郝二偉 鄧家剛 杜正彩 侯小濤 繆劍華

(1 暨南大學生物醫(yī)學工程博士后流動站，廣州，510632； 2 廣西中醫(yī)藥大學廣西中藥效篩選重點實驗室，南寧，530001； 3 廣西藥用植物園，南寧，530000)

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復方益智顆粒對Aβ25-35致PC12細胞損傷的神經(jīng)保護作用研究

郝二偉1，2，3鄧家剛2杜正彩2侯小濤2繆劍華3

(1 暨南大學生物醫(yī)學工程博士后流動站，廣州，510632； 2 廣西中醫(yī)藥大學廣西中藥效篩選重點實驗室，南寧，530001； 3 廣西藥用植物園，南寧，530000)

目的:探討復方益智顆粒對Aβ25-35導致PC12細胞損傷的保護作用，為進一步研究該產(chǎn)品改善阿爾茨海默癥記憶功能障礙的作用機制奠定基礎(chǔ)。方法:取經(jīng)不同處理的PC12細胞分為正常對照組、Aβ25-35模型組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG含藥血清組(不同濃度)。正常對照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Aβ25-35模型組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換含20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Aβ25-35+正常血清組：正常血清預處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Aβ25-35+CYZG含藥血清組：不同濃度CYZG含藥血清預處理24 h后，加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別采用MTT法檢測細胞增殖情況、流式細胞儀檢測PC12神經(jīng)細胞凋亡情況。結(jié)果：Aβ25-35時間依賴性地抑制PC12細胞的生長，不同濃度CYZG含藥血清對其造成的細胞損傷有保護作用，隨著含藥血清劑量的增加，細胞的存活率增加，生長抑制率減少。Aβ25-35能顯著引起PC12細胞凋亡，不同濃度CYZG含藥血清對其造成的細胞凋亡有抑制作用。結(jié)論：復方益智顆粒對Aβ25-35引起的PC12細胞損傷具有一定的保護作用，其神經(jīng)保護作用可能與抑制Aβ25-35引起的PC12細胞凋亡有關(guān)。

阿爾茨海默癥；Aβ25-35；細胞凋亡；中藥

復方益智顆粒是中泰聯(lián)合開發(fā)的具有改善記憶功能的中藥保健產(chǎn)品，處方由人參、絞股藍、三七等6味中藥組成，2012年已獲得生產(chǎn)批文和國家發(fā)明專利。前期動物和人體試驗表明，復方益智顆粒具有顯著的改善人體記憶功能的作用[1]；在小鼠跳臺、避暗、水迷宮3項試驗中均被證明具有確切的改善記憶的作用[2]，可顯著改善老齡小鼠的學習記憶能力[3]；復方益智顆粒對Aβ25-35致老年性癡呆模型大鼠空間學習記憶損害也具有明顯改善作用[4]。我們采用Aβ25-35誘導建立老年癡呆細胞模型，觀察益智顆粒對Aβ25-35致PC12細胞損傷和凋亡的保護作用，以期揭示該產(chǎn)品改善阿爾茨海默病患者記憶功能障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，質(zhì)量300 g左右，雄性，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。許可證號：SYXK(湘)2014-0012?；\中鼠顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲食，每天給予12 h光照，適應性飼養(yǎng)1周后才能進行實驗操作。所有動物喂以標準顆粒飼料均由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 細胞株 PC12大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株，購于上海中科院細胞庫。

1.3 試劑及儀器 馬血清(Gibco，美國)、青霉素-鏈霉素溶液(100X)(碧云天)、胎牛血清(Gibco，美國)、胰蛋白酶(碧云天)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)DMSO(Amresco，美國)、Aβ25-35(Sigma，美國)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)、MTT試劑盒(Sigma，美國)、Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒(BD，美國)。

倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)、流式細胞檢測儀(BD，美國)、多功能酶標儀(ThermoFisher，美國)。

1.4 PC12細胞體外培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，10% FBS，1%抗生素(antibiotics/antimycotics(GibcoBRL)，2～3 d換液1次，細胞80%融合度時傳代?？砂凑?∶4傳代比例進行，37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.5 含藥血清的制備 雄性SD大鼠20只，體重300左右g，隨機分為正常對照組和CYZG組，每組10只，CYZG組灌胃給予CYZG混懸液(14 mL/kg)，對照組給予相同體積的生理鹽水，2次/d，2次之間間隔6 h，連續(xù)10 d，末次給藥2 h后腹主動脈采血，收集血清，56 ℃水浴滅活補體，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾除菌，-20 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 AD細胞模型建立 采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡建立AD的細胞模型。PC12細胞用含10%馬血清、5%胎牛血清、100U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～5 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞傳代，傳代時用0.25胰酶消化，顯微鏡下觀察待細胞突起開始收縮時加入含血清的培養(yǎng)基中和，移液槍吹散細胞。收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min去上清，新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后接種于96孔培養(yǎng)板，細胞接種24 h后吸去舊培養(yǎng)基，加入含Aβ25-35(20 μM)不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)指標檢測。

1.7 MTT法檢測細胞增殖情況 1)取經(jīng)不同處理的細胞分為8個組：對照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG血清40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清60 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清100 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組，計數(shù)調(diào)整細胞濃度至1×105/mL。2)分別接種于96孔板中，每孔200 μL，每組細胞設(shè)3個復孔。3)將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，培養(yǎng)細胞到適當時間。4)對照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；Aβ25-35組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換含20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+正常血清組：正常血清預處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+CYZG血清組(40 μL,60 μL,80 μL,100 μL,120 μL)：CYZG含藥血清預處理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。5)向每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))。6)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h。7)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。8)每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。9)同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解遞質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。

1.8 流式細胞儀檢測PC12神經(jīng)細胞凋亡 1)取經(jīng)不同處理的細胞分為8個組：對照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+正常血清組、Aβ25-35+CYZG血清40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組，計數(shù)調(diào)整細胞濃度至1×105/mL。用6孔板培養(yǎng)細胞，待細胞生長達到60%～70%，吸出舊培養(yǎng)基，根據(jù)實驗需求處理，繼續(xù)培養(yǎng)。2)根據(jù)實驗處理時間，把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞1次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。3)取5萬～10萬重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。4)加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。5)室溫(20～25 ℃)避光孵育10 min?？梢允褂娩X箔進行避光。6)1 000 g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。7)加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 實驗結(jié)果

2.1 復方益智顆粒對PC12細胞增殖的影響 見表1。

表1 不同濃度CYZG含藥血清對PC12細胞增殖的影響

注:與Aβ25-35組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 不同濃度CYZG含藥血清對PC12細胞增殖的影響

注：1：Aβ25-35組；2：Aβ25-35+正常血清組；3：Aβ25-35+CYZG血清40 μL組；4：Aβ25-35+CYZG血清60 μL組；5：Aβ25-35+CYZG血清80 μL組；6：Aβ25-35+CYZG血清100 μL組；7：Aβ25-35+CYZG血清120 μL組；抑制率(%)=1-實驗組去除空白后OD值/對照組去除空白后OD值。

根據(jù)以上實驗結(jié)果分析，Aβ25-35時間依賴性地抑制PC12細胞的生長，含藥血清對其修復作用有劑量依賴性，隨著含藥血清劑量的增加，細胞的存活率增加，生長抑制率減少。PC12對后續(xù)實驗低血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清40 μL組；中血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清80 μL組；高血清處理組為Aβ25-35+CYZG血清120 μL組。

2.2 復方益智顆粒對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測各組細胞annexinV/PI染色情況顯示，Aβ25-35處理PC12細胞能夠顯著增加細胞凋亡率(與正常對照組比較，P<0.01)，Aβ25-35+正常血清處理組對Aβ25-35引起的細胞凋亡沒有明顯的影響，不同劑量CYZG含藥血清對Aβ25-35引起的細胞凋亡均可以起到明顯的抑制作用，Aβ25-35+CYZG40 μL組、Aβ25-35+CYZG血清80 μL組、Aβ25-35+CYZG血清120 μL組的凋亡率明顯下降(與Aβ25-35模型組比較，P<0.01)。

圖2 CYZG含藥血清對Aβ25-35致PC12細胞凋亡的影響

注：1：正常對照組，2：Aβ25-35組，3：Aβ25-35+正常血清組，4：Aβ25-35+CYZG血清組(低)，5：Aβ25-35+CYZG血清組(中)，6：Aβ25-35+CYZG血清組(高)。

圖3 各組細胞流式細胞儀檢測信號圖

注：P2-Q2：晚期凋亡細胞；P2-Q3：早期凋亡。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)，是一種嚴重危害老年人身心健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性記憶力減退、認知功能障礙、分析判斷力下降、意識模糊和智力逐漸喪失，最終導致生活不能自理[5]。其特征性病理變化為大腦皮質(zhì)萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neuro Fibrillary Tangles，NFT)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑(Senile Plaque，SP)的形成[6-8]。目前，對于AD的發(fā)病機制有多種假說，其中“Aβ級聯(lián)反應學說”已為大多學者所接受，即各種原因所致的Aβ(β-amyloid)代謝異常，引起Aβ在腦組織的異常增多，在此過程觸發(fā)了與AD病理生理、生物化學相關(guān)的級聯(lián)反應，如膽堿能神經(jīng)損害、突觸可塑性功能障礙等，最終導致神經(jīng)元損害并引起癡呆[9]。因此，Aβ作為一個重要的分子靶點，已經(jīng)成為治療阿爾茨海默病藥物研究與開發(fā)的重點[10]。

本實驗采用Aβ25-35處理PC12細胞建立AD細胞模型。結(jié)果表明，Aβ25-35預處理PC12細胞24 h后，造成細胞損傷，抑制細胞的增殖；CYZG含藥血清預處理24 h后，細胞抑制率降低，不同濃度CYZG含藥血清均能顯著降低細胞抑制率，且呈劑量依賴性；提示CYZG可以有效的抑制Aβ對神經(jīng)細胞造成的毒性，從而起到保護神經(jīng)細胞的作用。

Aβ聚集是AD的早期變化之一，可能導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞死亡[11-12]。神經(jīng)細胞凋亡是AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失現(xiàn)象的重要原因之一[13-15]。本研究結(jié)果表明，Aβ25-35處理PC12細胞能夠顯著增加細胞凋亡率不同劑量CYZG含藥血清對Aβ25-35引起的細胞凋亡均可以起到明顯的抑制作用。本研究結(jié)果揭示復方益智顆?？蓪笰β25-35聚集導致的神經(jīng)細胞損傷和凋亡，具體分子機制還有待進一步研究。

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(2016-10-17收稿 責任編輯：洪志強)

Neuroprotective Effect Research of Compound Yizhi Granule on the PC12 Cell Injury Model Induced by Aβ25-35

Hao Erwei1，2，3, Deng Jiagang2, Du Zhengcai2, Hou Xiaotao2, Miao Jianhua3

(1ThePost-DoctoralResearchStationofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China；2GuangxiMedicinalBotanicGarden,Nanning530000,China; 3GuangxiKeyLaboratoryofEfficacyScreeningofChineseMateriaMedica,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Objective:To observe the protection effects of Fufang yizhi Granule on the cellular damage induced by the protein Aβ25-35,and to be the basis of further study on the mechanism of this product to improve the memory in Alzheimer′s disease. Methods: Different processing cells were divided into Normal control group, Aβ25-35model control group, Aβ25-35+Normal serum group, and Aβ25-35+CYZG serum group, then given different procedure. Normal control group: cultured with DMEM medium for 48 h, Aβ25-35model control group, 24 h after being cultured with DMEM medium, then added the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Aβ25-35+Normal serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained normal serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h, Aβ25-35+CYZG serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained CYZG serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Results: Protein Aβ25-35could time-dependently inhibit the growth of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations had protective effect on the cellular damage, with the increase of the CYZG serum dosage, the cell survival rate increase, and growth inhibition rate decrease. Protein Aβ25-35could induce the apoptosis of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations significantly inhibited the apoptosis. Conclusion: Fufang yizhi Granule could protect the PC12 from the damage induced by Protein Aβ25-35, the mechanism of neuroprotective effect of Fufang yizhi Granule may relate with the inhibition effect of apoptosis.

Alzheimer′s disease; Aβ25-35; Apoptosis; Chinese Materia Medica

廣西國際科技合作項目(編號：桂科合1347004-16)；廣西重點實驗室建設(shè)項目(編號：15-140-31)；廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)(編號：CICAR2015-Z1)

鄧家剛，教授，博士研究生導師，研究方向：中藥藥效篩選及中藥基礎(chǔ)理論研究；E-mail：dengjg53@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.006