王建輝, 劉建軍, 陳克玲，李洪雯,何 建,關(guān) 斌，何 禮

(1.農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 四川 成都 610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 四川 成都 610066)

草莓輕型黃邊病毒檢測研究

王建輝1,2, 劉建軍1，3*, 陳克玲1,2，李洪雯1,2,何 建1,2,關(guān) 斌1,2，何 禮1,2

(1.農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 四川 成都 610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 四川 成都 610066)

本文對草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)的2種分子檢測技術(shù)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，多重PCR技術(shù)以草莓a(chǎn)ctin為內(nèi)參基因，完全排除在實(shí)驗(yàn)中雜質(zhì)與操作的影響。Real time PCR技術(shù)具有更高的靈敏度和可靠性，可以定量檢測出樣本中病毒粒子的含量。結(jié)果表明，Real time PCR的靈敏度是普通PCR的100倍以上，而多重PCR的檢測成本更經(jīng)濟(jì)。所以Real time PCR技術(shù)將用于引進(jìn)品種的檢疫，而多重PCR技術(shù)將用于大規(guī)模的脫毒苗的檢驗(yàn)。

草莓；草莓輕型黃邊病毒；多重PCR；熒光定量PCR

草莓(Fragariaxananassa) 是薔薇科草莓屬多年生草本植物。我國是草莓屬植物種類分布最多的國家，同時(shí)也是世界上草莓栽培面積最大、產(chǎn)量最多的國家。由于長期無性繁殖和連作導(dǎo)致草莓種性退化以及感染病毒病，使其常表現(xiàn)為植株矮化、抗逆性降低、畸形果增加、果實(shí)品質(zhì)下降，單位面積產(chǎn)量降低。草莓病毒病在世界各地分布廣泛，其中草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)是分布較廣、危害較重的RNA潛隱性病毒。草莓輕型黃邊病毒是一種線形病毒粒子，歸屬于馬鈴薯X 病毒屬[1]。草莓輕型黃邊病毒侵染智利草莓(F.chiloensis)和鳳梨草莓(F.ananassa)，通常無癥狀，但侵染森林草莓(F.vesca)癥狀為小葉凹陷、葉緣褪綠、植株長勢衰退，病毒粒子無包膜，直徑23～28 nm[2]。

利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的多重RT-PCR技術(shù)，廣泛用于草莓、葡萄等病毒病檢測[3-4]，但是常規(guī)PCR技術(shù)因?yàn)殪`敏度較低可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。陳柳等[5]報(bào)道了將靈敏度較高的RT-LAMP(反轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增)技術(shù)用于草莓輕型黃邊病毒的檢測。近年在臨床上早已推廣的熒光定量PCR(Real time quantitative PCR)技術(shù)具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。目前Real time PCR技術(shù)廣泛地運(yùn)用于人類病毒病的診斷，但Real time PCR在草莓病毒上應(yīng)用還未曾報(bào)道，因此本文比較研究了多重PCR和熒光定量PCR技術(shù)對草莓SMYEV病毒檢測。

1 材料與方法

1.1 草莓葉片總RNA提取

分別采集四川省冬草莓生產(chǎn)田中‘豐香’、‘章姬’和‘紅顏’等主栽品種成熟葉片，保存于4 ℃冰箱。稱取100 mg葉片新鮮組織進(jìn)行液氮粉碎，充分碾磨后轉(zhuǎn)移至滅菌離心管(2 mL)。利用植物RNA提取試劑盒(華越洋，北京)，提取葉片總RNA并定溶于100 μl RNA洗脫液中。使用RNA純化試劑盒(天根，北京)純化上述100 μl總RNA粗提液，最后定溶于50 μl滅菌超純水中。取RNA終溶液2 μl，用超微量微孔板分光光度計(jì)(BIO-TEK，美國)檢測葉片RNA的濃度和純度后，存放于-20 ℃待用。

1.2 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA

分別在1.5 mL EP管中加入約3 μl總RNA(約1500 ng)，18 μl RNase-Free ddH2O和3 μl六堿基隨機(jī)引物(TaKaRa，大連)，EP管置于95 ℃水浴5 min，立即冰浴2 min。在上述管中分別加入1 μl MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，大連)、10 μl反轉(zhuǎn)錄酶buffer、7.5 μl RNase-Free ddH2O、5 μl dNTP(2.5 mM)和2.5 μl DTT(50 mM)，在37 ℃水浴10 min后，立即轉(zhuǎn)移到42 ℃水浴60 min。最后轉(zhuǎn)移至70 ℃水浴5 min滅活。

多重PCR檢測。分別以草莓a(chǎn)ctin和SMYEV的CoatProtein為目的基因的多重?cái)U(kuò)增體系為：cDNA 2.0 μl、Buffer 2.5 μl、dNTP 0.5 μl、MgCl22.0 μl、FAactin-F1上游引物 0.25 μl、FAactin-R1下游引物0.25 μl、SMYEV-CP1上游引物0.5 μl、SMYEV-CP2下游引物0.5 μl(表1)、Taq聚合酶0.5 μl、ddH2O 16 μl。PCR擴(kuò)增程序包括：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s、60 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸 50 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min(Eppendorf，德國)。2 %瓊脂糖水平電泳后，凝膠成像儀照相記錄(BIO-RAD，美國)。

1.3 病毒外殼蛋白基因的克隆與分析

利用凝膠回收試劑盒(OMEGA，美國)回收SMYEV的擴(kuò)增片段，并連入克隆載體pMD-19T(TaKaRa，大連)。通用引物進(jìn)行測序(擎科梓熙生物技術(shù)有限公司，成都)。使用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，并登入核酸數(shù)據(jù)庫(GenBank，美國)。DNAMAN軟件分析不同地理來源的病毒分離株的核酸序列同源性。在美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)核酸數(shù)據(jù)庫里下載不同地理來源的SMYEV分離株的外殼蛋白基因序列(AJ577359、D12517、N003794和Y13938)進(jìn)行病毒序列的系統(tǒng)進(jìn)化研究。Mega 3.1軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)，并設(shè)定1000重復(fù)值的bootstrap評估遺傳距離分枝的可信度，構(gòu)建不同地理起源分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 常規(guī)PCR和Real time PCR技術(shù)比較研究

普通PCR擴(kuò)增體系為：cDNA 2.0 μl、Buffer 2.5 μl、MgCl22.0 μl、SMYEV-CP1上游引物0.5 μl、SMYEV-CP2下游引物0.5 μl(或者FAactin-F1上游引物 0.5 μl、FAactin-R1下游引物0.5 μl)、Taq聚合酶0.5 μl、dNTP0.5 μl、ddH2O 16.5 μl。Real time PCR擴(kuò)增體系：SYBR 10 μl(Roche，瑞士)、SMYEVcp-F3 0.18 μl、SMYEVcp-R6 0.18 μl(表1)、cDNA模板 2 μl、滅菌超純水 7.64 μl。Real time PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃變性 10 s，57 ℃復(fù)性10 s，72 ℃復(fù)性15 s(收集熒光信號), 35個(gè)循環(huán)；95 ℃變性1 s，60 ℃復(fù)性1 s， 95 ℃持續(xù)收集熒光信號；40 ℃保存30 s。Light Cycler?480軟件對SMYEV病毒含量進(jìn)行絕對定量分析(Roche，瑞士)。

1.5 多重PCR技術(shù)在脫毒苗檢測中的應(yīng)用

分別采集四川省農(nóng)科院新都基地脫毒苗和雙流縣果農(nóng)繁育圃中普通苗的成熟葉片(‘豐香’)，利用上述多重PCR技術(shù)進(jìn)行10余個(gè)樣本的SMYEV病毒檢測，并綜合評價(jià)本項(xiàng)檢測技術(shù)的成本和消耗時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR檢測SMYEV病毒

利用商業(yè)試劑盒提取并純化葉片組織總RNA，濃度大約500 ng/μl，純度大約為2.0(OD260/OD280)，合計(jì)25 μg/樣本。多重RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增待測樣本的SMYEV病毒目的基因和草莓內(nèi)參基因。圖1箭頭所示的病毒擴(kuò)增目標(biāo)條帶(大約400 bp)，即樣本3-1(‘章姬’草莓)感染了這種病毒。此外，樣本25-3(‘紅顏’草莓)只得到了草莓a(chǎn)ctin內(nèi)參基因擴(kuò)增片段(大約100 bp)，即樣本25-3并沒有感染SMYEV。本實(shí)驗(yàn)成功獲得了草莓葉片總RNA，克服了葉片組織中多糖、多酚等雜質(zhì)對后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的影響。

表1 不同目的基因的擴(kuò)增引物對

圖1 多重PCR擴(kuò)增SMYEV外殼蛋白基因和草莓內(nèi)參基因actin(M，1，2和3分別代表DL500 marker，25-3，3-1樣本和陰性對照)Fig.1 Multiplex PCR amplified the fragments of virus CP and internal Actin (M,1,2 and 3 indicated DL500 marker, Sample No.25-3, Sample 3-1 and negative control)

2.2 病毒外殼蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究對SMYEV病毒感染‘豐香’草莓(1～8號樣本)的外殼蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆并獲得全長序列378 bp，并命名為YE8-3四川分離株。分別對不同地理來源的SMYEV病毒的外殼蛋白基因核酸序列進(jìn)行了多重比對發(fā)現(xiàn)，分離株之間具有高度同源性(數(shù)據(jù)略)。SMYEV四川分離株(GenBank登錄號：KF960803)與AJ577359和Y13938(德國分離株)在一個(gè)聚類群內(nèi)(圖2)。此外，5個(gè)分離株的病毒外殼蛋白基因片段的核酸序列之間具有93.49 %的相似性。因此以四川分離株外殼蛋白基因核酸序列為模板，利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)Real time PCR定量檢測SMYEV病毒的特異引物對(SMYEVcp-F3和SMYEVcp-R6，表1)。

圖2 不同SMYEV病毒分離株的部分外殼蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed based on the partial CP sequences of the different isolates

2.3 Real time PCR靈敏度比較研究

上述1～8號樣本的cDNA分別梯度稀釋101、102、103、104、105、106倍后，Real time PCR分別擴(kuò)增上述樣本感染的SMYEV外殼蛋白基因(圖3-A)。其中，稀釋101、102倍的樣本cDNA為模板的擴(kuò)增曲線在35個(gè)循環(huán)內(nèi)發(fā)生起跳。另外，稀釋103倍的cDNA為模板任然有檢測信號。與之相比較，普通PCR擴(kuò)增SMYEV外殼蛋白基因在35個(gè)循環(huán)內(nèi)，只有稀釋101倍的樣本cDNA擴(kuò)增得到預(yù)期分子大小的片段(圖3-B)。

圖3 常規(guī)PCR與Real time PCR的檢測極值(1，2，3，4，5和6分別代表梯度稀釋101、102、103、104、105、106倍的cDNA)Fig.3 Comparison on the sensitivity of the two detection techniques between conventional PCR (Real time PCR 1,2,3,4,5 and 6 indicated the 101,102,103,104,105,106 serial dilutions)

圖4 梯度稀釋重組質(zhì)粒pMD-19-SMYEVcp構(gòu)建SMYEVcp標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Real time PCR obtained by serial dilutions of recombinant plasmids pMD-19-SMYEVcp

1,2分別代表25-2和1～8號樣本1,2 indicated the sample 25-2 and sample 1-8圖5 普通PCR和Real time PCR檢測Fig.5 Comparison study on the conventional PCR and Real time PCR

圖6 多重PCR檢測技術(shù)草莓繁育體系中的應(yīng)用(CK1、CK2分別代表脫毒苗，1～10分別代表普通母株)Fig.6 The multiplex PCR performed in the virus free seedlings identification CK1, CK2 indicated virus free seedlings and 1-10 indicated mother plants in the nursery

2.4 Real time PCR定量檢測研究

上述1～8號樣本的四川分離株的部分外殼蛋白基因的重組質(zhì)粒pMD-19-SMYEVcp，分別以稀釋至1.57、0.79、0.39和 0.20 pg/μl并作為待擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)品，Real time PCR擴(kuò)增SMYEV外殼蛋白基因。分別獲得四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值：24.61、25.84、27.41和28.71(圖4A)。EXCEL軟件線性回歸分析，得到擬合曲線方程Y=-0.3229X+9.3399，R2=0.91(圖4B)。通過回歸方程可以計(jì)算獲得，當(dāng)Ct值=28.71(本軟件的定量檢測極限為Ct≦29)的檢測病毒極限濃度為21 554 拷貝/μl。

2.5 常規(guī)PCR與Real time PCR比較研究

25-2號樣本(‘紅顏’)和1～8號樣本(‘豐香’)，分別利用普通PCR和Real time PCR進(jìn)行檢測。圖5-A中普通PCR擴(kuò)增結(jié)果表明2個(gè)樣本的內(nèi)參基因(actin)的擴(kuò)增濃度大小一致，表明樣本總RNA的濃度大致相同。然而，病毒目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著，即25-2號樣本中病毒模粒子濃度低于1～8號樣本。Real time PCR檢測結(jié)果表明1～8號樣本的Ct值為26.18。通過回歸方程可以計(jì)算1～8號感染SMYEV濃度大概為：0.89 pg/μl，大約275 132 拷貝/μl。

2.6 多重PCR技術(shù)在脫毒苗繁育中的檢測

分別對脫毒苗和普通苗(圖6A)進(jìn)行多重PCR快速檢測。農(nóng)民繁育圃內(nèi)母株的SMYEV病毒感染率較高(圖6B)，從而影響當(dāng)年匍匐莖子苗質(zhì)量和果實(shí)的最終品質(zhì)。多重PCR耗時(shí)6.5 h，成本花費(fèi)35元/樣本，主要用于購買總RNA的提取和純化試劑盒。與之相比較Real time PCR耗時(shí)5.5 h，成本花費(fèi)55元/樣本。盡管自制提取溶液和硅膠顆粒吸附法[6]可以用來制備高質(zhì)量的草莓總RNA(數(shù)據(jù)略)。為了推廣多重PCR技術(shù)進(jìn)行脫毒苗檢測，推薦使用國產(chǎn)植物快速RNA提取試劑盒，并且在草莓全生育期檢測需要配備總RNA純化試劑盒，以提高本項(xiàng)技術(shù)的實(shí)用性和普遍性。

3 討 論

Real time PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于人類血液、腦脊液、咽喉拭子等不同組織樣本進(jìn)行病毒病檢測[7-8]，但是由于成本的原因在植物病毒檢測中應(yīng)用不多。Roche熒光PCR儀的SMYEV病毒檢測極限濃度大約20 000個(gè)拷貝/μl。與之相比較，普通PCR不能定量檢測出病毒粒子的含量，即不能用于早期診斷病毒感染。同時(shí)，Real time PCR是一種高靈敏的檢測技術(shù)，稀釋1000倍的cDNA樣本為模板也有檢測信號。與之相比較，普通PCR擴(kuò)增SMYEV外殼蛋白基因在35個(gè)循環(huán)內(nèi)，只有稀釋10倍的樣本cDNA擴(kuò)增得到預(yù)期分子大小的片段。這說明Real time PCR的檢測靈敏度大約是普通PCR的100倍以上。

本研究成功克隆了SMYEV四川分離株的外殼蛋白基因序列并登陸了GenBank。根據(jù)SMYEV四川分離株的外殼蛋白基因核酸序列，設(shè)計(jì)Real time PCR擴(kuò)增的上游、下游特異引物對。針對‘豐香’、‘紅顏’、‘章姬’等四川主栽品種的SMYEV病毒檢測，具有非常高的特異性與靈敏性。同時(shí)，以草莓a(chǎn)ctin為待檢測的內(nèi)參基因，保證多重PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性，完全避免‘假陰性’結(jié)果產(chǎn)生。產(chǎn)生此現(xiàn)象的主要的問題是由于RNA提取過程中沒有充分除去多糖、多酚等雜質(zhì)，從而干擾后續(xù)反轉(zhuǎn)錄或者擴(kuò)增反應(yīng)。目前，常規(guī)ELISA檢測需要向國外訂購待測病毒的血清試劑盒，大約花費(fèi)30元/樣本，耗時(shí)36 h以上，并且不能用于病毒病的早期診斷。因此本實(shí)驗(yàn)建立的Real time PCR技術(shù)是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法，適用于檢疫部門對進(jìn)口草莓苗木、產(chǎn)品的檢驗(yàn)。而多重PCR技術(shù)可以廣泛地用于草莓脫毒苗繁育體系檢測，從而促進(jìn)我國草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

[1]JelkmannW, Martin R R, Lesemann D E，et al. A new potexvirus associated with strawberry mild yellow edge disease[J]. Journal of General Virology, 1990, 71:1251-1258.

[2]周厚成，何水濤. 草莓病毒病研究進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào)，2003，20(5)：421-426.

[3]王 紅，王菁菁，張科立，等. 利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的多重RT-PCR技術(shù)檢測草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 26(1):105-109.

[4]王建輝，劉建軍，陳克玲，等. 葡萄卷葉伴隨3型病毒、葡萄A病毒多重檢測優(yōu)化研究與其系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38(12)：2401-2410.

[5]陳 柳，尚巧霞，陳笑瑜，等. 草莓輕型黃邊病毒RT-LAMP 檢測方法的建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(3)：613-620.

[6]王建輝，劉建軍，陳克玲，等. 三種葡萄病毒的檢測和系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2013，30(2)：197-201.

[7]Arvia R, Corcioli F, Ciccone N et al. Detection of 12 respiratory viruses by duplex real time PCR assays in respiratory samples[J]. Molecular and Cellular Probes, 2015，29(6):408-413.

[8]Wonga A A, Pabbarajua K, Wonga S，et al. Development of a multiplex real-time PCR for the simultaneous detection of herpes simplex and varicella zoster viruses in cerebrospinal fluid and lesion swab specimens [J]. Journal of Virological Methods, 2016,229:16-23.

(責(zé)任編輯 李 潔)

Studies on Detection Techniques onStrawberrymildyellowedgevirus

WANG Jian-hui1,2, LIU Jian-jun1,3*, CHEN Ke-ling1,2, LI Hong-wen1,2,HE Jian1,2, GUAN Bin1,2, HE Li1,2

(1.Horticulture Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China; 2.Key Laboratory of Horticultural Crops Biology and Germplasm Enhancement in Southwest Regions, Ministry of Agriculture, Sichuan Chengdu 610066, China)

The comparative studies of two detection techniques onStrawberrymildyellowedgevirus(SMYEV) were performed, respectively. UsingactinofFragariaxananassaas internal reference, multiplex PCR technique was used to detect SMYEV to avoid influencing by contaminants and mistakes. However, real time PCR was more sensitive and reliable detection on SMYEV quantitatively. The detection sensitivity of real time PCR is more than 100 folds than that of conventional PCR. But the multiplex PCR is more economic detection technique than real time PCR. So that real time PCR is used in the quarantine inspection for the importing varieties but the multiplex PCR is performed in the virus free seedlings verification, respectively.

Fragariaxananassa；Strawberrymildyellowedgevirus；Multiplex PCR；Real time PCR

1001-4829(2016)12-2866-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.018

2015-12-22

四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程-高新技術(shù)應(yīng)用專項(xiàng)(2013-GXJS007);四川省專利實(shí)施與促進(jìn)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2016-SS-00011)

王建輝(1978-)，男，副研究員，博士，從事果樹生物技術(shù)育種，*為通訊作者，E-mail:sc.liujianjun@163.com。

S668.4

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