袁愛夢，蔡珺珂，李彤，李穎，蔡義林，齊斌，朱穎越

(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟,215500)

金納米基比色傳感器法測定動物源食品中卡那霉素殘留

袁愛夢，蔡珺珂，李彤，李穎，蔡義林，齊斌，朱穎越*

(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟,215500)

基于一定鹽濃度下，金納米粒子的聚集程度受附著于其表面的核酸濃度影響，以及卡那霉素(Kanamycin)能引起核酸適配體特定核酸構(gòu)象變化而使其脫離金納米粒子表面的特點，進(jìn)而引起金納米粒子顏色變化的結(jié)果，設(shè)計了一種新型檢測動物源食品中卡那霉素的生物傳感器。結(jié)果表明：此新型傳感器對卡那霉素具有較高的靈敏度，且操作簡單快速，易于普及和適于現(xiàn)場監(jiān)控等。當(dāng)卡那霉素濃度在50～200 nmol/L時，體系的吸光度A650/A519隨卡那霉素濃度的變化而呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性常數(shù)為0.999，檢測限為30 nmol/L，且在實際樣品檢測中，測出其回收率為98.27%～104.31%。

卡那霉素；核酸適配體；金納米顆粒；比色法

隨著人們生活質(zhì)量的提高，對食品安全和營養(yǎng)的要求也越來越嚴(yán)格，且由于抗生素[1]在動物性食品中的大量使用，其濫用殘留問題也引起了廣泛關(guān)注，成為研究熱點?？敲顾鼐褪瞧渲兄唬鼘侔被擒疹?，是一種廣譜抗生素，抗菌效果顯著[4]，但易誘發(fā)耳毒癥，導(dǎo)致眩暈和聽力減退，損害腎臟，造成腎功能衰竭，更甚者能透過胎盤屏障，對胎兒產(chǎn)生毒害作用[2-3]。

目前，卡那霉素的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法、分光光度法、電化學(xué)法等[5-8]。上述方法雖然準(zhǔn)確度高，但耗時長，操作復(fù)雜，不適用于現(xiàn)場檢測，且由于人們對抗生素殘留的高度關(guān)注和對食品中卡那霉素實時、快速準(zhǔn)確檢測的要求，亟需開發(fā)一種新型的檢測方法。

核酸適配體是通過指數(shù)富集技術(shù)得到的對靶目標(biāo)有特異性親和力的短鏈DNA序列，可以選擇性地綁定到具有高親和力的目標(biāo)物如小分子、蛋白質(zhì)和藥物等。金納米粒子具有獨特的光學(xué)特性和較好的生物相容性，其溶液為酒紅色，當(dāng)在其中加入適當(dāng)?shù)柠}溶液，會誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，使溶液變?yōu)樗{(lán)色?；诠δ蹹NA原理，結(jié)合納米材料開發(fā)生物傳感器是研究的一個熱點。

特異性識別卡那霉素的核酸在卡那霉素存在下其DNA構(gòu)型形成復(fù)雜的半環(huán)狀結(jié)構(gòu)而不能吸附在金納米表面。單鏈DNA附著在納米金顆粒表面對其有保護(hù)作用，而卡那霉素可以和核酸適配體結(jié)合，使金納米顆粒脫離核酸的保護(hù)，在一定鹽濃度下發(fā)生聚集，由于表面等離子共振(SPR)作用導(dǎo)致不同波長處的紫外吸收峰強(qiáng)度減弱或增強(qiáng)以及相應(yīng)的顏色變化。本實驗研究結(jié)合以上原理構(gòu)建一種新型生物傳感器，用于快速靈敏地檢測食品中卡那霉素的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氯金酸(HAuCl4)為分析級，購自于美國Sigma公司；檸檬酸三鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉(NaCl)均為分析純，購買于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；卡那霉素購自于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈(HPLC 純，Promptar 公司)；實驗用水是超純水(>18 MΩ)。

DNA：5’-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’，上海生工公司。

UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；漩渦振蕩器，美國Scientific Industries公司；XS105DU 型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Thermo Aquasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國熱電公司)；密理博超純水儀，北京普析通用公司。

1.2 金納米粒子溶液的制備

實驗用的金納米粒子參照FRENS的檸檬酸三鈉還原法合成[9]。具體方法如下：將新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01%的HAuCl4溶液100 mL加到錐形瓶中，置于恒溫電磁攪拌器上加熱至沸騰后持續(xù)2 min，然后迅速加入2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌加熱，溶液的顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變到酒紅色，此時金納米粒子生成，繼續(xù)加熱幾分鐘后停止，室溫攪拌使其冷卻，裝于棕色試劑瓶，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基于金納米粒子檢測卡那霉素的比色傳感方法

配制特定鹽濃度的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，10 nmol/L NaCl，pH 7.4)，取緩沖液500 μL 加入2 mL離心管中，然后加入DNA溶液(使終濃度為10 nmol/L)，加入不同濃度的卡那霉素溶液，用振蕩混合器混合，靜置反應(yīng)15 min左右，加入1 mL制備的金納米離子溶液，混合反應(yīng)5 min，用分光光度計掃描所得溶液，記錄其A650與A519處的吸光值。利用加入卡那霉素前后吸光度的變化，實現(xiàn)對卡那霉素的快速檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

實驗建立方法的傳感原則是由于具有負(fù)電性磷酸骨架的特定設(shè)置的ssDNA，不僅能與卡那霉素反應(yīng)形成變構(gòu)效應(yīng)，還可以通過靜電吸引結(jié)合在金納米的表面，增加金納米顆粒之間的分散性，更重要的是，卡那霉素與其配子形成的綁定結(jié)合力大于ssDNA與金納米表面的電荷吸附效應(yīng)。

圖1 金納米基比色檢測卡那霉素原理圖Fig.1 Scheme of AuNPs-based detection of kanamycin

因此，如圖1所示，當(dāng)溶液中NaCl與ssDNA量恰好能維持金納米體系的平衡時，體系的吸光度保持不變。然而，在卡那霉素存在時，ssDNA能特異性與卡那霉素結(jié)合并轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA，發(fā)夾DNA不能吸附在金納米表面，溶液中的NaCl此時能引起金納米顆粒發(fā)生聚集。由于ssDNA和卡那霉素之間較強(qiáng)的選擇性結(jié)合力，吸光度隨著卡那霉素的濃度而改變，溶液的顏色從酒紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色。綜上所述，一種比色定量定性檢測卡那霉素的傳感方法被建立。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

鑒于核酸適配體的量和NaCl會直接影響到檢測的結(jié)果，因而要確定核酸適配體和NaCl的最佳用量。將一系列不同濃度的核酸適配體加入金納米體系中， 當(dāng)整個反應(yīng)體系中卡那霉素適配體的濃度很低時，幾乎不吸附在金納米粒子表面，在特定鹽濃度下，納米金體系發(fā)生集聚，A650/A519值較大，當(dāng)核酸適配體濃度逐漸增大，除與卡那霉素作用消耗部分用量外，也能吸附在納米金表面，進(jìn)而增大它的分散度，因此，A650/A519值呈現(xiàn)下降趨勢。實驗可知，當(dāng)DNA濃度控制在10 nmol/L時，納米金體系集聚度較小，因此，選擇10 nmol/L作為后續(xù)實驗的最佳用量。同理對NaCl的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)NaCl的濃度為10 nmol/L時，金納米體系聚集程度最明顯，故將10 nmol/L作為NaCl的最佳濃度。

2.3 基于金納米粒子的比色傳感器檢測卡那霉素

在最優(yōu)條件下，用所構(gòu)建的比色生物傳感器檢測不同濃度梯度的卡那霉素。由于卡那霉素濃度增加，納米金表面的DNA被卡那霉素競爭性剝落，使其在10 nmol/L鹽濃度下分散度降低，故體系的吸光光譜隨卡那霉素濃度的增加而變化，最大吸收峰由519 nm紅移到650 nm，如圖2所示，同時溶液的顏色由紫紅色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色。如圖3所示，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，體系吸光度比值y(A650/A519)與卡那霉素濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性方程為y=0.006x+0.084 6，相關(guān)系數(shù)為0.999，其中x為卡那霉素濃度(nmol/L)，線性范圍為50～200 nmol/L，最低檢測限可達(dá)30 nmol/L(三倍信噪比)。綜上，通過實驗分析表明，所構(gòu)建方法在一定范圍內(nèi)具有很好的靈敏度。

圖2 金納米基體系隨卡那霉素濃度變化的吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of the AuNPs-based system with different kanamycin concentration

圖3 卡那霉素濃度和A650/A519的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve represented the relationship between kanamycin concentration and A650/A519

2.4 金納米基檢測卡那霉素的比色傳感器方法的特異性分析

特異性是評價傳感器性能的重要部分，只有對特定目標(biāo)分析物作用的方法才具有實際應(yīng)用前景。因此，用所構(gòu)建方法檢測一系列不同抗生素，如氨芐青霉素、四環(huán)素、新鏈絲菌素、慶大霉素、硫酸鏈霉素等。如圖4所示，通過比較分析，當(dāng)以其他抗生素代替卡那霉素時，整個體系的顏色幾乎沒有變化，吸光值比值變化不大，表明只有卡那霉素能夠引起特異性反應(yīng)，如此可用于食品中卡那霉素的快速檢測。

圖4 特異性分析Fig.4 Analysis of specificity

2.5 實際樣品檢測

為驗證所建立方法的實際應(yīng)用能力，采用加標(biāo)回收實驗。取均質(zhì)后的豬肉樣品至離心管中，用乙腈提取，經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，將處理后豬肉試樣加入不同濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用本實驗方法檢測其中卡那霉素濃度。實驗結(jié)果表明：卡那霉素的回收率在98.27%～104.31%，故所建立方法具有很好的實際應(yīng)用能力。

表1 動物性食品中卡那霉素回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

基于金納米體系吸光度變化而建立的比色傳感技術(shù)構(gòu)建的生物檢測器應(yīng)用于卡那霉素的檢測，檢測限可達(dá)30 nmol/L，并確定了卡那霉素的傳感線性范圍。相比于傳統(tǒng)的抗生素檢測方法，本實驗方法操作簡單快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)，實際樣品分析檢測表明其具有一定的實用性，易于現(xiàn)場檢測，這必然會促進(jìn)抗生素的實時快速檢測。

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Kanamycin detecting in animal foods by a gold nanoparticle colorimetric biosensor

YUAN Ai-meng1, CAI Jun-ke1, LI Tong1, LI Ying1,CAI Yi-lin1,QI Bin1, ZHU Ying-yue1*

1 (School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Under the certain concentration of NaCl, aggregation of gold nanoparticles is affected by the nucleic acid attaching to its surface. Because of nucleic acid’s conformational change by kanamycin, gold nanoparticles color can be changed. Based on this theory, a new type of biosensor has been developed to detect kanamycin in food from animal origin. The results reveal that this new sensor has high sensitivity, and operates quickly and easily. Furthermore, it is easy to use and suitable for on-site monitoring. When the concentration of kanamycin is in the range of 50-200 nmol/L, the absorption spectrum showed a linear relationship with the change of the kanamycin’s concentration, and the linear coefficient was 0.999. Meanwhile, the optimized method shows a good detection limit (LOD of 30 nmol/L), and good recoveries (98.27%-104.31%).

kanamycin； DNA； gold nanoparticle； colorimetric method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612031

本科生(朱穎越副教授為通訊作者,E-mail：yyzhujnu@163.com)。

江蘇省基礎(chǔ)研究計劃(自然科學(xué)基金)項目(BK20130379，BK20140416)；江蘇省“六大人才高峰”第十二批高層次人才選拔培養(yǎng)(NY-021)和蘇州市科技計劃項目(SYN201515)；2016年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目資助(2016103330152)

2016-04-18，改回日期：2016-05-30