秦華珍 羅 君 翁銘鉆 李明芳 柳俊輝 龍小琴 謝 鵬 譚喜梅

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧，530001)

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5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠環(huán)核苷酸水平的影響

秦華珍 羅 君 翁銘鉆 李明芳 柳俊輝 龍小琴 謝 鵬 譚喜梅

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧，530001)

目的：研究大高良姜、高良姜、益智、草豆蔻、紅豆蔻5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠cAMP、cGMP含量的影響。方法：分空白組、模型組、附子理中丸陽性對照組、5味受試藥物高低劑量組，采用15%冰乙酸加4 ℃知母水煎液造胃潰瘍寒證模型。造模成功后給藥，采用ELISA法測定血漿、血小板、血管平滑肌、胃組織cAMP、cGMP含量，計算cAMP/cGMP比值。結(jié)果：與模型組比較，除血小板益智低劑量組外，其余9個受試組血漿、血小板、血管平滑肌、胃組織cAMP含量均升高(P<0.01或P<0.05)；除血小板益智低劑量組，胃組織草豆蔻、紅豆蔻、益智低劑量組外，其余受試組血漿、血小板、血管平滑肌、胃組織的cAMP/cGMP比值明顯增高(P<0.01或P<0.05)。各受試組cGMP含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：5味山姜屬中藥能顯著升高胃潰瘍寒證大鼠血漿、血小板、血管平滑肌、胃組織cAMP含量及cAMP/cGMP比值，這可能是5味山姜屬中藥溫?zé)崴幮院蜏匚干⒑饔玫目茖W(xué)內(nèi)涵。

山姜屬；中藥；胃潰瘍；寒證；環(huán)核苷酸

山姜屬(AlpiniaL.)植物是姜科植物的一個大屬，分布于亞洲熱帶地區(qū)，我國約有46種，主產(chǎn)于東南和西南部[1]。山姜屬中藥是廣西的大宗藥材，傳統(tǒng)中藥大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智均來自該屬，其中大高良姜、高良姜、益智、草豆蔻、紅豆蔻收載于《中華本草》[2]；紅豆蔻、草豆蔻、益智、高良姜同時被收入《中華人民共和國藥典》[3]。山姜屬中藥味辛性溫(熱)，主歸脾、胃經(jīng)，大多屬于溫里藥，常具有溫中散寒、暖胃止痛等功效，臨床上主治脾胃寒證[2]。為了了解5味山姜屬中藥的溫?zé)崴幮耘c溫胃散寒作用是否是通過對cAMP、cGMP的調(diào)節(jié)起作用，我們觀察了大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智對胃潰瘍寒證大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠，SPF級，雄性，體重(200±20)g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)。

1.2 藥材 大高良姜Alpiniagalangal(L.)Willd.、高良姜(A.officinarumHance)、草豆蔻(A.katsumadaiHayata)、紅豆蔻(A.galanga(L.)Willd)、益智(A.oxyphyllaMiq)均購自南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，產(chǎn)地皆為廣西，批號均為150601。知母產(chǎn)地廣西，批號150601。以上藥材均經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室田慧教授鑒定為2015版《中華人民共和國藥典》《中華本草》收載的相應(yīng)品種。

1.3 藥物與試劑 陽性藥物：附子理中丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號140102)。造模藥物：冰乙酸(成都市科龍化工試劑廠，批號20150201)。水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號2015072101)，多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司，批號20150401)，氯化鈉注射液(昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號20150401)，大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號H164)，大鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號H163)，一水合草酸銨(廣州和為化工有限公司，批號：T7280125)。

1.4 儀器 EPOCH BIOTEK全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，SAITEXIANGYI.PGL-16冷凍離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)公司)，HVE-50自動高壓滅菌器(日本Hirayama公司)。

1.5 動物分組 隨機(jī)取10只大鼠作為空白對照組，其余大鼠進(jìn)行胃潰瘍寒證造模。造模結(jié)束后按體重隨機(jī)分為12組，即模型組、陽性藥組、5味受試藥物高、低劑量組，每組10只。

1.6 藥物制備[4]1)造模藥知母水煎液的制備：取知母飲片加10倍量的蒸餾水浸泡2 h，而后煮沸30 min，傾出藥液。藥渣加8倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，傾出藥液。2次藥液合并，多層紗布過濾，于水浴上濃縮藥液，調(diào)整至0.5 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?)受試藥的制備：方法同知母水煎液，藥液于水浴上濃縮后調(diào)整至所需質(zhì)量濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 造模與給藥[5]給予大鼠分別灌服4 ℃冰知母水煎液(10 g/kg，生藥量0.5 g/mL，2 mL/100 g)和4 ℃冰乙酸溶液(15%冰乙酸溶液，1 mL/次)，各1次/d，連續(xù)4 d。末次造模后給藥，空白組和模型組灌服常溫水，陽性組灌服附子理中丸(2 mg/kg)水溶液，10個受試藥物組分別灌服相應(yīng)的藥物水提液，給藥體積均為1 mL/100 g，每隔12 h給藥1次，共給藥4次。

1.8 血漿、血小板、血管平滑肌、胃組織cAMP、cGMP含量的測定 末次給藥前禁食不禁水10 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠。

1)血漿提?。焊怪鲃用}取血，含肝素鈉采血管收集，靜置數(shù)小時后3 000 r/min離心10 min，分離血漿，保存。

2)血小板提?。貉劭綮o脈取血，靜置30 min后800 r/min離心10 min，取上清液，3 500 r/min繼續(xù)離心10 min，棄上清液，向試管中滴加1%草酸銨溶液，靜置5 min，使紅細(xì)胞溶解。再3 500 r/min離心10 min，棄上清液后加入生理鹽水使之成為混懸液[6]。

3)血管平滑肌提取：剪取100 mg主動脈剪碎放入試管中，往試管內(nèi)加入pH值為4.75的醋酸緩沖液(50 nmol/L)，勻漿器粉碎組織，倒入懸浮液中，混勻靜置5 min后3 500 r/min離心15 min，重復(fù)2次，合并上清液、濃縮[7]。

4)胃組織提?。浩矢谷∥?，沿胃大彎剖開，用生理鹽水洗凈內(nèi)部殘渣及血液，于玻璃勻漿器中，加入10%的緩沖液(PBS)，研磨制成10%的勻漿液，2 500 r/min離心15 min，取上清液保存。之后均采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。

2 實驗結(jié)果

2.1 對血漿cAMP、cGMP含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血漿cAMP含量顯著降低(P<0.01)，cAMP/cGMP比值顯著減小(P<0.01)，cGMP含量無明顯變化。與模型組比較，各給藥組血漿cAMP含量均升高，其中大高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；附子理中丸，大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智高劑量組，高良姜低劑量組血漿cAMP含量升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組血漿cAMP/cGMP比值均升高，其中大高良姜、草豆蔻、益智低劑量組大鼠血漿cAMP/cGMP比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智高劑量組，高良姜、紅豆蔻低劑量大鼠血漿cAMP/cGMP比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2 對血小板cAMP、cGMP含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血小板cAMP含量顯著降低(P<0.01)，cAMP/cGMP比值顯著減小(P<0.01)。與模型組比較，除了益智低劑量組外，其余各給藥組cAMP含量均升高，其中大高良姜低劑量組、益智高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻高劑量組，紅豆蔻低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，除了益智低劑量組外，其余各給藥組cAMP/cGMP比值均增大，其中大高良姜、草豆蔻低劑量組，益智高劑量組cAMP/cGMP比值增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜與草豆蔻高劑量組，高良姜與紅豆蔻高、低劑量組大鼠血小板cAMP/cGMP比值增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3 對血管平滑肌cAMP、cGMP含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血管平滑肌cAMP含量顯著降低(P<0.01)，cAMP/cGMP比值顯著減小(P<0.01)。與模型組比較，其余各給藥組大鼠血管平滑肌cAMP含量均顯著增加，cAMP/cGMP比值均顯著升高，二者差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.4 對胃組織cAMP、cGMP含量的影響 與空白組比較，模型大鼠胃組織cAMP含量顯著降低(P<0.01)，cAMP/cGMP比值顯著減小(P<0.01)。與模型組比較，大高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智低劑量組cAMP含量增加差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜、高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、益智高劑量組，高良姜低劑量組cAMP含量升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。大高良姜、益智高劑量組，大高良姜、高良姜低劑量組大鼠胃組織cAMP/cGMP比值增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高良姜、草豆蔻、紅豆蔻高劑量組大鼠胃組織cAMP/cGMP比值增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；草豆蔻、紅豆蔻、益智低劑量組大鼠胃組織cAMP/cGMP比值升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表1 5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠血漿cAMP、cGMP含量的影響

注:與空白組比較，△表示P<0.05，△△表示P<0.01；與模型組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。以下各表同。

表2 5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠血小板cAMP、cGMP含量的影響

表3 5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠血管平滑肌cAMP、cGMP含量的影響

表4 5味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠胃組織cAMP、cGMP含量的影響

4 討論

cAMP、cGMP統(tǒng)稱為環(huán)核苷酸，cAMP、cGMP通過蛋白激酶發(fā)揮遞質(zhì)樣或激素樣生理效應(yīng)：當(dāng)cAMP、cGMP濃度較高時，可刺激促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)而促進(jìn)類固醇激素的合成，因此cAMP、cGMP作為激素的第二信使對生命的某些環(huán)節(jié)具有重要調(diào)節(jié)作用[8-9]。有研究顯示：cAMP與cGMP的作用與中醫(yī)學(xué)的陰陽學(xué)說有相似之處，cAMP在人體內(nèi)主要參與調(diào)節(jié)肝糖原分解、脂肪水解等活動，故cAMP為陽、為熱；與之具有拮抗作用的第二信使cGMP則具有可使血鈣降低、鈣通道關(guān)閉等作用，故cGMP為陰、為寒[10]。cAMP與cGMP相互拮抗，相互制約，在拮抗制約中共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的正常效應(yīng)，維持生命的正常生理功能，故兩者必需維持一定的比例，若比例發(fā)生改變(偏高或降低)，就會引起機(jī)體功能失調(diào)而導(dǎo)致疾病[11-12]。

本研究顯示：與空白組相比，造模后各組cAMP顯著降低，cGMP無明顯變化，cAMP/cGMP比值降低。說明大鼠造成胃潰瘍寒證后，機(jī)體陽氣受損而減少，出現(xiàn)了寒證的特征。給予大高良姜等5味山姜屬中藥后，cAMP水平增加，cAMP/cGMP比值升高。說明5味山姜屬中藥可以改善寒證征象，使機(jī)體向正常轉(zhuǎn)變。之所以會取得這樣的藥效，結(jié)合中藥理論知識，與5味山姜屬中藥的藥性與功效有關(guān)，5味中藥藥性皆為溫?zé)?，都有溫中散寒的功效。由此我們可以推斷?味山姜屬中藥對胃潰瘍寒證大鼠的藥效可能是通過升高cAMP的含量及cAMP/cGMP的比值來發(fā)揮溫胃散寒作用的。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，2004:67.

[2]國家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005:590,592,596,599,603.

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(2016-10-17收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effect of Five Alpinia Roxb to Model Rats with Cold Stomach Syndrome in cAMP, cGMP, cAMP/cGMP Level

Qin Huazhen, Luo Jun, Weng Mingzuan, Li Mingfang, Liu Junhui, Long Xiaoqin,Xie Peng, Tan Ximei

(GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,CollegeofPharmacy,Nanning530001,China)

Objective:To study the effect of the five Alpinia Rox(Alpinia officinarum Hance, Alpinia galangal(L.)willed, Alpinia katsumadai Hayata, Alpinia galangal, Alpinia oxyphyllaMiq) on cyclie Adenosine monnphosphate (cAMP) levels, cyclie guanosine monophosphate (cGMP) levels, and ratio of cAMP/cGMP in stomach excessive cold syndrome rats. Methods:Rats were divided into blank control group, model group, 2 positive control group, and 10 warm-heat herb groups, with 10 rats in each group. Rats model of stomach excess-cold syndrome was established by intragastric infusion of the 15% glacial acetic acid and 4 ℃ Common Anemarrhena Rhizome decoction liquid. After establishing the model, blank group and model group were given water, warm-heat herb respectively. The contents of cAMP, cGMP of stomach tissue, serum, vascular smooth muscle platelet were detected by the method of enzyme-linked immunoassay. Meanwhile, the cAMP/cGMP ratio was calculated. Results: Compared with model group, the cAMP level of 10 subjects content in rat stomach tissue, serum,thrombocyte and vascular smooth muscle were higher (P<0.01,P<0.05); no obvious difference in cGMP content; except for low doses in Alpinia katsumadai, Galanga Galangal Seed and Alpinia oxyphylla, ratio of cAMP/cGMP in rest drug participants increased obviously (P<0.01,P<0.05). Conclusion: Five Alpinia Roxb may elevate levels of cAMP, cAMP/cGMP ratio in model rats with stomach excessive cold syndrome, which may reveal the fact that five Alpinia Roxb have the effect of warming stomach for dispelling cold.

Alpinia Roxb; Chinese medicine; Excessive cold syndrome; cAMP; cGMP

廣西重點實驗室建設(shè)項目(編號：15-140-31)；廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)(編號：CICAR2015-Z1)

秦華珍，教授，博士，研究方向：中藥活性成分、藥性、藥效研究，E-mail：937824429@qq.com

柳俊輝，副教授，博士，研究方向：中藥活性成分、藥性、藥效研究，E-mail：451947085@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.007