駱 丹, 馮鈺锜, 姚勁挺, 孫友寶, 黃濤宏, 端裕樹(1. 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 43007; . 島津企業(yè)管理(中國)有限公司, 上海 0005)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

化學(xué)衍生輔助液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定枇杷膏中的齊墩果酸和熊果酸

駱 丹1,2, 馮鈺锜1*, 姚勁挺2, 孫友寶2, 黃濤宏2, 端裕樹2
(1. 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430072; 2. 島津企業(yè)管理(中國)有限公司, 上海 200052)

建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)同時(shí)測定齊墩果酸和熊果酸含量的分析方法,利用衍生化試劑N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N,N-二甲基乙二胺(d4-DMED)分別衍生樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的目標(biāo)分析物,并將標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生產(chǎn)物作為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)。該方法線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.99;齊墩果酸和熊果酸的檢出限(S/N=3)分別為0.92 ng/L和1.06 ng/L,加標(biāo)回收率分別為98.7%～102.7%和97.2%～105.0%。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確,可滿足枇杷膏中齊墩果酸和熊果酸高靈敏度檢測的需求。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;同位素質(zhì)譜探針標(biāo)記技術(shù);化學(xué)衍生;齊墩果酸;熊果酸

齊墩果酸(OA)和熊果酸(UA)是兩種典型的五環(huán)三萜類化合物,具有較低的細(xì)胞毒性和廣泛的生物活性,可用于殺蟲、消炎、防流感、抗糖尿等[1-4]。熊果酸現(xiàn)已被證明能夠阻斷艾滋病蛋白酶的聚合,同時(shí)對其他惡性腫瘤細(xì)胞亦表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用;齊墩果酸可減輕肝損傷,對急性、慢性肝炎及肝硬化動(dòng)物均有明顯的降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶和退黃的效果,是治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想藥物,具有毒性低,不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。

針對齊墩果酸和熊果酸的檢測,文獻(xiàn)報(bào)道的方法多為薄層掃描法[5,6]、高效液相色譜法[7-15]、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法[16,17]和液相色譜-質(zhì)譜法[18,19]等。薄層掃描法對薄層條件的要求較苛刻,一般測得的結(jié)果多為齊墩果酸和熊果酸含量的總和;采用高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)法時(shí),OA和UA的化學(xué)結(jié)構(gòu)(見圖1)使其紫外吸收較弱、基線波動(dòng)大、靈敏度低;采用質(zhì)譜分析時(shí),含有的羧基(-COOH)在負(fù)離子模式下離子化效率低;即使采用高靈敏度的三重四極桿質(zhì)譜,也因?yàn)镺A和UA的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,而在串聯(lián)質(zhì)譜中的碎裂行為不理想,無法使用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行分析。因此,檢測復(fù)雜中藥中的齊墩果酸和熊果酸時(shí),需要多步富集、提純等步驟,操作繁瑣、耗時(shí)。

圖1 (a)齊墩果酸和(b)熊果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of (a) oleanolic acid (OA) and (b) ursolic acid (UA)

本課題組在前期的研究中設(shè)計(jì)并合成了衍生化試劑N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N,N-二甲基乙二胺(d4-DMED),并將其用于酸性植物激素的檢測中,結(jié)果表明,該試劑可顯著提高羧酸類化合物的質(zhì)譜檢測靈敏度[20,21]。本文將該衍生化試劑應(yīng)用于齊墩果酸和熊果酸的檢測,無需獲得每種標(biāo)準(zhǔn)品的同位素內(nèi)標(biāo),而是通過衍生向目標(biāo)分子中引入穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)物,建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測枇杷膏中齊墩果酸和熊果酸的分析方法。該方法簡單、快速,靈敏度高、可通過失去衍生化的基團(tuán)得到其穩(wěn)定的產(chǎn)物離子,對中藥中齊墩果酸與熊果酸的分離、分析具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A液相色譜儀和LC-MS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司),配有LC-20AD輸液泵、DGU-20A3R在線脫氣機(jī)、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器和LabSolutions Ver. 5.60 SP2色譜工作站;DN-12氮吹儀(天津東康科技有限公司); Vortex 5渦旋振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)。

OA和UA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、乙酸乙酯(色譜純)購自德國Merck公司;甲酸(色譜純)購自德國CNW科技公司;2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)購自阿拉丁公司;N,N-二甲基乙二胺(DMED)購自美國Sigma公司;三乙胺(TEA)、氯化鈉購自上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q制備(美國Millipore公司)。

1.2 樣品前處理

取0.5 g枇杷膏于50 mL容量瓶中,用飽和食鹽水稀釋至刻度,取1 mL加入200 μL乙酸乙酯,渦旋5 min后,靜置,取上清液進(jìn)行衍生。加入10 μL 20 mmol/L TEA和10 μL 20 mmol/L CMPI,渦旋5 min,再加入10 μL 40 mmol/L DMED,于40 ℃以1 500 r/min振蕩1 h后,用氮?dú)獯蹈?加入100 μL流動(dòng)相復(fù)溶。

稱取適量齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;分別取200 μL各質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行衍生。衍生步驟同上。

用d4-DMED(其合成見參考文獻(xiàn)[20])代替DMED對10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行衍生,衍生步驟同上。取10 μL復(fù)溶后的溶液加至各質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和實(shí)際樣品中,混勻,上樣。

1.3 儀器分析條件

色譜柱:InertSustain C18色譜柱(250 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(47∶53, v/v);等度洗脫;流速:0.25 mL/min。

正離子監(jiān)測模式;霧化氣流速:2.0 L/min;加熱氣流速:10.0 L/min;接口溫度:300 ℃;脫溶劑管(DL)溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;干燥氣流速:10.0 L/min;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。由于OA和UA為同分異構(gòu)體,其母離子和產(chǎn)物離子完全一致,可通過保留時(shí)間差異對二者進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜裂解行為

齊墩果酸和熊果酸與DMED或d4-DMED的衍生反應(yīng)見圖2。經(jīng)衍生反應(yīng)后,齊墩果酸和熊果酸的羧基與衍生化試劑間形成酰胺鍵,同時(shí)引入叔胺基團(tuán),提高質(zhì)譜響應(yīng)信號。在串聯(lián)質(zhì)譜分析中,通常使用MRM來實(shí)現(xiàn)對化合物的準(zhǔn)確定量,以有效排除單四極桿質(zhì)譜出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象。因此,以齊墩果酸為分析物,考察了其衍生前后在串聯(lián)質(zhì)譜中的碎裂行為(見圖3)。衍生前,齊墩果酸幾乎無子離子產(chǎn)生(見圖3b);而衍生后,齊墩果酸的斷裂行為得到明顯改善,可獲得質(zhì)譜響應(yīng)信號較大的子離子(m/z482.30)(見圖3d),有利于MRM檢測。齊墩果酸和熊果酸衍生產(chǎn)物的母離子及相應(yīng)子離子信息見表1。

表1 OA和UA衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間(tR)和其他質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times (tR) and other MS parameters of OA and UA derivatives

DMED:N,N-dimethylethylenediamine; Q1 pre bias: Q1 prerod bias; Q3 pre bias: Q3 prerod bias. * Quantitative ion.

圖2 OA和UA與(a)DMED和(b)d4-DMED的衍生化反應(yīng)Fig. 2 Derivatization of OA and UA with (a) DMED and (b) d4-DMED TEA: triethylamine.

圖3 OA衍生前(a)全掃描與(b)產(chǎn)物離子掃描和衍生后(c)全掃描與(d)產(chǎn)物離子掃描的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of OA for (a) full scan and (b) product ion scan before derivatization and (c) full scan and (d) product ion scan after derivatization

2.2 衍生條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了DMED、TEA的用量及反應(yīng)時(shí)間對衍生效率的影響。首先以衍生化試劑DMED的用量為變量，考察DMED與待測物(OA+UA)的物質(zhì)的量的比(20～10 000)對衍生化產(chǎn)物峰面積的影響。結(jié)果表明,隨著DMED用量的增加,衍生化產(chǎn)物的峰面積逐漸增加；當(dāng)物質(zhì)的量的比達(dá)到200時(shí),此時(shí)DMED的濃度為40 mmol/L，衍生化產(chǎn)物的峰面積不再增加。在實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的衍生實(shí)驗(yàn)中,DMED與待測物的物質(zhì)的量的比遠(yuǎn)超過200,保證了衍生化反應(yīng)的完全。

衍生化反應(yīng)中,由TEA提供堿性環(huán)境,將TEA的體積設(shè)為10 μL,當(dāng)其濃度從1 mmol/L增至20 mmol/L時(shí),衍生化產(chǎn)物的峰面積基本保持不變。將反應(yīng)溫度設(shè)為40 ℃,反應(yīng)時(shí)間從10 min逐漸增至60 min,衍生化產(chǎn)物的峰面積略有增加,約上升10%。因此,本實(shí)驗(yàn)最終將DMED與TEA的濃度分別設(shè)為40 mmol/L和20 mmol/L,反應(yīng)時(shí)間設(shè)為60 min。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

研究表明，當(dāng)反應(yīng)體系中水的含量增加時(shí),衍生化反應(yīng)的效率降低。因此,在樣品前處理過程中采用飽和食鹽水稀釋枇杷膏樣品,再用乙酸乙酯將目標(biāo)物從水相萃取至有機(jī)相,然后進(jìn)行衍生。由于方法靈敏度較高,實(shí)際實(shí)驗(yàn)中只需用到10 mg枇杷膏。

分別在實(shí)際樣品處理前、后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,比較二者質(zhì)譜信號的強(qiáng)度變化。結(jié)果表明,處理前、后信號強(qiáng)度的比值大于0.95。由此可知,前處理時(shí),分析物基本沒有損失。因此可在進(jìn)樣前將內(nèi)標(biāo)衍生物與實(shí)際樣品的衍生溶液混合,內(nèi)標(biāo)僅需校正質(zhì)譜受樣品中的基質(zhì)效應(yīng)帶來的誤差。

2.4 分離條件的選擇

OA和UA的結(jié)構(gòu)區(qū)別在于OA的C-20位上的甲基移位到C-19位上,從而形成了UA,二者屬于同分異構(gòu)體,其前體離子與產(chǎn)物離子均一致。因此可否準(zhǔn)確分離OA和UA至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)對比了采用Shim-pack VP-ODS(150 mm×2.0 mm,5 μm)、Shim-pack XR-ODS(75 mm×3.0 mm,2.2 μm)和InertSustain C18色譜柱(250 mm×2.1 mm,3 μm)時(shí)的分離效果,根據(jù)其分離度,最終確定采用InertSustain C18色譜柱。0.1 μg/L的OA和UA經(jīng)DMED衍生后的MRM色譜圖見圖4。

圖4 OA和UA經(jīng)DMED衍生后的MRM色譜圖(0.1 μg/L)Fig. 4 MRM chromatogram of OA and UA derivatized with DMED (0.1 μg/L)

2.5 方法學(xué)考察

取齊墩果酸和熊果酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.2及1.3節(jié)中的衍生條件及分析條件進(jìn)行處理,OA和UA衍生物與其d4-DMED衍生物的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X)制作校準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)(r2)均>0.99。齊墩果酸和熊果酸的校準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)見表2。

表2 OA和UA衍生物的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限Table 2 Calibration curves, correlation coefficients (r2),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of OA and UA derivatives

Y: peak area ratio of DMED derivative to d4-DMED derivative;X: concentration ratio of DMED derivative to d4-DMED derivative; linear range: 0.01-10.0 μg/L.

按1.2節(jié)所述,配制質(zhì)量濃度為0.5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(n=6),將其衍生后檢測,OA和UA衍生物與其d4-DMED衍生物的面積比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.01%～5.84%。按樣品前處理方法測定加標(biāo)含量為100 μg/kg的枇杷膏和空白枇杷膏中OA和UA的含量(n=5)。齊墩果酸和熊果酸的加標(biāo)回收率(扣除空白枇杷膏中OA和UA的含量)分別為98.7%～102.7%和97.2%～105.0%。說明該方法精密度和回收率均符合檢測要求。

2.6 實(shí)際樣品測定

按1.2節(jié)方法對某品牌的枇杷膏樣品進(jìn)行處理后測定(n=5)。結(jié)果表明,某品牌枇杷膏樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量分別為35.8 μg/kg和115.2 μg/kg,其色譜圖見圖5。

圖5 枇杷膏樣品中(a)OA、UA和(b)同位素內(nèi)標(biāo)衍生物的MRM色譜圖Fig. 5 MRM chromatograms of (a) OA, UA and(b) isotope internal standard derivatives in a loquat leaf extract sample

3 結(jié)論

本文采用同位素質(zhì)譜探針標(biāo)記技術(shù),建立了化學(xué)衍生輔助高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)測定枇杷膏中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確,可滿足枇杷膏中齊墩果酸和熊果酸高靈敏度檢測的需求。

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Determination of oleanolic acid and ursolic acid in loquatleaf extract by chemical derivatization coupled withliquid chromatography-tandem mass spectrometry

LUO Dan1,2, FENG Yuqi1*, YAO Jinting2, SUN Youbao2, HUANG Taohong2, HASHI Yuki2
(1.KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforBiologyandMedicine(MinistryofEducation),CollegeofChemistryandMolecularScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China; 2.Shimadzu(China)Co.,Ltd.,Shanghai200052,China)

A method for the determination of oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. By using derivatization reagents,N,N-dimethylethylenediamine (DMED) and d4-N,N-dimethylethylenediamine (d4-DMED), OA and UA in real samples and standard samples were derivatized separately. The derivative products of the standard samples were used as stable isotope internal standards, and accurately added to the samples and standard working solutions. Good linearities were obtained in the concentration range of 0.01-10 μg/L with correlation coefficients (r2) greater than 0.99. The limits of detection of OA and UA were 0.92 ng/L and 1.06 ng/L, and the recoveries were between 98.7%-102.7% and 97.2%-105.0%, respectively. The method can be used for the detection of OA and UA in loquat leaf extract with high sensitivity.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); isotope mass spectrometer probe technology; chemical derivatization; oleanolic acid (OA); ursolic acid (UA)

10.3724/SP.J.1123.2016.08015

2016-08-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21475098).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21475098).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0027-05

*通訊聯(lián)系人.Tel:(027)68755595,E-mail:yqfeng@whu.edu.cn.