μL融合蛋白按照上述步驟進行SDSPAGE電泳，凝膠半干轉(zhuǎn)PVDF膜后，一抗為小鼠抗BVDV-1陽性血清，37℃孵育45 min，二抗為HRP標記的羊抗鼠抗體，孵育1 h后，DAB顯色，EDTA（pH8.0）終止，觀察目的條帶。

1.2.6 BVDV P7蛋白的生物信息學分析

氨基酸序列理化性質(zhì)預測：ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）；

二級結(jié)構預測：SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）；

信號肽結(jié)構在線預測：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/；

疏水性分析由ProtScale（http://web.expasy.org/ protscale/軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 BVDV P7基因的擴增

P7基因用F1/F2引物擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的PCR擴增產(chǎn)物大小為200 bp，與預期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 P7基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of P7gene

2.2 重組表達載體pEGX4T-1-P7的鑒定

用BamHI/SalI雙酶切重組質(zhì)粒pEGX4T-1-P7，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到200 bp附近有條帶，與理論片段216 bp大小相符（圖2）。P7基因片段成功插入pEGX4T-1載體。

圖2 pEGX4T-1-P7的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme identification of pEGX4T-1-P7

2.3 重組蛋白pEGX4T-1-P7的誘導表達及鑒定

通過對重組菌SDS-PAGE結(jié)果的分析能觀察到34 kDa處有明顯的的條帶，為重組蛋白pEGX4T-1-P7的表達帶（圖3）與預期結(jié)果相符合。

圖3 重組蛋白pEGX4T-1-P7的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein pEGX4T-1-P7

2.4 表達產(chǎn)物Western blot鑒定

通過對重組菌的Western blot進行分析能觀察到在34 kDa處有明顯的條帶，與理論值一致（圖4）；表達的重組蛋白通過Western blot分析表明能夠與抗BVDV-1抗體發(fā)生特異性的免疫學反應，該結(jié)果證實了表達后的重組P7蛋白具有良好反應原性。

圖4 重組蛋白pEGX4T-1-P7的western blot分析Fig.4 WesternblotanalysisofrecombinantproteinpEGX4T-1-P7

2.5 目的基因DNA測序結(jié)果及推導的氨基酸序列分析

將轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞后提取質(zhì)粒，送測序后，對鑒定正確的結(jié)果進行分析，分析顯示BVDV P7相對分子質(zhì)量17 589.3，部分基因cDNA長215 bp，理論pI值為5.37，編碼71個氨基酸；分子式：C652H1090N216O278S37；半衰期體外4.4 h，體內(nèi)大于20 h；不穩(wěn)定系數(shù)50.90（不穩(wěn)定）；總平均疏水指數(shù)0.633。說明該蛋白為疏水性蛋白。圖5為目的DNA氨基酸序列。

圖5 BVDV-1 P7基因cDNA序列及氨基酸序列Fig.5 The cDNA and amino acid sequence of P7 gene of BVDV-1

2.6 二級結(jié)構預測

二級結(jié)構包括α-螺旋（30 aa，42.25%）、β折疊（22 aa，30.99%）、β-轉(zhuǎn)角（8 aa，11.27%）和無規(guī)卷曲（11 aa，15.49%）

2.7 P7基因信號肽預測

信號肽是指位于N端的負責新生肽鏈穿越粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的這段肽鏈。在成熟的蛋白質(zhì)中則不存在，大多數(shù)為氨基酸殘基，長度約20～30個，整體來看是高度疏水的。如圖6所示信號肽在線預測認為，P7基因有明顯的信號肽。

圖6 P7基因的信號肽預測Fig.6 Signal peptide prediction of P7 gene

2.8 P7基因的疏水性分析

P7蛋白親水性最高分值為-1.444，疏水性最高分值為3.400，總的來說疏水性氨基酸較均多于親水性氨基酸，整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性氨基酸，有四個明顯的疏水性區(qū)域。由此推測P7屬疏水性蛋白，與信號肽預測結(jié)果一致。

圖7 P7基因的疏水性分析Fig.7 Hydrophobic analysis of P7 gene

3 討論

BVD在世界上廣泛性分布，是一種能夠持續(xù)感染的嚴重的傳染病，我國首次分離得到正確BVDV株在1983年，由李佑等人完成，該病對我國的牛群造成了極大的傷害，流行廣泛。

依據(jù)5′UTR、Npro基因和E2基因序列可將BVDV分為2個基因型BVDV-1和BVDV-2[4]。該研究是BVDV-1型，包含P7蛋白。P7蛋白是一個病毒孔蛋白，明顯的參與到豬BVDV病毒毒力的進程中。P7蛋白在大腸桿菌中的表達引起了細菌細胞的透化作用轉(zhuǎn)化為小分子。同時P7蛋白能夠提高哺乳動物細胞的膜滲透性，提高細胞內(nèi)Ca2+的濃度，這種細胞的滲透性可以轉(zhuǎn)化為潮霉素B的抑制劑。P7蛋白是膜內(nèi)在蛋白，可以形成同源寡聚體[5]。在表達的早期階段，主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在晚期轉(zhuǎn)移到細胞膜上表達。研究證明了BVDV P7蛋白擁有的性能通常都與病毒孔蛋白有聯(lián)系，這是研究BVDV感染的治療性干預發(fā)展的一個潛在的目標。

目前使用大腸桿菌表達系統(tǒng)是最廣泛的表達系統(tǒng)之一。盡管與其他系統(tǒng)相比在大腸桿菌中表達的蛋白有易形成包涵體、缺少修飾、糖基化等一些缺陷，但該表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、抗污染能力強、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點。因此是基因工程研究中的重要工具之一[6]。由于上述原因，實驗選擇將BVDV P7融合蛋白表達在大腸桿菌E.coli中。研究選用了原核表達載體pEGX4T-1，是T7表達系統(tǒng)中的一員，表達體系選擇大腸桿菌來表達P7基因，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡來分析重組P7蛋白表達后的反應原性。為了能夠?qū)⒅亟M蛋白實現(xiàn)高效表達，研究首先進行了預實驗，通過對菌液的培養(yǎng)溫度、誘導時間和誘導劑濃度條件的優(yōu)化，使蛋白更高效的表達。在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對蛋白表達很重要，量低不足以使蛋白表達，量過高又會導致菌體代謝負荷過大；溫度同樣有影響，在高溫條件下蛋白表達量降低，而低溫又會影響到外源蛋白的合成；當誘導時間比較長時，包涵體積累過多，會使細胞受到損害，更嚴重的甚至會導致細胞的溶解，但是時間過短會造成外源蛋白表達較少。在多次交叉實驗對比后驗證后，最終選擇來表達重組蛋白的最優(yōu)條件為在42℃條件下，用1 mmol·L-1IPTG誘導菌液10 h能使蛋白產(chǎn)量達到較高水平。重組P7蛋白的成功能夠為BVDV病毒孔蛋白機制的研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

實驗在BVDV P7基因的原核表達載體成功構建的同時，通過實驗證實論了該重組蛋白在大腸桿菌中具有較強反應原性。同時對P7基因的生物信息進行分析，說明P7蛋白是一種疏水性蛋白，作為一種病毒孔蛋白，在病毒的裝配和促進透化作用上起了重要作用。

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Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of BVDV P7 Protein

Li Tiantian，Zhai Junjun，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319））

For prokaryotic expression of BVDV P7 gene and its bioinformatics analysis，RT-PCR method was used to amplify BVDV P7 gene which isolated from BVDV-1 NADL，then BamH I and Sal I were used to digest PCR products and this recovered fragment was inserted into the pEGX4T-1（+），a prokaryotic expression vector，to generate recombinant pEGX4T-1-P7.pEGX4T-1-P7 was transformed into E.coli BL21，using bioinformatics technology for bioinformatics prediction at the same time.The results showed that amplification was successful and the BVDV NADL strains of BVDV-1 P7 prokaryotic expression vector were built，named pEGX4T-1-P7.SDS-PAGE and Western blot showed that at expected size a molecular mass of 34 kDa appeared the expressed protein.The bioinformatics analysis by prediction software indicated that the signal peptide and hydrophobic site existed in P7 protein.It concluded that P7 protein was successfully expressed and it was a hydrophobic protein，which established solid foundation for the further study of its functions.

bovine viral diarrhea virus；p7 genes；prokaryotic expression；bioinformatics

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0069-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.014

2015-06-10

黑龍江省青年科學基金（QC2015031）；獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室開放課題基金（SKLVBF201508）。

李田田（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院2014級碩士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生導師，E-mail：nihongbo@sina.com。