劉鵬揚，劉軍義，羅佳

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(廣西出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，廣西 南寧，530021)

植物乳桿菌在荸薺汁中的培養(yǎng)特性及其應用研究

劉鵬揚1，劉軍義2*，羅佳2

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(廣西出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，廣西 南寧，530021)

研究植物乳桿菌在荸薺汁中的培養(yǎng)特性并尋找一種利用荸薺淀粉廢水生產乳酸菌劑的低碳環(huán)保工藝。將植物乳桿菌分別接種于可溶性固形物含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%的荸薺汁中進行培養(yǎng)；接種到用NaOH溶液調pH至7.0，添加2.0%的葡萄糖的培養(yǎng)液中再培養(yǎng)；接種到121 ℃，15 min熱處理后的荸薺汁中進行培養(yǎng)；接種荸薺汁分別置30、15、4 ℃下培養(yǎng)，觀察乳酸菌的培養(yǎng)特性；最后接種到荸薺淀粉廢水進行培養(yǎng)。結果表明：植物乳桿菌密度在可溶性固形物含量為3.0%以下的荸薺汁中呈線性比例增加，用堿中和后可增加90%的菌密度，但加糖無效果；不經熱處理的荸薺汁培養(yǎng)植物乳桿菌效果更好，植物乳桿菌在低溫下亦生長良好；荸薺淀粉廢水直接培養(yǎng)植物乳桿菌可得到菌含量為109CFU/mL的高濃度乳酸菌劑，荸薺淀粉廢水可直接被用于生產乳酸菌劑。

植物乳桿菌；荸薺汁；培養(yǎng)；荸薺淀粉廢水

乳酸菌是一種益生菌，通常是指發(fā)酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產生乳酸菌的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌，這是一群相當龐雜的細菌，目前至少可分為23個屬，共有200多種。乳酸菌的應用非常廣泛，除了用于食品發(fā)酵外，近年來還被廣為用作微生態(tài)制劑的主要菌種，用于制作飼料添加劑、水質改良劑等乳酸菌劑，在健康養(yǎng)殖產業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，最適生長溫度為30～35 ℃,厭氧或兼性厭氧,菌種為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適pH 6. 5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[2]。植物乳桿菌與人類的生活關系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能定植于腸道發(fā)揮有益作用。

植物乳桿菌劑的生產目前大多是以乳酸菌培養(yǎng)基或以此為基礎改良的合成培養(yǎng)基來生產[3-4]，原料及加工成本比較高，采用天然生物質原料(特別是廢棄農副產品)是一個非常有價值的途徑。中國是荸薺之鄉(xiāng)，荸薺深加工的一個重要途徑是生產荸薺淀粉，荸薺淀粉加工后排放的汁水量很大，如能加以利用，經濟效益、社會效益都將十分巨大。本文以模擬加工條件下的荸薺汁為原料，研究了一種乳酸菌-植物乳桿菌在其中的培養(yǎng)特性，并研究了荸薺淀粉汁水的低碳利用工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本試驗采用2株不同來源的植物乳桿菌作為研究對象，1株為本實驗室分離保存，標記為L199，另1株購自美國杜邦公司，型號為Lactobacillusplantarum115，標記為Lp115，其分離培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基[5]。將上述菌種活化，接種至MRS液體培養(yǎng)基， 36 ℃培養(yǎng)24 h，獲得菌種培養(yǎng)母液。將培養(yǎng)母液經兩次擴大培養(yǎng)后獲得生產用培養(yǎng)液備用。

1.1.2 荸薺汁

模擬荸薺淀粉加工過程，參照周愛梅等人的方法[5]，制備荸薺汁，方法如下：

荸薺→挑選→清洗→沸水燙漂3 min→按1∶1質量比加dH2O均質→紗濾→離心(3 000 g, 10 min)→取上清→測可溶性固形物。

可溶性固形物用手持式折光計直接讀數(shù)測定，上述方法制得的荸薺汁，其可溶性固形物為5.0%。再取一部分該荸薺汁，加入一定量的純凈水，分別制得可溶性固形物為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的荸薺汁。

1.1.3 現(xiàn)場加工荸薺汁

荸薺淀粉加工工藝如下：

荸薺→清洗→均質→漿渣分離(2次)→流槽沉淀→得濕淀粉，上清排放。

排放的上清即為現(xiàn)場加工荸薺汁，根據原料來源不同和加工過程的控制不同，其可溶性固形物的范圍在1.0%～2.0%。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)試驗

按10%的量，將上述2個菌種生產用培養(yǎng)液分別接種至可溶性固形物含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和5.0%的荸薺汁中，分別編號為L199-1#、-2#、-3#、-4#、-5#，Lp115-1’#、-2’#、-3’#、-4’#、-5’#，于36℃培養(yǎng)24 h，隨即進行乳酸菌檢驗，乳酸菌含量按GB 4789.35—2010[6]方法進行計數(shù)及鑒定。

1.2.2 植物乳桿菌在加入堿溶液、加糖分處理的荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)試驗

將上述2個菌種生產用培養(yǎng)液接種于可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁(基于1.0%的荸薺汁已能較好的培養(yǎng)出較高活力乳酸菌，與使用2.0%、3.0%和5.0%的荸薺汁相比更低碳、環(huán)保)，于36 ℃培養(yǎng)24 h后，分別加入堿溶液、加糖分作為不同處理組。加堿溶液處理的方法為：用1 mol/L NaOH調pH至7.0，置36 ℃再培養(yǎng)24 h；加糖分處理方法：直接添加2.0%的葡萄糖(無需調節(jié)pH值)，置36 ℃再培養(yǎng)24 h。同時設置無任何處理的對照組，分別編號為L199-6#、-7#、-8#和Lp115-6’#、-7’#、-8’#。以上樣品試驗前后均按GB/T 5009.8—2008方法[7]進行總糖含量測定。

1.2.3 植物乳桿菌在熱處理的荸薺汁中的培養(yǎng)試驗

可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁，121 ℃，15 min處理，然后接種上述2個菌種生產用培養(yǎng)液，于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時分別設置不處理組作為對照(L199-9#和Lp115-9’#)。培養(yǎng)后，按照GB 4789.35—2010[6]方法進行乳酸菌計數(shù)及鑒定。

1.2.4 植物乳桿菌在不同溫度下的培養(yǎng)試驗

接L199菌種培養(yǎng)液按10%的量接種于可溶性固形物含量為2.0%的荸薺汁中，分別置30、15、4 ℃下進行培養(yǎng)，分別編號為L199-9#、-10#、-11#和Lp115-9’#、-10’#、-11’#，分別測定各組pH值，待pH值降至4.0以下時，測定各組乳酸菌含量。

1.2.5 現(xiàn)場加工荸薺汁培養(yǎng)植物乳桿菌的應用試驗

本文中所述現(xiàn)場加工荸薺汁目前被當作加工廢水排放，將該荸薺汁應用于植物乳桿菌高效培養(yǎng)，設計低碳工藝流程如下：選取植物乳桿菌L199為例，取培養(yǎng)液1 000 mL→接種到9 000 mL廢水→自然環(huán)境條件下密封培養(yǎng)24 h→接種到90 L廢水→自然環(huán)境條件下密封培養(yǎng)24 h→對乳酸菌進行檢驗及鑒定。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)結果

將2種不同來源的植物乳桿菌L199和Lp115接種于不同可溶性固形物含量的荸薺汁中，36 ℃培養(yǎng)24 h后，按照GB 4789.35—2010中乳酸菌的檢驗及鑒定方法對荸薺汁中的乳酸菌進行了計數(shù)和鏡檢鑒定，各組在選擇性MRS培養(yǎng)基上的計數(shù)結果如表1所示，經鏡檢觀察，各組均只觀察到短桿狀、無芽胞、革蘭氏陽性菌，未見其他形態(tài)乳酸菌，根據GB 4789.35—2010的判定依據鑒定為植物乳桿菌。

表1 植物乳桿菌L199和Lp115在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)結果

從表1中可以看出，當可溶性固形物濃度在3.0%以下時，隨著荸薺汁可溶性固形物濃度的增加，接種L199和Lp115培養(yǎng)液培養(yǎng)后的乳酸菌含量也呈一定比例增加，其中，接種L199培養(yǎng)液的試驗組表現(xiàn)出良好的線性關系，經計算得出其相關系數(shù)R2=0.996。但當可溶性固形物濃度超過3.0%時，2種乳酸菌含量均趨于穩(wěn)定，乳酸菌計數(shù)量分別為3.0×109CFU/mL和2.0×109CFU/mL。

2.2 植物乳桿菌在加堿溶液、加糖分處理后的荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)結果

試驗原始樣品為可溶性固形物為1.0%的荸薺汁接種L199和Lp115培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)物，經加堿溶液調pH至中性和加糖分后，再培養(yǎng)24 h，其結果如表2所示。

表2 L199在加堿、加糖處理后荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)結果

從表中可以看出，當未接種植物乳桿菌時，可溶性固形物為1.0%的荸薺汁中的總糖為0.79 g/100 g，經24 h培養(yǎng)后，分別迅速降為0.08 g/100 g和0.12 g/100 g，培養(yǎng)48 h后，總糖含量分別為0.05 g/100 g和0.07 g/100 g，乳酸菌計數(shù)分別為4.9×108CFU/mL和4.4×108CFU/mL；在作不同處理前，24 h培養(yǎng)液的總糖含量分別為0.08 g/100 g和0.12 g/100 g，而當用NaOH將24 h培養(yǎng)液pH值調整至7.0后再培養(yǎng)時，乳酸菌的計數(shù)達到了9.3×108CFU/mL和8.7×108CFU/mL，同比分別增加了90%和100%。而添加葡萄糖處理后，雖然其總糖含量分別增加到2.10 g/100 g和2.47 g/100 g，培養(yǎng)液中的乳酸菌計數(shù)分別為5.0×108CUF/mL和4.7×108CFU/mL，與處理前含量相比，增長量并不大，處理效果與加堿溶液處理組相比差很多，因此，通過加堿溶液調節(jié)pH值的方法可大幅增加培養(yǎng)液中的乳酸菌含量。

2.3 植物乳桿菌在熱處理后荸薺汁中的培養(yǎng)結果

選取可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁，經121 ℃，15 min處理后，接種L199和Lp115植物乳桿菌，24 h培養(yǎng)后分別進行鏡檢，鏡檢結果為僅觀察到短桿狀的乳酸菌，即植物乳桿菌，乳酸菌計數(shù)結果為2.5×108CFU/mL和2.0×108CFU/mL，與未經熱處理的荸薺汁培養(yǎng)液相比(L199-9#和Lp115-9’#)，含量只有未經熱處理組的50%和48%。可見，荸薺汁不經熱處理，直接接種植物乳桿菌L199更為經濟、有效，這對實施低碳工藝非常有利。

2.4 植物乳桿菌在不同溫度下的培養(yǎng)結果

2種植物乳桿菌接種于可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁中，于30、15、4 ℃下培養(yǎng)后，結果如表3所示。表中乳酸菌的計數(shù)是在培養(yǎng)液pH值低于4.0時的當天測得。

表3 L199在不同溫度下的培養(yǎng)結果

從表3中可以看出，在30 ℃培養(yǎng)條件下，24 h內，兩植物乳桿菌荸薺汁培養(yǎng)液pH值就分別降到了4.0和4.4，乳酸菌計數(shù)達到4.7×108CFU/mL和4.3×108CFU/mL，當在15 ℃時，乳酸菌生長速度也比較快，48 h內pH值也分別降到了4.0和4.5，乳酸菌計數(shù)達到4.5×108CFU/mL和3.8×108CFU/mL。在4 ℃條件下，則6 d后培養(yǎng)成熟，乳酸菌計數(shù)可分別達3.4×108CFU/mL和3.1×108CFU/mL。荸薺收獲的季節(jié)在冬天，自然環(huán)境氣溫比較低，所以設計本試驗的目的在于考證所使用的菌種是否可以在低溫下生長，從而避免通常發(fā)酵培養(yǎng)所需要的保溫措施，同時減少發(fā)酵容器的周轉，達到節(jié)省能源和資源的雙重目的。結果表明，本菌可以在15 ℃下快速生長，在4 ℃低溫下也可持續(xù)生長，具有較好的實際應用價值。

2.5 L199在現(xiàn)場加工荸薺汁中的應用結果

2013年1月19日和2013年2月1日先后到廣西平樂某公司進行現(xiàn)場試驗，當時氣溫分別為19 ℃和17 ℃，現(xiàn)場加工荸薺汁(荸薺廢水)的可溶性固形物分別為1%和2%，經試驗培養(yǎng)后，獲得兩批乳酸菌劑，乳酸菌的檢測結果分別為4.3×108CFU/mL和1.0×109CFU/mL?？梢娫囼炘O計的低碳工藝比較成功。

3 討論

本文研究了植物乳桿菌L199在荸薺汁中的培養(yǎng)特性，發(fā)現(xiàn)當荸薺汁的可溶性固形物濃度在3%以下時，L199的培養(yǎng)濃度與可溶性固形物濃度呈直線正比例關系；L199在較低溫度如15 ℃下也可快速繁殖，用未經熱處理的荸薺汁作為培養(yǎng)液更有利于植物乳桿菌的增殖，這可能與熱處理后某些活性物質與促生長因子的被破壞有關。然而，在實際應用中，用未經熱處理荸薺汁作為乳酸菌培養(yǎng)液較適用于飼料生產(無需滅菌)，而在食品領域則不宜采用，因此本文未進一步探討。利用這些特性設計了L199利用現(xiàn)場荸薺加工汁即荸薺淀粉廢水的低碳工藝，結果獲得了乳酸菌數(shù)分別為4.3×108CFU/mL和1.0×109CFU/mL的兩批乳酸菌劑。實踐證明，該工藝簡單實用，低碳環(huán)保，且所用原料低廉易得，應用前景廣闊。

乳酸菌的生長需要復雜的營養(yǎng)條件，荸薺汁在不需要添加任何外源因子的條件下就可培養(yǎng)出高活力的乳酸菌，說明荸薺汁的營養(yǎng)豐富又全面。但試驗發(fā)現(xiàn)當荸薺汁的可溶性固形物濃度超過3%時，菌的密度并不增加，這應當是由于酸抑制的結果，所以當培養(yǎng)24 h后，即使再添加2%的葡萄糖也沒有增加乳酸菌的密度。堿中和可以增加90%的菌量，但這不能理解為僅僅是解除了酸的限制作用，因為本試驗中，堿中和時，殘?zhí)橇糠浅５?，只?.08 g/100 g，所以堿的作用除了中和乳酸，解除生長抑制外，可能還有堿水解淀粉后釋放出纖維素、果膠等營養(yǎng)物質中釋放出的碳源、氮源的作用，該論點仍需要進一步試驗加以確證。

[1] CATALOLUK O, GOGEBAKAN B. Presence of drug resistance in intestinal lactobacilli of dairy and human origin in Turkey[J]. FEMS Microbio Lett,2004,236(1):7-12.

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[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.35—2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].北京:中國標準出版社, 2010.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部、中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.8—2008 食品中蔗糖的測定[S].北京:中國標準出版社, 2008.

Study on the cultivation of lactobacillus in water chestnut juice and its application

LIU Peng-yang1, LIU Jun-yi2*, LUO Jia2

1(College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) 2(Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureaue, Nanning 530021, China)

The cultivation of lactobacillus in water chestnut juice was studied and a low-carbon green process utilizing starch waste water of water chestnut was developed. Lactobacillus was inoculated in water chestnut juice with different solvable solid density of 0.5%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 5.0% separately to culture. Lactobacillus was then inoculated in the fermented juice adjusted to pH 7.0 with NaOH and added with 2.0% glucose to reculture. Then lactobacillus was inoculated in the hot-treated water chestnut juice pretreated at 121 ℃ for 15 min, then to check the cultivation character of lactobacillus was checked during culturing at 30,15,4 ℃separately. Finally, the starch waste water of water chestnut was used to culture lactobacillus. Results showed that the density of lactobacillus had a linear increase with the increased density of solvable solid of water chestnut. Alkali neutralization could lead to a 90% increase of the bacteria density, but no effect was observed with the addition of glucose. It is better to using non-hot treatment juice. The lactobacillus was able to grow well even at low temperature. A high density of lactobacillus with 109CFU/mL was yielded by utilizing starch waste water of water chestnut to culture directly. The starch waste water of water chestnut can be used to produce lactobacillus preparation directly.

Lactobacillusplantarum; water chestnut juice; culture; waste water

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612017

大學本科(劉軍義研究員為通訊作者，E-mail：ljy8463@163.com)。

廣西科技攻關計劃(桂科攻1598015-10)

2016-03-21，改回日期：2016-08-29