曹升旭，王樹林，魯為華，孫海榮，湛寶萍

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

羅馬苜蓿種子休眠、萌發(fā)特性及苗期抗旱性能研究

曹升旭，王樹林，魯為華，孫海榮，湛寶萍

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

【目的】研究不同處理方法對羅馬苜蓿萌發(fā)率的影響，以及在不同干旱脅迫下幼苗根、莖、葉中滲透物質(zhì)的變化?！痉椒ā坎捎?8%濃硫酸浸泡、-18℃低溫、85℃高溫水浴、機械摩擦、液氮浸泡等方法對種子進行處理；同時進行盆栽干旱脅迫試驗，測定不同干旱脅迫下根、莖、葉的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸含量的變化。【結(jié)果】除低溫處理組外，其他各處理均能顯著提高種子發(fā)芽率(P<0.05)，其中，機械處理種子發(fā)芽率最高，較對照組10%提高了9.5倍。隨著干旱脅迫強度增加，羅馬苜蓿各器官可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸滲透物質(zhì)積累量顯著增加(P<0.05)?！窘Y(jié)論】羅馬苜蓿存在大量硬實種子，除低溫處理外，濃硫酸浸泡、高溫水浴、機械摩擦和液氮浸泡處理均能顯著消除種子硬實(P<0.05)；羅馬苜蓿在苗期就可通過產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來應對干旱脅迫，具有較好的抗旱性能。

羅馬苜蓿；發(fā)芽率；干旱脅迫；可溶性糖；可溶性蛋白質(zhì)；脯氨酸

0 引 言

【研究意義】羅馬苜蓿(Medicagofalcatavar.romanica)屬野生黃花苜蓿(Medicagofalcata)變種，為多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，株高25～50 cm。因莖數(shù)多，莖稈纖細，葉量豐富，蛋白質(zhì)含量高，不論青綠期還是枯黃刈割后均能當作家畜優(yōu)良飼草[1-2]。羅馬苜蓿主要分布在新疆塔城巴爾魯克山中低山帶，該生境最突出特點之一是草群中優(yōu)良豆科牧草出現(xiàn)率高、種類多、分布廣和構(gòu)成比重大。以羅馬苜蓿為優(yōu)勢地位的草地占該地區(qū)總草地面積的22.2%，也成為該區(qū)主要的家畜放牧地?！厩叭搜芯窟M展】種子硬實在豆科植物尤其在野生種中普遍存在，前人對羅馬苜蓿近緣種野生黃花苜蓿的種子硬實率進行了測定，其硬實率高達83%[3]。而羅馬苜蓿種子萌發(fā)率經(jīng)過初步測定僅有10%左右。目前，有關(guān)羅馬苜蓿近緣種野生黃花苜蓿種質(zhì)特性以及抗旱性能方面的研究已較為深入，并且取得了一定的研究進展。【本研究切入點】對羅馬苜蓿這一新疆特有種的相關(guān)研究則鮮有報道。針對羅馬苜蓿種子硬實率高，采用不同方法處理種子并觀察萌發(fā)率，獲得打破其種子硬實的處理方法；同時，羅馬苜蓿屬于干旱半干旱山地草原或荒漠草原生長的牧草，其苗期抗旱性能對種群內(nèi)幼苗輸入和種群更新至關(guān)重要。采用模擬干旱脅迫實驗研究羅馬苜蓿根、莖、葉在不同程度干旱脅迫下滲透物質(zhì)的變化，以明確羅馬苜?；谏碚{(diào)節(jié)的抗旱性能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過不同處理條件下種子的萌發(fā)率觀測，明確種子硬實特征以及不同處理方法硬實消除效果；通過干旱脅迫試驗，明確不同干旱脅迫條件下，羅馬苜蓿根、莖、葉中的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸含量的相關(guān)生理指標的含量變化，確定羅馬苜蓿的抗旱性能，最終為羅馬苜蓿種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

用羅馬苜蓿種子采自塔城地區(qū)裕民縣巴爾魯克山海拔1 000～1 200 m的低山帶和緩陽坡坡面，以種莢為采集單位，共采集植株200株，采集完成后將種莢帶回，在實驗室內(nèi)去除種莢，將種子在室內(nèi)晾干，置于棕色牛皮紙袋，冰箱中4℃低溫保存待用。

1.2 方 法

1.2.1 種子處理

對羅馬苜蓿種子共設置10種處理，分別為對照；濃硫酸浸泡(設置1、2、3、5 min 3個時間梯度)；液氮浸泡(設置1、5 min 2個時間梯度)；持續(xù)低溫(-18℃)持續(xù)7 d；熱水水浴(85℃)持續(xù)5 min；砂紙打磨機械處理。各處理完成后，將種子仍置于冰箱中4℃低溫保存待用。

1.2.2 種子吸水性

隨機取出各處理種子50粒，裝入1 mm孔徑的尼龍網(wǎng)中，浸入在20℃水中，分別在浸泡2、4、8、12、24、36、48 h后取出吸干表面水分，稱重，再浸入水中，記錄各次稱量數(shù)據(jù)，重復3次，然后利用公式(1)計算吸水率。

吸水率(%)=[(濕重-干重)/干重]×100%.

(1)

1.2.3 種子萌發(fā)率

采用紙上法(TP)[4]，將自然狀態(tài)下和經(jīng)過處理后的種子隨機挑選50粒，置入雙層濾紙培養(yǎng)皿中，每處理重復3次，在人工氣候箱內(nèi)進行萌發(fā)，根據(jù)采集地植被生長氣候條件設置8 h 15℃/16 h 25℃變溫和光照，每24 h進行萌發(fā)檢測，統(tǒng)計萌發(fā)個數(shù)，胚根出現(xiàn)1～2 mm即可認為已經(jīng)萌發(fā)，直到持續(xù)40 d不再有種子萌發(fā)出現(xiàn)為止，最后以公式(2)、(3)計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率(%)=[發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)]×100%.

(2)

發(fā)芽勢(%)=[發(fā)芽實驗初期(5 d)正常發(fā)芽種子數(shù)/供檢種子數(shù)].

(3)

1.2.4 幼苗抗旱性指標測定

采用室內(nèi)盆栽控水的方式來模擬干旱，選用無孔塑料花盆(高12.5 cm，底徑10 cm，口徑12.5 cm)，取種子采集地表層土，混合均勻等量放入每盆中。每盆播種50粒，出苗后間苗每盆保留健康茁壯植株10株，定期定量供水，澆水量為最大田間持水量的75%～80%(最大田間持水量為25.17%)。出苗3周開始進行干旱脅迫試驗，試驗前澆足水，設正常供水對照組和干旱脅迫兩組，每組每份材料3次重復，干旱脅迫組分別進行2 d(占最大田間持水量的75%～80%)、4 d(占最大田間持水量的40%～45%)、6 d(占最大田間持水量的20%～25%)的干旱脅迫。分別測定對照組和脅迫組羅馬苜蓿葉片、莖部、根系的可溶性蛋白質(zhì)(SP)、可溶性糖(TSS)、脯氨酸(Pro)含量等生理指標，其中TSS含量用蒽酮比色法測定[5]、SP含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[6]、Pro含量采用磺基水楊酸法測定[5]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Excel進行數(shù)據(jù)整理，不同處理下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢數(shù)據(jù)用DPS 10.0進行顯著性檢驗，利用Excel進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及吸水率的影響

研究表明，除了冷凍處理外，其他8種處理方式均能顯著提高羅馬苜蓿種子發(fā)芽率，其中機械處理后羅馬苜蓿種子發(fā)芽率顯著高于其他處理(P<0.05)，達到了95.8%。其次為液氮浸泡5 min和熱水處理組，其發(fā)芽率分別為77.5%和69.2%。液氮浸泡、熱水處理、硫酸處理(2、3、5 min)發(fā)芽率差異不顯著，而硫酸處理1 min組的發(fā)芽率要顯著低于上述處理(P<0.05)。從發(fā)芽勢來看，機械處理后的種子發(fā)芽勢要顯著高于對照和其他處理(P<0.05)。剩余處理中，硫酸處理5 min發(fā)芽勢為63.4%，與處理3 min無顯著差異(P>0.05)。但顯著高于其他處理。冷凍處理、液氮處理1 min及5 min也能夠提高發(fā)芽勢，但三者差異不顯著(P>0.05)。與對照組比較，熱水處理和硫酸處理1 min對種子發(fā)芽勢的提高不顯著(P>0.05)。表1

表1 不同處理羅馬苜蓿種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢

Table 1 The germination rate and energy of seeds under different treatments

注：同列不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)Note: Values followed by different small letters are significantly different at 0.05 level

對各處理種子2～48 h 7個時間點的吸水速率進行了測定，結(jié)果表明，除了吸水量在各處理間有差異外(P<0.05)，不同處理吸水進程表現(xiàn)相似，2～24 h時間段是持續(xù)快速吸水期，24 h后吸水達到飽和，則不再吸水。由于經(jīng)過24 h吸水后水分已達飽和，因此將24 h吸水率作為不同處理吸水特征數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[圖1(A)]。研究表明，經(jīng)過各種處理的種子吸水率顯著高于對照組(P<0.05)。硫酸處理組吸水率提高最為明顯，但硫酸處理不同時間對吸水率的影響存在顯著差異(P<0.05)，處理時間越長種子吸水率越高。機械處理和硫酸處理1 min組二者差異不顯著(P>0.05)。熱水處理組也能顯著提高吸水率(P<0.05)，但要低于機械和硫酸處理。液氮處理組中，處理2和1 min吸水率也明顯增加，但二者差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于處理1 min組(P<0.05)。冷凍處理也能夠增加種子吸水率，但明顯低于前8種處理。

利用吸水率和發(fā)芽率數(shù)據(jù)生成散點圖進行擬合[圖1(B)]。研究表明，二者存在符合形如Y=0.004 1X2+0.856X+26.09(R2=0.108 7，P<0.001)的回歸模型。吸水率增加會使萌發(fā)率明顯升高。但其中的硫酸處理5 min盡管吸水率最高，其發(fā)芽率并非最大，這可能是硫酸浸泡時間長對種子有傷害造成的。圖1

圖1 不同處理羅馬苜蓿種子24 h吸水率(A)以及吸水率與萌發(fā)率之間的關(guān)系(B)

Fig.1 The water absorption rate of seeds in 24 h (A), the relationship of between water absorption and germination rate of seeds (B)

2.2 羅馬苜蓿苗期抗旱性能

分別對不同干旱脅迫條件下羅馬苜蓿葉、莖、根內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量進行了測定。結(jié)果表明，在不同干旱脅迫處理下羅馬苜蓿葉、莖、根中的可溶性蛋白質(zhì)均出現(xiàn)累積，并且隨著脅迫時間延長，其累積量也逐漸加大，其中葉中可溶性蛋白質(zhì)含量增加幅度最高，由干旱脅迫前的2.65 mg/g增加到最終的6.25 mg/g。在不同處理中，除了脅迫2和4 d莖中的可溶性蛋白質(zhì)含量差異不顯著外(P>0.05)，其他處理的葉、莖、根中的可溶性蛋白質(zhì)具顯著差異(P<0.05)(圖2A)。

葉、莖、根中的可溶性糖在整個處理期總體呈現(xiàn)先降低—再升高的波動變化。其中根部可溶性糖含量在各個處理中均表現(xiàn)出最高，不同處理根部可溶性糖含量以處理6 d積累量最高，每100 g含量達到了143.83 g，而處理2 d積累量最低，僅為19.04 g。就所有處理來看，根內(nèi)可溶性糖含量在各處理間也存在顯著差異(P<0.05)，葉和莖中的可溶性糖盡管在各處理中積累量較根中少，但各處理間仍存在顯著差異(P<0.05)。

脯氨酸含量在處理前后存在顯著差異，隨著干旱程度加強，脯氨酸積累在各器官中均明顯增加。未脅迫組脯氨酸含量較少，各器官中的含量僅在2.0～5.12 μg/g。在持續(xù)干旱脅迫4 d后，其累積量急速上升，并且葉中脯氨酸含量增加速度最為明顯，在4和6 d后分別達到662.1和842.6 μg/g。就所有處理來看，所有器官內(nèi)脯氨酸含量在各處理中也存在顯著差異(P<0.05)。圖2

羅馬苜蓿在苗期可通過多種滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)的累積來應對干旱脅迫，這也正是羅馬苜蓿在干旱地區(qū)能夠生長良好所采取的生理適應對策。

圖2 干旱脅迫條件下羅馬苜蓿主要器官內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)(A)、可溶性糖(B)及脯氨酸(C)累積特征

Fig.2 The accumulation of soluble protein (A), soluble sugar (B), and proline (C) in leaves, stems and roots of M.falcata var.romanica seedlings

3 討 論

3.1 各處理對羅馬苜蓿種子休眠性的影響

Baskin將種子休眠分為五種類型[7]，其中主要原因是種子具有堅硬的種皮，透水透氣性弱而抑制種子萌發(fā)的成為物理休眠[8]。羅馬苜蓿為典型的野生豆科牧草，其種子外圍具致密種皮，吸水和萌發(fā)試驗的結(jié)果證明其原始狀態(tài)種子吸水率極低，同時萌發(fā)率也僅為10%左右。說明種皮嚴重阻礙種子吸水而導致休眠[9]，因而，采取合適的處理方法破壞種皮致密結(jié)構(gòu)是打破其種子休眠的關(guān)鍵。

實驗采用物理化學方法對羅馬苜蓿種子進行處理，其發(fā)芽率均有一定的提高。其中機械在很大的程度上提高了種子的萌發(fā)率。諸多實驗也表明擦破種皮可解除因種皮透性差引起的休眠[7]。但目前沒有專用的機械處理設備，因此，該方法不適用在生產(chǎn)實際中大批量處理種子。溫水浸種對羅馬苜蓿種子休眠的解除明顯，其原因是溫水可以軟化種皮，使得種子表面的蠟質(zhì)層變薄，從而提高透性和浸出種子內(nèi)的發(fā)芽抑制物[10]，說明85℃可作為解除休眠的較為合適的溫度，這與前人在其它種子的報道一致[11]。羅馬苜蓿經(jīng)液氮處理后休眠解除的效果較好，其中液氮處理5min效果最好，但萌發(fā)后有短柄種子出現(xiàn)，且發(fā)芽勢偏低，這可能是由于溫度劇變而傷到種胚引起種子不正常萌發(fā)。濃硫酸浸泡是解除豆科牧草種子物理休眠最常用的方法之一。濃硫酸浸泡后，羅馬苜蓿的萌發(fā)率顯著提高，種子的萌發(fā)勢也顯著增加，這對于實際生產(chǎn)中作物出苗整齊度很有意義[12]。但濃硫酸處理過程中，由于其具有強烈腐蝕作用，如處理時間過長，可能會造成種子活力喪失，因此，在處理時間的把握上需要謹慎。冷凍處理也被認為是打破種子休眠性很好的方法，但從對羅馬苜蓿種子的冷凍處理來看，效果并不理想，可能是因為在-18℃低溫下，并不能使種皮與子葉(胚乳)由于收縮程度不同而分離或種皮開裂，因此，其發(fā)芽率與對照組比較無顯著差異?？傮w來看，濃硫酸處理5 min可使羅馬苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢有較大幅度提高，并能大批量處理種子，因此在實際生產(chǎn)中可考慮使用該處理方法。

3.2 羅馬苜蓿苗期抗旱性能

脯氨酸和可溶性糖經(jīng)常被作為在干旱脅迫下植物體內(nèi)積累的滲透物質(zhì)研究。在實驗中，在干旱的脅迫下，二者都有積累現(xiàn)象。但羅馬苜蓿根部可溶性糖積累明顯，說明在干旱脅迫下，根系能迅速反應，積累大量來抵御脅迫對苜蓿根系帶來的傷害[13]。其原因一是，干旱脅迫程度加深對羅馬苜蓿根系的生長有刺激作用，導致較多的碳水化合物向根系運輸。二是，在干旱脅迫下根系需要較高濃度的可溶性糖來維持低的細胞滲透勢，以加強根系對水分的吸收能力[14]，大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物的抗旱性與植物體內(nèi)尤其是根系內(nèi)可溶性糖累積有關(guān)[15]。而羅馬苜蓿葉部脯氨酸積累量大于根部、莖部，可能是由于脯氨酸作為主要的滲透物質(zhì)，在干旱條件下，葉部大量積累有助于葉肉細胞或組織持水，增強其抗旱性。當植物受到逆境脅迫時，體內(nèi)脯氨酶積累，尤其是干旱時積累最多，可比原始含量增加幾十倍到幾百倍[16]。而研究中隨著干旱的脅迫根、莖、葉脯氨酸積累的量分別是對照組的250、200、400倍。說明在干旱脅迫下羅馬苜蓿大量積累脯氨酸，使自身細胞持水能力增強，從而增加其抗旱能力[17-18]。

關(guān)于可溶性蛋白質(zhì)的代謝變化在植物抗性生理中意義還存在一定爭論。研究中，隨著干旱脅迫的增加，羅馬苜蓿各個器官的可溶性蛋白質(zhì)都持續(xù)增長，這與宋莉萍[19]的4種根莖型禾本科牧草抗旱生理適應性研究中所得出可溶性蛋白質(zhì)隨水分脅迫的加強會呈現(xiàn)出現(xiàn)降低的趨勢這一結(jié)論有所不同。而與霍學敏[20]在兩種紫花苜蓿對干旱脅迫的生理生化響應研究中所得出干旱脅迫時間和程度的加重，可溶性蛋白積累量增加這一結(jié)論一致。而在研究中隨著干旱脅迫的增加，羅馬苜蓿葉部可溶性蛋白質(zhì)積累量大于根部、莖部，可能是由于可溶性蛋白質(zhì)具有高度親水性，能吸附大量束縛水，而有助于降低滲透勢，把足夠的水分保持到葉肉細胞或組織內(nèi)，保護細胞或組織免受水分脅迫的傷害[21]。

4 結(jié) 論

98%濃硫酸浸泡、-18℃低溫、85℃高溫水浴、機械摩擦、液氮浸泡處理都可破除羅馬苜蓿種子的休眠，但各有優(yōu)缺點。機械摩擦處理的萌發(fā)率最高，但處理大量種子時費時費力；液氮處理和熱水85℃處理雖然萌發(fā)率較好，但發(fā)芽勢較低，在實際生產(chǎn)過程中會導致長勢不一的弊病。-18℃低溫處理后萌發(fā)率提高不明顯，而98%濃硫酸浸泡5 min處理后大部分生長正常且發(fā)芽率、發(fā)芽勢都較高，少部分羅馬苜蓿種子變黑腐敗。因此在實踐生產(chǎn)中，選擇濃硫酸5 min的處理方法較好。

干旱脅迫下，羅馬苜蓿體內(nèi)脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量隨時間延長和干旱程度加重均呈增長趨勢。其中脯氨酸含量增長最為明顯，最高時達到對照組的幾百倍，說明三種滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)物質(zhì)中，脯氨酸起到了主要的作用。三種滲透物質(zhì)的綜合測定說明羅馬苜蓿在苗期就具備完全的適應干旱環(huán)境條件的生理適應對策。這一適應對策也是羅馬苜蓿在荒漠草原和典型草原這種干旱環(huán)境中能夠生長良好的根本原因。

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Fund project:Supported by NSFC (31360568)

The Study onMedicagofalcatavar.romanicaSeed Dormancy, Germination Characteristics and Seedling Drought Resistance

CAO Sheng-xu, WANG Shu-lin, LU Wei-hua, SUN Hai-rong, ZHAN Bao-ping

(CollegeofAnimalandScienceTechnologyShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832000,China)

【Objective】 This study aims to research the germination rate ofMedicagofalcatavar.romanicaunder different treatments and its drought tolerance at seedling stage.【Method】Different methods such as 98% H2SO4soaking (1, 2, 3, 5 min), the low temperature (-18℃, 5 min), high temperature water (85℃, 7 d), sandpaper polishing, liquid nitrogen soaking (1, 5 min) and control group were used to handle seeds and then measure their germination rate. At the same time, pot experiment was conducted in the greenhouse to measure the changes of soluble sugar, soluble protein and proline content in roots, stems and leaves under different drought stress.【Result】Except the low temperature treatment group, other treatments could significantly improve the seed germination rate (P<0.05). Among them, the seed germination rate of sandpaper polished seeds was the highest, 9.5 times higher than the control group (10%). The soluble sugar, soluble protein, and proline were significantly increased with increasing of drought stress (P<0.05).【Conclusion】There are many hard seeds inM.falcatavar.romanica. H2SO4soaking, high temperature water, sandpaper polishing and liquid nitrogen soaking could eliminate seed dormancy (P<0.05). Seedlings ofM.falcatavar.romanicahave powerful resistance ability against any drought stress through increasing content of osmoregulation substance.

Medicagofalcatavar.romanica；germination rate; drought stress; soluble sugar; soluble protein; proline

2016-06-12

國家自然科學基金項目(31360568)

曹升旭(1994-)，吉林人，本科生，研究方向為草地資源與生態(tài)，(E-mail)1508202269@qq.com

魯為華(1976-)，新疆人，副教授，博士，研究方向為草地資源與生態(tài)，(E-mail)winnerlwh@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.12.015

S541+.1

：A

：1001-4330(2016)12-2272-08