劉 丹， 鐘偉軍， 徐新軍， 姚美村， 陳纘光

(中山大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

自制微流控芯片分析儀用于藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)

劉 丹， 鐘偉軍， 徐新軍， 姚美村， 陳纘光

(中山大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

微流控芯片具有高效、快速、微量、微型化等技術(shù)特點(diǎn)。采用自主研制的簡易型微流控芯片分析儀測(cè)定賴氨酸顆粒劑中賴氨酸含量,將該實(shí)驗(yàn)列為本科生藥物分析實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)內(nèi)容,用較低的投入使學(xué)生掌握學(xué)科前沿技術(shù)與應(yīng)用,取得了較好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

微流控芯片； 藥物分析； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)

藥物分析是應(yīng)用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)的方法和技術(shù),研究化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確的合成藥物或天然藥物及其制劑,以及代表性的中藥制劑和生化藥物及其制劑的質(zhì)量控制方法[1]。在藥品質(zhì)量控制、新藥研發(fā)等方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。藥物分析具有涉及面廣、內(nèi)容多、實(shí)驗(yàn)性強(qiáng)等特點(diǎn),是一門實(shí)踐性、應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科。在藥物分析課程的學(xué)習(xí)中學(xué)生不僅要學(xué)習(xí)相應(yīng)的理論基礎(chǔ)知識(shí)，而且得到實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練[2-4]。

賴氨酸是人體必需氨基酸之一,能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。是世界上僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種。目前賴氨酸的分離檢測(cè)方法主要是用高效液相色譜法和茚三酮顯色法[5-8]，但這兩種方法分析成本高,操作復(fù)雜且分析時(shí)間長。

微流控芯片是近年發(fā)展起來的一種新型的分離分析技術(shù)。它將進(jìn)樣、分離、檢測(cè),以及化學(xué)反應(yīng)、藥物篩選、細(xì)胞培養(yǎng)與分選等操作集成在幾平方厘米的芯片上進(jìn)行,具有高效、快速、微量、微型化等特點(diǎn)[9-10]。本課題組采用自主研制的簡易型微流控芯片分析儀測(cè)定賴氨酸顆粒劑中賴氨酸的含量,目前在國內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo)。該方法快速、靈敏、低耗、樣品處理簡單、重現(xiàn)性好。從2010年起將“微流控芯片分析法測(cè)定賴氨酸顆粒劑中賴氨酸含量”實(shí)驗(yàn)作為藥物分析實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)內(nèi)容,用較低的投入使學(xué)生掌握學(xué)科前沿技術(shù)與應(yīng)用,取得了較好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)原理

目前的微流控芯片,主要為芯片毛細(xì)管電泳,其原理是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力,以芯片毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為等的差異而實(shí)現(xiàn)高效、快速分離的一種分離分析新技術(shù)。

簡單的微流控芯片分析儀由高壓電源、芯片和電導(dǎo)檢測(cè)器組成。高壓電源提供進(jìn)樣電壓和分離電壓。芯片設(shè)有進(jìn)樣通道和分離通道。電導(dǎo)檢測(cè)器是較通用的檢測(cè)器,適用于荷電成分的檢測(cè),本實(shí)驗(yàn)室研制的非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器,電極與溶液不接觸,避免了電極污染中毒和高壓干擾等問題[11-12],而且芯片與檢測(cè)電極板之間相互獨(dú)立,更換和清洗操作非常方便。

2 實(shí)驗(yàn)方案

2.1 儀器與試劑

儀器:微流控芯片分析儀(包括雙路高壓電源、非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器、十字通道芯片,均為中山大學(xué)藥學(xué)院研制)[13]；循環(huán)水式真空泵。

試劑:硝酸、氫氧化鈉、硼酸、乙二胺,均為分析純；L-賴氨酸對(duì)照品(中國計(jì)量科學(xué)研究院)；L-賴氨酸鹽酸鹽顆粒劑(上海衡山藥業(yè)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 芯片的清洗:依次用0.2 mol/L 硝酸和超純水清洗 5 min。

(2) 芯片的活化:先用0.1 mol/L NaOH 活化 5 min,然后用超純水清洗 5 min,最后用緩沖溶液(硼酸與乙二胺的濃度(mmol/L)比為5∶15)平衡 5 min。

(3) 測(cè)定:先在芯片儲(chǔ)液池 a、c、e (見圖1)中加入運(yùn)行緩沖溶液(硼酸與乙二胺濃度比為15∶5),再向樣品池b 中加入供試品或?qū)φ掌啡芤?；將高壓電源的進(jìn)樣電源正負(fù)極分別置于儲(chǔ)液池b和c中,分離電源正負(fù)極分別置于儲(chǔ)液池a和e中；開啟高壓電源進(jìn)入進(jìn)樣狀態(tài),在b-c(進(jìn)樣通道)之間加進(jìn)樣電壓20 s(首次進(jìn)樣足夠長時(shí)間,一般為20～30 s,使樣品達(dá)到b-c之間的分離通道a-e)；然后切換至分離電壓2.00 kV(可調(diào))并同步啟動(dòng)數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行記錄。重復(fù)進(jìn)樣10 s,切換分離檢測(cè)并記錄。

圖1 微流控芯片分析儀示意圖

2.3 含量測(cè)定

(1) 對(duì)照品的測(cè)定:精密稱取L-賴氨酸對(duì)照品0.020 0 g,加超純水溶解并定容于10 mL容量瓶中,得濃度為2.00 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取L-賴氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(2.00 g/L),配成濃度為0.50×102、1.00×102、2.00×102、4.00×102、8.00×102、10.00×102mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在相同的實(shí)驗(yàn)的條件下,分別進(jìn)樣,獲得電泳譜圖(見圖2)，曲譜圖測(cè)量賴氨酸峰面積。以所測(cè)量的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制工作曲線并計(jì)算回歸方程。

圖2 L-賴氨酸對(duì)照品的微流控芯片毛細(xì)管電泳譜圖

(2) 樣品的測(cè)定:精密稱取適量供試品(約相當(dāng)于賴氨酸 0.1 g),用超純水溶解,定容于100 mL容量瓶中,搖勻,濾過,精確取濾液2 mL,置10 mL量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻。在相同條件下進(jìn)樣,測(cè)量賴氨酸的峰面積。將測(cè)得的樣品溶液峰面積代入回歸方程中,求得樣品溶液的濃度,并計(jì)算樣品中L-賴氨酸的含量。

3 開設(shè)本實(shí)驗(yàn)課的意義

3.1 強(qiáng)化理論知識(shí),鍛煉操作技能

將每班學(xué)生分成若干小組,每組4～5人,每組獨(dú)立開展實(shí)驗(yàn)。各小組內(nèi)學(xué)生既有分工又有合作,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,要求每個(gè)學(xué)生獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。學(xué)生在報(bào)告中要說明電泳譜圖中各電泳峰先后出現(xiàn)的原因,各電泳峰的歸屬和成因。通過此次實(shí)驗(yàn)課,學(xué)生普遍反映與單純的講授微流控芯片的理論知識(shí)相比,通過具體的實(shí)驗(yàn)操作,對(duì)該儀器有了更清晰的認(rèn)識(shí),不但理解了儀器原理,掌握了操作步驟,還熟悉了圖形和數(shù)據(jù)的處理分析方法。

微流控芯片分析儀測(cè)定賴氨酸顆粒劑中賴氨酸含量的實(shí)驗(yàn)中,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多。如電泳運(yùn)行液的組成和濃度、分離電壓、進(jìn)樣電壓、進(jìn)樣時(shí)間等。

在這些影響因素中,有的涉及樣品的分離度,有的涉及分析方法的精密度和重現(xiàn)性，有的是關(guān)鍵因素,有的是次要因素[14]。在實(shí)驗(yàn)過程中,通過引導(dǎo)學(xué)生改變參數(shù)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以對(duì)這些影響因素有全面的認(rèn)識(shí)。通過這樣的實(shí)踐,有助于樹立學(xué)生科學(xué)思維和嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度,鍛煉學(xué)生獨(dú)立思考能力。

3.2 加快了科研成果的轉(zhuǎn)化

微流控芯片分析儀是本課題組的科研成果,將其應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué),加快了科技成果轉(zhuǎn)化進(jìn)程?！拔⒘骺匦酒治龇y(cè)定賴氨酸顆粒劑中賴氨酸含量”實(shí)驗(yàn)從2010年開始作為藥物分析實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)內(nèi)容,在多年教學(xué)實(shí)踐過程中,不斷完善教學(xué)方案,教學(xué)手段更加科學(xué)。隨著本課題組對(duì)微流控芯片分析儀研究的不斷深入,儀器性能更加穩(wěn)定,將其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué),取得了較好的教學(xué)效果。

4 結(jié)語

藥物分析實(shí)驗(yàn)課是藥物分析課程的重要組成部分,不僅是驗(yàn)證、補(bǔ)充理論,而且對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維方法、創(chuàng)新能力及全面掌握基本操作技能,全面推進(jìn)素質(zhì)教育有著重要的作用[15]。因此在設(shè)置課程內(nèi)容時(shí),應(yīng)適當(dāng)增加一些學(xué)生相對(duì)陌生而目前科研中較為熱點(diǎn)的現(xiàn)代分析儀器的使用,以提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和擴(kuò)展學(xué)生的知識(shí)廣度[16]。本課題組根據(jù)自身優(yōu)勢(shì),將簡易型微流控芯片分析儀用于本科藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué),從實(shí)驗(yàn)儀器、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、技術(shù)革新方面使學(xué)生素質(zhì)和創(chuàng)新能力培養(yǎng)有較大提升。該實(shí)驗(yàn)具有效率高、試劑消耗少、分析成本低的優(yōu)點(diǎn),經(jīng)過多年的實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐,用較低的投入使學(xué)生掌握學(xué)科前沿技術(shù)與應(yīng)用,得到學(xué)生的一致好評(píng)。

References)

[1] 杭太俊.藥物分析[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.

[2] 劉瑞華,李琳,朱元元.藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)的思考和建議[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2011,14(2):60-62.

[3] 扈本全,王樹春,張宇潔,等.藥學(xué)專業(yè)《藥物分析實(shí)》實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與探索[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2013,30(4):1674-1675.

[4] 崔永霞,謝彩俠,白雁.“中藥制劑分析”實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的改革[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2009,28(10):106-107.

[5] 王艷芳,李琴,汪六英,等.高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖酸鈣鋅口服液中鹽酸賴氨酸的含量[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2012,12(34):9309-9312.

[6] 趙鑫,肖玉平,黃榮林,等.高效液相色譜法測(cè)定精氨酸中的賴氨酸[J].西北藥學(xué)雜志,2013,28(4):373-375.

[7] 姜安娜,曹名鋒,李慶剛,等.一種改進(jìn)的賴氨酸濃度測(cè)量方法[J].生物技術(shù)通報(bào),2013(2):190-194.

[8] 劉飛飛,李群,于嵐.茚三酮比色法定量檢測(cè)賴氨酸條件的研究[J].中國食品添加劑,2010(5)：223-225.

[9] Fredrickson C K, Fan Z H, Macrotomicro Interfaces for Microfluidic Devices[J].Lab on A Chip,2004,4(6):526-533.

[10] Lichtenberg J, de Rooij N F,Verpoorte E.Sample Pretreatment on Microfabricated Devices[J].Talanta,2002(2):233-266.

[11] 蔡自由,李永沖,陳纘光.微流控芯片測(cè)定鹽酸嗎啉呱片含量[J].藥物分析雜志,2011,31(8):1492-1495.

[12] Song Z R,Xu Y,Cheng Z G,et al. Quantification of lactate in synovia by microchip with contactless conductivity detection[J].Anal Biochem,2013,434(1):73-77.

[13] Chen Zuanguang, Li Quanwen, Li Oulian, et al. A thin glass chip for contactless conductivity detection in microchip capillary electrophoresis[J].Talanta, 2007(71):1944-1950.

[14] 謝天堯,劉丹,賴瑢,等.手性藥物對(duì)映體分離檢測(cè)的研究式開放實(shí)驗(yàn)[J].大學(xué)化學(xué),2014,29(6):38-40.

[15] 聞俊,周婷婷,洪戰(zhàn)英,等.基于創(chuàng)新能力培養(yǎng)的藥物分析實(shí)驗(yàn)課程研究[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育,2013,15(3):263-266.

[16] 韓清娟,張惠靜,張夢(mèng)軍,等. 藥學(xué)專業(yè)藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的思考和探索[J].西北醫(yī)學(xué)教育,2014,22(6):1170-1172.

Self-developed micro-fluidic chip analyzer applied to experimental teaching of pharmaceutical analysis

Liu Dan, Zhong Weijun, Xu Xinjun, Yao Meicun, Chen Zuanguang

(School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China)

Micro-fluidic chip has technical characteristics of high efficiency, celerity, micro-content and miniaturization. The self-developed simple micro-fluidic chip analyzer is used to detect the content of lysine in lysine granules. This experiment is listed as teaching content of the experimental course of Pharmaceutical Analysis for undergraduate students. With the relatively low input, the students can master the frontier technology and application so that good effect of the experimental teaching is achieved.

micro-fluidic chip; pharmaceutical analysis；experimental teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.12.014

2016-06-01

廣東省“教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程”建設(shè)項(xiàng)目；中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究(改革)

資助

劉丹(1973— )，女，貴州黔西，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物分析.

E-mail：775894956@qq.com

陳纘光(1961—)，男，廣東陽江，博士，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治?

E-mail：chenzg@mail.sysu.edu.cn

R917;G642.423

: B

: 1002-4956(2016)12-0053-03