劉歡，王亞洲，趙晨旭，趙志波，張妍，崔媛旭，李心慰，劉國(guó)文

（吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062）

一株奶牛糞便中甲烷氧化菌的分離與鑒定

劉歡，王亞洲，趙晨旭，趙志波，張妍，崔媛旭，李心慰，劉國(guó)文

（吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062）

甲烷氧化菌是一類(lèi)能以甲烷和甲醇作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物。利用甲烷氧化菌選擇性培養(yǎng)基從健康奶牛糞便樣本中分離、篩選多株甲烷氧化菌，選擇其中一株對(duì)甲烷代謝率較高的菌株命名為M17，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察、16S rDNA同源性比對(duì)以及理化性質(zhì)分析的研究。結(jié)果表明，該菌株屬于甲烷氧化菌Methylobacterium屬，能夠利用多種碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但以甲醇為碳源生長(zhǎng)最為良好，最適生長(zhǎng)溫度為35℃，最適pH為6.8左右。

甲烷氧化菌；甲烷；篩選；分離鑒定

隨著溫室效應(yīng)的日益加劇，溫室氣體的研究越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。甲烷（CH4）是一種僅次于二氧化碳的溫室氣體。研究表明，甲烷的溫室效應(yīng)遠(yuǎn)超過(guò)二氧化碳是二氧化碳（CO2）的20～30倍，對(duì)全球氣候變暖的影響作用占15%～20%[2]。大氣中的甲烷主要來(lái)源于反芻動(dòng)物、稻田、采礦、濕地及化石能源，其中反芻動(dòng)物排放為最主要的人為排放源[3]。在我國(guó)，動(dòng)物胃腸道發(fā)酵所排放甲烷量占總甲烷排放量的29.7%[4]，奶牛生產(chǎn)中攝入總能的6%～10%在瘤胃消化過(guò)程中被轉(zhuǎn)化為甲烷，產(chǎn)生的甲烷主要以噯氣的方式排出。腸道產(chǎn)生的甲烷約90%通過(guò)血液循環(huán)到肺部最后通過(guò)口腔排出，而其余10%的甲烷則由肛門(mén)以廢氣的方式排出[5-6]。反芻動(dòng)物甲烷的排放不僅造成了攝入量的巨大損失，同時(shí)也造成了對(duì)環(huán)境的污染。因此，如何減少反芻動(dòng)物甲烷排放，對(duì)減緩氣候變暖和飼料的高效利用具有重要現(xiàn)實(shí)意義。從奶牛糞便中進(jìn)行甲烷氧化菌的分離鑒定，并對(duì)其形態(tài)、生長(zhǎng)條件、甲烷利用率等進(jìn)行觀(guān)察檢測(cè)，為以甲烷氧化菌為主要益生菌的微生態(tài)制劑的制備提供原材料，同樣為甲烷氧化菌微生態(tài)制劑的研制及環(huán)境治理上提供一定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糞便樣品取自吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地；甲烷購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)春巨洋氣體有限公司，純度99.9%；甲醇購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)春保利生物試劑有限公司，純度為99.9%。甲烷氧化菌培養(yǎng)基[7]，其主要成分：A液（1 000 mL）：KH2PO41.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.8 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO43.0 g。微量元素B液（1 000 mL）：MgSO4·7H2O 3.0 g，MnSO4·2H2O 0.5 g，Nacl 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO45H2O 0.01 g，AlK（SO4）20.01 g，H3BO30.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g。（所有試劑均為分析純）

A液、B液分別配制，取A液990 mL與B液10 mL（99∶1）混合，作為甲烷氧化菌的培養(yǎng)基（Higgensnitrateminimalsalt，NMS）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集

取基地奶牛場(chǎng)營(yíng)養(yǎng)狀況良好、無(wú)患病情況健康奶牛的新鮮糞便20 g于含有200 mL NMS培養(yǎng)基的無(wú)菌瓶中，充分震蕩、混勻轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2.2 甲烷氧化菌的富集培養(yǎng)

取上述混合液體充分振蕩，用四層紗布過(guò)濾，取濾液20 mL于含有200 mL滅菌NMS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，用橡膠瓶塞密封，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇200 μL，確保甲醇含量（V/V）為0.1%，以甲醇為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)。搖床條件：170 r·min-1、37℃氣浴搖床培養(yǎng)。待菌液顏色變?yōu)榉凵?，即? mL于新的含有200 mL滅菌NMS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，用橡膠瓶塞密封，以甲醇為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)。如此轉(zhuǎn)接3次，多次重復(fù)以至純化。

1.2.3 甲烷氧化菌的純化培養(yǎng)

稀釋上述富集培養(yǎng)的甲烷氧化菌菌液，經(jīng)過(guò)平板涂布法涂布到固體培養(yǎng)基上，將甲醇加至平皿蓋，倒置平皿放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，底部甲醇揮發(fā)為甲烷氧化菌生長(zhǎng)提供碳源。待單菌落長(zhǎng)出用滅菌接種環(huán)挑去單菌落進(jìn)行平板劃線(xiàn)分離，如此重復(fù)轉(zhuǎn)接3次獲得甲烷氧化菌純化單一菌株。

1.3 甲烷氧化菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

將分離得到的甲烷氧化菌菌株用平板劃線(xiàn)的方法在平板上37℃恒溫培養(yǎng)96 h左右，觀(guān)察平板上的菌落形態(tài)、顏色、透明度、菌落邊緣隆起情況等[8]。

1.3.2 理化性質(zhì)鑒定[9]

將經(jīng)過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)的菌涂片和固定，革蘭氏染色。將菌株進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 DNA的提取

用美國(guó)BIOMIGA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

用已提取的目的菌基因組總DNA為模板，用16S rDNA通用引物對(duì)目的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。

引物16S rDNA設(shè)計(jì)：

上游引物：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

下游引物：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

PCR反應(yīng)體系如下：

模板DNA 1uL

上游引物 1uL

下游引物 1uL

2×Taq plus 12.5uL

ddH2O 9.5 uL

PCR反應(yīng)條件：

95℃預(yù)變性7 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。利用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑取單克隆，使用快速小提試劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序。由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成目的菌株的16S rDNA部分序列測(cè)序，采用BLAST軟件在GeneBank上進(jìn)行同源性比較。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：將所測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，選取相關(guān)序列以ClustalW進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用MAGE 5.3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 不同溫度、pH、底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

1.4.1 溫度對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

將甲烷氧化菌M17接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定溫度在20℃～45℃，每5℃為一個(gè)梯度進(jìn)行培養(yǎng)，37℃氣浴搖床培養(yǎng)96 h后620 nm測(cè)定菌液OD值。

1.4.2 pH對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

將甲烷氧化菌M17接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定pH分別為4、5、6、7、8、9、10，37℃氣浴搖床培養(yǎng)96 h后620 nm測(cè)定菌液OD值。

1.4.3不同底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

分別用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉，甲醇作為碳源，每天加入定量上述碳源于液體培養(yǎng)基，37℃氣浴搖床培養(yǎng)96 h后620 nm測(cè)定菌液OD值。

1.5 菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律

以1%的接種量把甲烷氧化菌接入到裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，通入1∶1（v/v）的空氣和甲烷氣體。37℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲烷氧化菌的篩選

將純化培養(yǎng)得到的不同單一菌株接種到液體培養(yǎng)基中，通入1∶1（v/v）的空氣和甲烷氣體，37℃氣浴搖床培養(yǎng)，分別在3、7和12 d取培養(yǎng)瓶中氣體并用氣相色譜儀測(cè)定培養(yǎng)瓶中甲烷氣體含量，根據(jù)其對(duì)甲烷的消耗率從而得到氧化甲烷能力最強(qiáng)的目的菌株，命名為M17。

2.2 甲烷氧化菌的鑒定

生理生化鑒定表明：菌株在平板培養(yǎng)基上形成隆起的圓形菌落，表面光滑，灰白色半透明狀，較濕潤(rùn)，菌落邊緣整齊，直徑較小約0.8 mm左右。在顯微鏡下觀(guān)察，其個(gè)體形態(tài)呈短桿狀，革蘭氏染色陰性。產(chǎn)H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陰性；甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加菌液顏色發(fā)生變化，剛接種時(shí)菌液清澈透明為培養(yǎng)基的顏色，培養(yǎng)2～ 3 d后變?nèi)榘咨珳啙針樱?dāng)培養(yǎng)4～7 d達(dá)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后變?yōu)榉凵?，粉色產(chǎn)生的原因可能是甲烷氧化菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌某種色素的結(jié)果。

圖1 甲烷氧化菌M17革蘭氏染色圖Fig.1 The Gram stain of the strain M17

圖2 甲烷氧化菌M17菌液顏色變化Fig.2 The color change of bacterial fluid

2.3 甲烷氧化菌掃描電鏡觀(guān)察

圖3 甲烷氧化菌M17電鏡掃描圖（×10K）Fig.3 Scanning electron micrograph of methanotrophs M17（×10K）

2.4 分子生物學(xué)鑒定

（1）菌株M17的16S rDNA的序列擴(kuò)增及測(cè)定

提取菌株M17的基因組DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖電泳分析，結(jié)果如圖3所示。

圖4 甲烷氧化菌M17 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 16S rDNA PCR electrophoretogram production of methanotrophs M17

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑取單克隆，使用快速小提試劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序，共1 507 bp，具體序列如下所示：

采用BLAST軟件在GeneBank上對(duì)菌株M17的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)M17的16S rDNA序列與甲基桿菌屬（Methylobacterium radiotolerans JCM plasmid pMRAD）關(guān)系最緊密。

（2）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將所測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，調(diào)出GenBank中已鑒定菌株的相似種屬16S rDNA序列，以ChistalW進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用MAGE 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖所示：

圖5 基于16S rDNA序列的甲烷氧化菌M17的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic neighbour-joining tree of the methanotrophs M17 based on 16S rDNA sequences

3 不同溫度、pH、底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

3.1 溫度對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

將甲烷氧化菌M17接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定溫度在20～45℃，每5℃為一個(gè)梯度進(jìn)行培養(yǎng)，96 h后測(cè)定其OD值，如圖所示，甲烷氧化菌M17的最適生長(zhǎng)溫度為35℃。

圖6 溫度對(duì)甲烷氧化菌M17生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the cell growth of methanotrophs M17

3.2 pH對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響：

將甲烷氧化菌M17接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定pH分別為4、5、6、7、8、9、10，37℃培養(yǎng)96 h后，測(cè)定甲烷氧化菌OD值，結(jié)果表明菌株在pH=6.8～7.0時(shí)生長(zhǎng)最為良好。

圖7 pH對(duì)甲烷氧化菌M17生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of pH on the cell growth of methanotrophs M17

3.3 不同碳源對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響

分別用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉和甲醇作為碳源，每天加入定量上述碳源于液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)96 h后測(cè)其OD值，如圖所示，甲烷氧化菌能夠以甲醇、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖為碳源較好的生長(zhǎng)，其中對(duì)于甲醇的利用效果最為明顯，而以淀粉作為碳源時(shí)生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)。

圖8 甲烷氧化菌M17的碳源實(shí)驗(yàn)Fig.8 Carbon utilization test of the methanotrophs M17

4 菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律

在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體培養(yǎng)液的OD值，以1%的接種量把甲烷氧化菌接入到培養(yǎng)瓶中，通入1∶1（v/v）的空氣和甲烷氣體。37℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體的OD值。

圖9 甲烷氧化菌M17的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Fig.9 The growth curve of the methanotrophs M17

5 討論

甲烷氧化菌是一類(lèi)能以甲烷和甲醇作為唯一底物進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物[11]，它能通過(guò)以甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO）開(kāi)始的一個(gè)酶系在分子氧作用下將甲烷直接氧化成甲醇，再由其他酶最終代謝成CO2和水[12]。因此，甲烷氧化菌依靠其對(duì)甲烷獨(dú)有的同化和異化方式，在工業(yè)、畜牧業(yè)、瓦斯治理和環(huán)境治理方面都有重要的利用價(jià)值。近年來(lái)，科學(xué)家們從不同極端環(huán)境中都分離出不同種屬的甲烷氧化菌，并根據(jù)其自身特性應(yīng)用到不同的研究領(lǐng)域。

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中，反芻動(dòng)物甲烷排放是最主要的人為排放源[13]。在我國(guó)，甲烷總排放量的三分之一來(lái)源于動(dòng)物胃腸道發(fā)酵排放，奶牛生產(chǎn)中有6%～10%的攝入總能被轉(zhuǎn)化為甲烷[5-6]，產(chǎn)生的甲烷最后又通過(guò)口腔和肛門(mén)排出[14]。甲烷在奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中不僅造成了動(dòng)物對(duì)飼料的低效率利用，減少了食物能量的吸收以及物質(zhì)的浪費(fèi)，同樣也造成了人為甲烷的大量排放，使環(huán)境遭受污染[15]。

實(shí)驗(yàn)從奶牛糞便中成功分離并鑒定出一株甲烷氧化菌，實(shí)驗(yàn)篩選所得菌株最適生長(zhǎng)溫度為35～37℃，最適pH為6.8～7.0之間，適宜培養(yǎng)條件均與動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)環(huán)境相似。在瘤胃復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境中有著大量包括甲烷氧化菌在內(nèi)的微生物存在，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以奶牛自身代謝產(chǎn)物分離所得菌種即甲烷氧化菌作為主要益生菌，與瘤胃內(nèi)其他真菌如可以改善瘤胃內(nèi)菌群的生長(zhǎng)，穩(wěn)定瘤胃發(fā)酵的酵母菌相混合制備成甲烷氧化菌微生態(tài)制劑[16-17]。瘤胃微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃細(xì)菌具有激活和增強(qiáng)其繁殖速度并且能穩(wěn)定瘤胃酸度的作用，從而對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境起到調(diào)控作用[18]。將甲烷氧化菌微生態(tài)制劑應(yīng)用于畜牧業(yè)實(shí)際生產(chǎn)，在提高飼料利用率、加快飼料蛋白質(zhì)水解、減少溫室氣體甲烷排放等方面具有特殊的價(jià)值，為節(jié)能減排目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供基礎(chǔ)保障。

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Isolation and Identification of Methanotrophs of Dairy Cattle Stool

Liu Huan，Wang Yazhou，Zhao Chenxu，Zhao Zhibo，Zhang Yan，Cui Yuanxu，Li Xinwei，Liu Guowen

（Veterinary Medicine College of Jilin University，Changchun 130062）

Methanotroph was a kind of bacteria which could use methane as the sole carbon source and energy for their growth.The multiple strains of methanotrophs were isolated and purified using methanotrophs selective media from the stool sample of healthy dairy cattle.One methanotroph was chosen that had high metabolism of methane and named M17.The morphology，16S rDNA homology alignment and physicochemical property of M17 methanotroph were detected.The results showed that M17 belonged to Methylobacterium，which could use a variety of carbon sources to growth，especially for methanol.The cultivation temperature of M17 was 35℃and pH was 6.8.

methanotrophs；methane；screened；isolation and identification

S816.32

A

1002-2090（2016）06-0025-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.005

2015-10-18

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD21B01-1）。

劉歡（1991-），男，吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

劉國(guó)文，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：liuguowen2008@163.com。