高 雯, 宋慧鵬, 楊 華, 李 萍(天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)藥科大學(xué), 江蘇 南京 210009)

鄒漢法研究員紀(jì)念專(zhuān)輯(下)·專(zhuān)論與綜述

在線二維液相色譜技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

高 雯, 宋慧鵬, 楊 華, 李 萍*
(天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)藥科大學(xué), 江蘇 南京 210009)

中藥的組成復(fù)雜,其化學(xué)成分的表征和識(shí)別一直是中藥研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。在線二維液相色譜是基于兩種分離模式構(gòu)建的色譜分析技術(shù),主要包括中心切割二維液相色譜和全二維液相色譜兩種模式,因二者具有更高的峰容量而在中藥研究中備受青睞。該文對(duì)在線二維液相色譜技術(shù)的概念和特點(diǎn)進(jìn)行了討論,并對(duì)二維液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,以期為該技術(shù)在中藥質(zhì)量控制、物質(zhì)基礎(chǔ)表征、活性成分篩選等研究方面提供一定參考。

全二維液相色譜;中心切割二維液相色譜;中藥分析;活性成分篩選;綜述

中藥化學(xué)成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),但往往一味中藥就囊括了從極性到非極性、從小分子到大分子的多種化合物，其組成極為復(fù)雜。因此,對(duì)中藥化學(xué)成分進(jìn)行全面、快速地表征一直是中藥分析研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn),也是研究和闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的先決條件。在現(xiàn)代中藥研究中,色譜技術(shù)尤其是液相色譜(LC)作為最常用的分離、分析手段扮演著不可替代的角色。多維液相色譜的建立和運(yùn)用也為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)表征和活性成分篩選提供了新技術(shù)。本文對(duì)在線二維(2D)液相色譜技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,以期為中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路。

1 二維液相色譜的發(fā)展及類(lèi)型

近20年,色譜柱的固定相類(lèi)型、填料粒徑和高壓系統(tǒng)的發(fā)展大大提高了色譜分析的速度,色譜的分離模式也逐漸由一維模式向多維模式發(fā)展[1]。根據(jù)多維色譜聯(lián)用的總峰容量約等于各維峰容量的乘積這一理論[2],將兩種以上不同分離機(jī)理的色譜柱串聯(lián)使用,可顯著提高分析的分辨率和峰容量,適于中藥復(fù)雜成分的分析和表征[3]。

最初建立的二維液相色譜為離線(off-line)模式,即將第一維(1D)色譜洗脫的餾分收集、濃縮后,再進(jìn)行第二維(2D)色譜分析[4]。這種方法的兩個(gè)色譜柱往往不直接關(guān)聯(lián),不受流動(dòng)相兼容問(wèn)題的影響,因而可以采用不同分離機(jī)理的兩種色譜進(jìn)行分析,且儀器裝置比較簡(jiǎn)單[5]。然而離線模式在收集-濃縮-再分析的過(guò)程中樣品易損失、重現(xiàn)性差，且耗時(shí)、耗力[6],因此從離線模式發(fā)展為在線(on-line)模式是當(dāng)今二維液相色譜的發(fā)展趨勢(shì)。在線二維模式是通過(guò)閥或相應(yīng)部件將兩根色譜柱相連,1D色譜洗脫的餾分自動(dòng)進(jìn)入2D液相色譜[7]。在線模式可分為中心切割二維液相色譜(heart-cutting LC-LC)和全二維液相色譜(comprehensive LC×LC)兩種。

1.1 中心切割二維液相色譜

Heart-cutting LC-LC模式是指混合物經(jīng)第一維色譜分離后,目標(biāo)物的一個(gè)或幾個(gè)組分通過(guò)在線切換依次轉(zhuǎn)入第二維色譜,從而進(jìn)一步分離分析。通常目標(biāo)組分會(huì)按照出峰時(shí)間整個(gè)切入第二維,因此需要在第一維色譜后連接檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。兩維色譜之間常以六通閥進(jìn)行連接,若第一維和第二維需采用不同的流動(dòng)相,還會(huì)再增加一個(gè)定量環(huán)(loop環(huán))或富集柱進(jìn)行目標(biāo)組分的收集或富集,其典型裝置示意圖見(jiàn)圖1。六通閥首先在A位置,樣品在第一維色譜柱上進(jìn)行分析;當(dāng)目標(biāo)組分出峰并在loop環(huán)中完成收集后,六通閥切換到B位置,目標(biāo)組分進(jìn)入第二維色譜進(jìn)行分離;此時(shí)第一維色譜可根據(jù)下一個(gè)目標(biāo)組分的出峰時(shí)間繼續(xù)分析或停止等待。該模式中第一維色譜和第二維色譜不(不必須)同時(shí)進(jìn)行工作,完成一次分析所需時(shí)間為第一維色譜分析時(shí)間與第二維色譜分析時(shí)間之和,但與off-line模式相比，提高了自動(dòng)化程度。在線模式方法的建立及條件優(yōu)化主要考慮第一維色譜的切出/第二維色譜的切入時(shí)間,以及一維色譜餾分的體積對(duì)二維色譜峰展寬的影響。為使第一維切出的組分獲得更好的分離，第二維通常選用更長(zhǎng)的色譜柱及更多變的分析梯度。

圖1 包含loop環(huán)的常見(jiàn)中心切割二維LC-LC示意圖Fig. 1 Schematic diagrams of heart-cutting LC-LC with loop transfers a. The eluent from1D column was collected in the loop under monitor in position A; b. the pre-collected eluent in loop was separated in the2D column in position B.

1.2 全二維液相色譜

全二維液相色譜模式是樣品經(jīng)第一維色譜分離后所有組分均通過(guò)閥切換轉(zhuǎn)入第二維色譜進(jìn)行分析的在線二維液相色譜模式。根據(jù)Schoenmakers等[8]提出的定義,全二維色譜需包含以下3個(gè)特征:(1)樣品中所有成分的分離分析均經(jīng)過(guò)兩種模式;(2)所有樣品成分均以同等比例經(jīng)過(guò)兩維分離柱后進(jìn)入檢測(cè)器;(3)樣品中任意兩個(gè)化合物在第一維色譜柱中的分離順序和分離度會(huì)傳遞至第二維色譜柱。在所建立的全二維液相色譜系統(tǒng)中,第二維可采用兩根平行的色譜柱進(jìn)行交替分析[9],或通過(guò)在第一維色譜和第二維色譜間連接的兩個(gè)loop環(huán)交替收集后，再分別進(jìn)入第二維色譜。目前以loop環(huán)模式最為常用,通過(guò)二位八通閥、二位十通閥或雙二位四通閥實(shí)現(xiàn)在線切換(見(jiàn)圖2)。在進(jìn)行分析時(shí),切換閥首先在A位置,第一維色譜柱的洗脫液進(jìn)入loop環(huán)1,收集相應(yīng)時(shí)間后,切換閥轉(zhuǎn)換到B位置,此時(shí)loop環(huán)1收集的組分進(jìn)入第二維色譜柱進(jìn)行分析,第一維色譜柱的洗脫液進(jìn)入loop環(huán)2進(jìn)行收集;相應(yīng)時(shí)間后,切換閥切回到A位置,進(jìn)行下一輪的收集和分析；如此往復(fù)進(jìn)行,直至第一維色譜的洗脫液全部進(jìn)入第二維色譜完成分析。二位八通閥和二位十通閥是全二維液相色譜較常用的切換閥,二位八通閥的連接流路比較簡(jiǎn)單,但其中一個(gè)loop環(huán)的收集和洗脫會(huì)出現(xiàn)不同方向的情況(見(jiàn)圖2a);二位十通閥可以保證兩個(gè)loop環(huán)收集和洗脫均同方向,但收集和洗脫的流路長(zhǎng)短不一致(見(jiàn)圖2b)。上述兩種模式均因流路不對(duì)稱(chēng)對(duì)全二維液相色譜方法的建立和優(yōu)化有較高要求。近期發(fā)展的雙二位四通閥設(shè)計(jì)則可以實(shí)現(xiàn)流路的完全對(duì)稱(chēng)(見(jiàn)圖2c),進(jìn)一步簡(jiǎn)化了全二維液相色譜方法的建立和運(yùn)用。

圖2 (a)二位八通閥、(b)二位十通閥和(c)雙二位四通閥連接兩個(gè)loop環(huán)的全二維液相色譜示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of comprehensive LC×LC set-up with (a) two-position eight-port switching valve, (b) two-position ten-port switching valve and (c) dual two-position four-port switching valve In position A, the eluent from1D column was collected in the loop 1, the pre-collected eluent in loop 2 was transferred to2D column for analysis; in position B, the eluent in loop 1 was separated in the2D column, and the eluent from1D column was collected in loop 2.

全二維液相色譜的自動(dòng)化程度更高,色譜峰數(shù)據(jù)也不再是典型的保留時(shí)間-響應(yīng)高度的二維圖,而是通過(guò)數(shù)據(jù)處理重新擬合生成的三維等高線圖,即第一維色譜流出液到第二維色譜的切換不依賴(lài)于第一維色譜的出峰情況,而是將等時(shí)間的餾分交替切入第二維色譜中,因此全二維液相色譜的發(fā)展和建立依賴(lài)于儀器控制和數(shù)據(jù)處理軟件的構(gòu)建[10]。此外,第二維色譜需交替分析第一維色譜洗脫的餾分,其分析一次的時(shí)間等于loop環(huán)收集一次樣品的時(shí)間,分析次數(shù)等于兩個(gè)loop環(huán)收集樣品的總次數(shù),因此整個(gè)全二維液相色譜一次分析的時(shí)長(zhǎng)取決于第一維色譜的分析時(shí)間。在方法建立和條件優(yōu)化時(shí),需著重考慮第一維色譜流速和閥切換時(shí)間與loop環(huán)收集體積的匹配；loop環(huán)收集體積對(duì)第二維色譜峰展寬的影響；第二維色譜峰的分析效率；第一維和第二維色譜間流動(dòng)相的兼容性。

在色譜柱選擇方面,全二維液相色譜的第一維通常采用微徑色譜柱(micro-bore column)以低流速(μL/min)進(jìn)行洗脫,以減小loop環(huán)的收集體積,避免第二維色譜的色譜峰展寬;早期的第二維色譜常采用柱體積較大的色譜柱以降低高流速引起的高背壓,且采用等度洗脫以減少色譜平衡時(shí)間。隨著高壓/超高壓液相色譜的出現(xiàn)和發(fā)展,目前第二維色譜多采用超高壓色譜柱以大流速快速完成分析。

2 二維液相色譜在中藥分析中的應(yīng)用

2.1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)表征

全二維液相色譜自1978年由Erni等[11]建立以來(lái),在多肽等混合物樣品分析中得到了廣泛應(yīng)用。鄒漢法研究員課題組首先于2004年將構(gòu)建的全二維液相色譜系統(tǒng)用于中藥川芎的多成分分析[12]。第一維采用氰基(CN)柱(200 mm×2.0 mm, 5 μm),以甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相,在0.04 mL/min的流速下梯度洗脫215 min, loop環(huán)的體積為200 μL,收集5 min;第二維采用ODS柱(200 mm×2.0 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%(v/v)乙酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相,在0.7 mL/min的流速下等度洗脫,完成一次分析需5 min,共分析43次,分析過(guò)程中隨著第一維色譜柱洗脫梯度的變化改變第二維色譜的起始梯度,但在一次分析中仍保持等度洗脫。該反相×反相(RP×RP)的全二維色譜系統(tǒng)可較好地兼顧中藥化學(xué)成分中大極性和小極性的化合物。應(yīng)用該方法并結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)器,從川芎提取物中檢測(cè)到了52種化合物。該課題組根據(jù)范氏方程進(jìn)一步優(yōu)化了第一維CN柱的流速(0.13 mL/min),并將第二維色譜柱更換為更耐壓的ODS整體柱,以3.0 mL/min的流速洗脫,完成一次分析需1.5 min,提高了色譜的分辨率,并通過(guò)改進(jìn)色譜峰處理軟件算法來(lái)區(qū)分相對(duì)豐度較低的峰,使改進(jìn)的全二維LC×LC法的峰容量提高到2 440 peak/130 min,并從川芎的提取物中檢測(cè)到120種化合物[13]。在此基礎(chǔ)上,鄒漢法研究員課題組先后建立了脂質(zhì)體柱-ODS柱系統(tǒng)用于銀杏提取物、龍膽瀉肝湯等中藥成分的分析[14,15],為全二維液相色譜用于中藥復(fù)雜成分的分析奠定了基礎(chǔ)。

本文對(duì)近10年報(bào)道的用于中藥分析的全二維液相色譜法進(jìn)行了總結(jié)(見(jiàn)表1)?？梢钥闯?隨著色譜柱填料類(lèi)型的多樣化、商品化,以及高壓/超高壓液相色譜系統(tǒng)的出現(xiàn)和數(shù)據(jù)處理軟件的完善和普及,建立的全二維液相色譜方法更加簡(jiǎn)便,且應(yīng)用范圍更廣。例如銀杏葉提取物中的黃酮類(lèi)成分較多,且?guī)缀醵际且陨借头?、槲皮素和異鼠李素作為苷原的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,采用一維色譜分析較困難，而采用二維色譜分析時(shí),從銀杏葉提取物中檢測(cè)出了61種黃酮類(lèi)化合物,其中25種化合物具有較好的活性[26],與一維色譜方法相比,分析能力大大提高。值得注意的是,由于流動(dòng)相兼容性和大多數(shù)天然產(chǎn)物分離機(jī)制的限制,用于中藥多成分分析的全二維液相色譜多為RP×RP模式。Tian等[19]和Wei等[20]構(gòu)建了用于中藥分析的正相×反相(NP×RP)全二維液相色譜模式,雖然通過(guò)控制流動(dòng)相溫度或改進(jìn)接口可以克服流動(dòng)相兼容問(wèn)題,但在分析過(guò)程中,第一維色譜需暫停分析,等第二維分析結(jié)束后再繼續(xù)進(jìn)行,即第一維和第二維之間難以實(shí)現(xiàn)快速切換,分析時(shí)間較長(zhǎng)。

相比于全二維的整體模式,中心切割技術(shù)只是將第一維分離的部分組分引入第二維,具有較高的針對(duì)性,對(duì)于中藥某些難于分離的成分具有重要意義。例如,由于人參皂苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)極為相似,只用一維色譜無(wú)法完全分離,Yao等[31]采用多次中心切割二維色譜實(shí)現(xiàn)了中成藥中8種人參皂苷類(lèi)化合物的基線分離與準(zhǔn)確定量。由于中藥成分中各化合物的含量不同且基質(zhì)復(fù)雜,常將全二維和中心切割技術(shù)聯(lián)用。Qiao等[32]將中心切割和全二維液相色譜技術(shù)聯(lián)用，對(duì)葛根中的微量成分進(jìn)行分析，將中藥主成分進(jìn)行切割移除后,用質(zhì)譜對(duì)相對(duì)豐度低的峰進(jìn)行解析,最終發(fā)現(xiàn)了9種新化合物。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,該課題組[33]以全二維液相色譜模式在42 min內(nèi)分離了125種化合物,以中心切割模式針對(duì)性地分離了其中13種成分,從而實(shí)現(xiàn)了葛根芩連湯的全面物質(zhì)基礎(chǔ)表征。

2.2 中藥活性成分篩選

中藥是一個(gè)復(fù)雜的整體,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明離不開(kāi)相關(guān)化學(xué)成分的活性評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)方法采用先化學(xué)分離后活性測(cè)試的模式,所需樣品量多且耗時(shí)、耗力,限制了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。隨著分析技術(shù)的發(fā)展,基于高靈敏度、高通量分析方法的在線篩選/評(píng)價(jià)方法大大提高了中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)效率。

將多維色譜技術(shù)與中藥活性成分快速篩選技術(shù)結(jié)合,可以更好地適應(yīng)中藥多變的復(fù)雜體系,也可以明顯提高分析和篩選效率。

2.2.1在線二維色譜與渦流色譜聯(lián)用

渦流色譜(turbulent flow chromatography, TFC)是一種利用大粒徑(>25 μm)填料,使流動(dòng)相在高流速下產(chǎn)生渦流狀態(tài)的色譜技術(shù),具有保留小分子而不保留生物大分子的特性,可以實(shí)現(xiàn)生物樣品中待測(cè)藥物小分子的凈化和富集。其作為生物樣品分析的前處理技術(shù)而得到廣泛應(yīng)用[34]。基于TFC建立的樣品在線預(yù)處理模式是典型的中心切割二維液相色譜模式,其基本過(guò)程為:將大分子和小分子化合物混合后上樣至TFC柱,首先，大分子化合物被洗脫而小分子化合物被保留;待小分子化合物被洗脫時(shí)切入第二維液相色譜柱進(jìn)行分析。TFC柱和液相分析柱之間主要以六通閥連接,從而完成渦流色譜在線凈化樣品的二維液相分析。Xin等[35]在建立的渦流色譜在線預(yù)處理液相分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,通過(guò)加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的親水-β-環(huán)糊精(HP-β-CD),提高載體微透析的提取效率,實(shí)現(xiàn)了微透析-渦流色譜在線預(yù)處理-高速液相色譜分析的二維色譜藥物代謝研究模式,具有在線采樣、分析速度快、穩(wěn)定性高等特點(diǎn),并將其應(yīng)用于貝母生物堿的藥代動(dòng)力學(xué)的研究中。

表1 全二維液相色譜法在中藥分析中的應(yīng)用Table 1 Comprehensive LC×LC applications in traditional Chinese medicine analysis

* The developed comprehensive LC×LC methods are based on NP×RP model; /: unknown; -: the monolithic column; ref.: reference; i.d.: internal diameter; dp: diameter of particles; APCI: atmospheric-pressure chemical ionization; IT: ion trap; TOF: time-of-flight; QTOF: quadrupole time-of-flight; DAD: diode array detector; LTQ: linear ion trap.

圖3 2D-TFC-HPLC-MS法篩選活性成分的示意圖Fig. 3 Schematic diagrams of the 2D-TFC-HPLC-MS method for bioactive components screening a. The valve 1 was in position A. The complexes were eluted from1D column and collected in the loop. b. The valve was switched to the position B. The unbound nature products were eluted from1D column, and the pre-collected complexes in loop were disrupted, then the affinity targets were removed. c. The valve was switched to the position B. The potential bioactive components were analyzed by HPLC-MS. TFC: turbulent flow chromatography.

活性生物大分子(酶、受體、載體蛋白等)是小分子藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥效的重要生物結(jié)合靶標(biāo)之一?；谂c藥理靶標(biāo)結(jié)合的化合物具有潛在的活性這一理論,筆者所在課題組通過(guò)采用兩根TFC柱,建立了以2D-TFC-HPLC-MS為手段的中藥活性分子快速篩選技術(shù),其主要原理見(jiàn)圖3。由圖3可知,將生物活性大分子(如靶蛋白)與中藥提取物進(jìn)行孵育,潛在的活性化合物與靶蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,通過(guò)第一維渦流色譜柱,可以將靶蛋白-小分子復(fù)合物與游離小分子化合物分離;富集到的靶蛋白-小分子復(fù)合物在解離線圈內(nèi)進(jìn)行解離,游離靶蛋白和游離小分子進(jìn)入第二維渦流色譜柱實(shí)現(xiàn)分離;獲得的潛在活性小分子經(jīng)過(guò)二維液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析,從而快速地從中藥復(fù)雜成分中篩選出具有目標(biāo)活性的化合物。將建立的2D-TFC-HPLC-MS法應(yīng)用于貝母類(lèi)生物堿中乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑的篩選,第一維TFC柱為親水親脂平衡(HLB)柱,第二維色譜柱為復(fù)合陽(yáng)離子交換(MAX)柱,通過(guò)方法優(yōu)化和驗(yàn)證,篩選出了8種和11種分別能和乙酰膽堿酯酶(AChE)、丁酰膽堿酯酶(BChE)高效結(jié)合的貝母類(lèi)甾體生物堿,并通過(guò)半抑制濃度(IC50)的測(cè)定,驗(yàn)證其抗膽堿酯酶的活性[36]。為擴(kuò)大2D-TFC-HPLC-MS法的應(yīng)用范圍,改變了TFC的保留機(jī)制,第一維采用MAX柱,第二維采用HLB柱,通過(guò)方法優(yōu)化,可對(duì)強(qiáng)極性和弱酸性成分進(jìn)行分析。利用此系統(tǒng),對(duì)丹參水提物中的黃嘌呤氧化酶抑制劑進(jìn)行篩選,得到3種活性較高的酚酸類(lèi)化合物,分別為丹酚酸A、丹酚酸C和異丹酚酸C,其中丹酚酸C為首次報(bào)道的黃嘌呤氧化酶抑制劑,其活性與陽(yáng)性藥別嘌醇的活性相當(dāng)[37]。所建立的2D-TFC-HPLC-MS系統(tǒng)可使用不同類(lèi)型的TFC柱實(shí)現(xiàn)多種類(lèi)型成分的分析,并具有較好的普適性;在該系統(tǒng)中,1D TFC柱收集大分子化合物,2D TFC柱收集小分子化合物,為T(mén)FC分析方法在中藥活性成分篩選的應(yīng)用提供了新思路。

2.2.2在線二維色譜與細(xì)胞膜色譜聯(lián)用

細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography, CMC)是生物色譜技術(shù)中的一種,其原理是將人或動(dòng)物的活性組織細(xì)胞膜固定在色譜載體的表面,制備成細(xì)胞膜固定相。藥物隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱時(shí)與細(xì)胞膜固定相上的受體發(fā)生相互作用,如果與特定的細(xì)胞膜受體有特異性結(jié)合,就可在細(xì)胞膜色譜模型中反映出來(lái)。CMC技術(shù)是將藥物分子在體內(nèi)與細(xì)胞膜受體相互作用過(guò)程轉(zhuǎn)換為體外的色譜過(guò)程,具有受體親和色譜分離的雙重特性,是研究藥物與活細(xì)胞相互作用的理想技術(shù)[38]。CMC從建立之初就因其在中藥活性篩選方面體現(xiàn)出的較好優(yōu)勢(shì)而受到廣泛關(guān)注。目前CMC已形成較為完善的技術(shù)方法和模型體系,并被廣泛應(yīng)用于多種功效的中藥活性成分篩選[39]。

CMC作為一種生物色譜技術(shù),其色譜分離效率較低,在某種程度上會(huì)影響活性成分的檢測(cè)和辨識(shí)。因此構(gòu)建細(xì)胞膜色譜-二維高效液相色譜分析系統(tǒng),可提高篩選效率。細(xì)胞膜二維液相分析系統(tǒng)的原理類(lèi)似于heart-cutting技術(shù),即第一維CMC篩選出的有效組分流出色譜柱后(紫外檢測(cè)識(shí)別),通過(guò)切換閥切換流入第二維色譜柱進(jìn)行分離分析,用于提高目標(biāo)活性成分的分辨率和鑒定效率。如第一維色譜柱采用人皮膚鱗癌細(xì)胞A431/CMC柱,第二維用ODS分析柱,中間用二位十通閥并聯(lián)兩個(gè)預(yù)柱。第一維洗脫的第一組目標(biāo)成分先進(jìn)入預(yù)柱1進(jìn)行富集,然后轉(zhuǎn)入ODS柱進(jìn)行分析,同時(shí)第二組成分可以在預(yù)柱2進(jìn)行富集后,再轉(zhuǎn)入ODS柱。采用該系統(tǒng),從苦參[40]和紅毛七[41]中篩選得到了具有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體拮抗劑活性的生物堿類(lèi)化合物。第一維采用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR-2/CMC柱,從附子中篩選出有血管表皮生長(zhǎng)因子受體活性的生物堿[42]。采用乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/CMC柱,從厚樸中篩選出抗乳腺癌的活性化合物[43]。采用大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞RBL-2H3/CMC柱,從雙黃連注射液中篩選出可能引起過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)[44]。第一維采用α1A-腎上腺素受體/CMC柱,并用兩個(gè)loop環(huán)代替富集柱用于篩選紅毛七中的α1A-腎上腺素受體拮抗劑[45]。二維CMC-液相篩選方法比一維方法的篩選效率高,但CMC餾分的收集/切換依賴(lài)于第一維色譜后的檢測(cè)器信號(hào)(通常為紫外信號(hào)),存在成分丟失的風(fēng)險(xiǎn)。

Chen等[46]建立了基于CMC的全二維液相色譜分析方法,通過(guò)兩個(gè)loop環(huán)分別往復(fù)收集第一維色譜中的餾分,經(jīng)切換閥往復(fù)切換到第二維分析柱上進(jìn)行分析,從而達(dá)到全二維分析模式。如采用人肝癌細(xì)胞HepG2/CMC柱(流速0.2 mL/min，500 μL loop環(huán)，每2.5 min切換一次)和RP 18e硅膠整體柱(流速3.5 mL/min)-TOF MS系統(tǒng),從黃柏[46]、苦參[46]和鴉膽子[47]中篩選出具有抗肝癌活性的成分;第一維采用人慢性髓原白血病細(xì)胞K562/CMC柱,從青黛中篩選得到活性較好的抗白血病化合物[48]。通過(guò)改進(jìn),將正常心肌細(xì)胞/CMC柱和DOX(多柔比星)誘導(dǎo)心衰細(xì)胞/CMC柱聯(lián)用,并依次作為第一維色譜柱,從附子中特征地篩選得到對(duì)DOX-誘導(dǎo)心力衰竭有效的4種附子生物堿類(lèi)化合物[49]。為從口服黃芩的大鼠血漿中篩選出潛在的抗肝癌活性物質(zhì),在第一維采用HepG2/CMC柱的基礎(chǔ)上,將loop環(huán)換為XDB-C18柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)，對(duì)口服黃芩大鼠的血漿樣品進(jìn)行在線預(yù)處理和富集[50],從而建立篩選中藥在生物體內(nèi)有效物質(zhì)的CMC-全二維液相分析方法。

3 結(jié)論與展望

在線二維液相色譜因峰容量高、分離效率好而受到眾多研究者的青睞。近年來(lái),在線二維液相色譜被廣泛地應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域中復(fù)雜樣品的分析。在線二維液相法在中藥中的應(yīng)用顯著地提高了中藥化學(xué)成分分析和識(shí)別的效率,為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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Application progress of on-line two-dimensionalliquid-chromatography in the analysis oftraditional Chinese medicines

GAO Wen, SONG Huipeng, YANG Hua, LI Ping*
(StateKeyLaboratoryofNaturalMedicines,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Traditional Chinese medicine (TCM) is a complex system, containing hundreds of components. The chemical profiling of TCMs is an important task and still facing great challenges. In recent years, the on-line two-dimensional liquid-chromatography (2D-LC) methods, emerging and powerful separation techniques, offer new possibilities for the global analysis of complex TCM samples. Recent advances of 2D-LC, including heart-cutting two-dimensional liquid-chromatography (heart-cutting LC-LC) and comprehensive two-dimensional liquid-chromatography (comprehensive LC×LC), applied to TCMs analysis are reviewed. Design and application of 2D-LC combined with turbulent flow chromatography (TFC) or cell membrane chromatography (CMC) applied for TCM bioactive components screening are described.

comprehensive two-dimensional liquid-chromatography (comprehensive LC×LC); heart-cutting two-dimensional liquid-chromatography (heart-cutting LC-LC); traditional Chinese medicine analysis; bioactive components screening; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08045

2016-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(81503241);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(20130096140001).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81503241); Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20130096140001).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0121-08

*通訊聯(lián)系人.Tel:(025)83271379,E-mail:liping2004@126.com.