吳標(biāo)良，唐乾利，覃曉潔，馮 烈，王民登，何明杰，呂 震

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西百色 533000；4.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，廣州 510632；5.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科,南寧 530023)

基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信號(hào)通路與糖尿病足免疫表達(dá)關(guān)系的研究

目的 觀察燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)[濕潤(rùn)暴露療法(MEBT)/濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)]對(duì)糖尿病足部創(chuàng)面組織細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2 和p38信號(hào)通路分子及免疫表達(dá)的調(diào)控作用及關(guān)系，探討MEBT/MEBO對(duì)糖尿病足潰瘍的修復(fù)機(jī)制。方法 糖尿病足患者40例予MEBT/MEBO干預(yù)治療，留取治療前后創(chuàng)面組織行免疫組化檢測(cè)ERK1/2和p38信號(hào)通路關(guān)鍵分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK6)、原癌基因(c-myc)、Akt、活化復(fù)制因子2抗體(ATF2)及免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c表達(dá)情況，并觀察二者間關(guān)系。結(jié)果 經(jīng)MEBT/MEBO治療后，39例患者足部創(chuàng)面面積有不同程度縮小，僅1例患者無(wú)明顯變化，顯效14例(35.00%)，有效25例(62.50%)，無(wú)效1例(2.50%)。治療前后信號(hào)通路分子全陽(yáng)性表達(dá)、免疫陽(yáng)性表達(dá)(任一指標(biāo))及免疫陽(yáng)性表達(dá)(具體指標(biāo))比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在創(chuàng)面信號(hào)通路分子表達(dá)陽(yáng)性率升高的同時(shí)，免疫因子陽(yáng)性表達(dá)率亦升高。治療前創(chuàng)面組織可見(jiàn)免疫因子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c呈廣泛、彌漫分布。治療前創(chuàng)面組織可見(jiàn)信號(hào)分子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織信號(hào)通路分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2呈廣泛、彌漫分布。結(jié)論MEBT/MEBO可能促進(jìn)了糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2 和p38信號(hào)通路分子及免疫表達(dá)，ERK1/2和p38信號(hào)通路及其交互作用可能通過(guò)增加創(chuàng)面組織免疫表達(dá)而促進(jìn)了糖尿病足創(chuàng)面的愈合。

糖尿病足；燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；p38；免疫

糖尿病足已成為糖尿病的主要嚴(yán)重并發(fā)癥之一，臨床上尚無(wú)特效治療方法，最終有較高比例患者需要截肢[1-2]。目前已有多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和p38信號(hào)通路及其交互作用在促進(jìn)傷口愈合中起著非常關(guān)鍵的作用[3-4]，基于免疫機(jī)制推測(cè)，在潰瘍創(chuàng)面形成及愈合過(guò)程中，免疫可能發(fā)揮重要的防御、保護(hù)作用。本研究擬通過(guò)觀察濕潤(rùn)暴露療法(MEBT)/濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)對(duì)糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2和p38信號(hào)通路分子及免疫因子的表達(dá)調(diào)控與二者間的關(guān)系，從而探討MEBT/MEBO促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2014年6月于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和廣西中醫(yī)藥大學(xué)一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科確診2型糖尿病(T2DM)并糖尿病足患者40例，男24例，女16例，年齡33～72歲，平均(52.83±10.95)歲。符合WHO 1999 T2DM及糖尿病足診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。臨床上具有嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟疾病患者或急性腦血管意外、創(chuàng)傷、免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤、精神病史及近1年內(nèi)有服用類固醇激素、抗生素等用藥史的患者予以排除，治療過(guò)程中死亡患者亦予不能入選。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且經(jīng)患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本取材 采用常規(guī)方法清理創(chuàng)面，然后在治療前取創(chuàng)面肌肉肉芽組織。按MEBT/MEBO操作規(guī)程處理創(chuàng)面：依據(jù)創(chuàng)面大小取適量MEBO(汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)美寶制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004)，作成MEBO紗條，均勻覆蓋在潰瘍面上，2次/天換藥，一直到潰瘍創(chuàng)面愈合；若創(chuàng)面有較多壞死組織時(shí)，先清理，經(jīng)10～14 d治療后再次取創(chuàng)面組織。同時(shí)予常規(guī)血糖、血壓和血脂控制，并酌情予以改善循環(huán)、抗感染等處理。

1.2.2 療效判定

1.2.2.1 創(chuàng)面面積變化評(píng)估 痊愈：創(chuàng)面完全愈合，臨床癥狀消失；顯效：創(chuàng)面縮小大于或等于75%，臨床癥狀消失；有效：創(chuàng)面縮小大于或等于25%，臨床癥狀改善；無(wú)效：創(chuàng)面縮小不足25%，臨床癥狀無(wú)改善。

1.2.2.2 療效指數(shù)評(píng)估 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。見(jiàn)表1。

1.2.3 生化項(xiàng)目檢測(cè) 清晨空腹采血3～5 mL，靜置30 min，然后進(jìn)行離心(3 000 r/min)5 min，取血清檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbA1c，高效液相色譜分析法)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，IFCC推薦修正法)、三酰甘油(TG，GPO-PAP法)等生化指標(biāo)，由專人使用美國(guó)貝克曼COULTER LX20全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)測(cè)定。

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 創(chuàng)面組織標(biāo)本行免疫組化染色，采用多聚合物酶EliVision法測(cè)定通路信號(hào)分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK6)及其底物分子原癌基因(c-myc)、Akt、活化復(fù)制因子2抗體(ATF2)和免疫指標(biāo)IgA、IgM、IgG、C3c、C4c的表達(dá)情況，先取材，然后行石蠟切片，并按試劑盒(immunoway試劑盒)說(shuō)明書免疫組化操作。細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)等部位出現(xiàn)褐色沉著為免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)，可為連續(xù)線狀、不連續(xù)點(diǎn)狀彌漫分布。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)及臨床療效觀察 40例患者糖尿病病程(8.03±3.68)年，收縮壓(135.38±12.45)mmHg，舒張壓(78.15±8.42)mmHg，HbA1c(8.05±2.49)%，TC(5.29±2.49)mmol/L，LDL(2.60±1.19)mmol/L，TG(2.23±2.15)mmol/L，無(wú)因各種原因而中途退出研究患者。經(jīng)MEBT/MEBO治療后，39例患者足部創(chuàng)面面積有不同程度縮小，僅1例患者無(wú)明顯變化，顯效14例(35.00%)，有效25例(62.50%)，無(wú)效1例(2.50%)。

表1 臨床創(chuàng)面療效評(píng)價(jià)表

2.2 治療前后ERK1/2和p38信號(hào)通路分子陽(yáng)性表達(dá)及免疫表達(dá)變化 治療前后信號(hào)通路分子全陽(yáng)性表達(dá)、免疫陽(yáng)性表達(dá)(任一指標(biāo))及免疫陽(yáng)性表達(dá)(具體指標(biāo))比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在創(chuàng)面信號(hào)通路分子表達(dá)陽(yáng)性率升高的同時(shí)，免疫因子陽(yáng)性表達(dá)率亦升高。見(jiàn)表2。

A:治療前；B：治療后IgA(+);C:治療后IgM(+);D：治療后IgG(+)；E:治療后C3c(+);F：治療后C4c(+)。

圖1 治療前后免疫因子的表達(dá)

A:治療前；B：治療后ERK1/2(+);C:治療后p38(+);D：治療后MAPKK6(+)；E:治療后c-myc(+);F：治療后Akt(+);G:治療后ATF2(+)。

圖2 治療前后信號(hào)分子的表達(dá)

2.3 免疫組化檢測(cè) 治療前創(chuàng)面組織可見(jiàn)免疫因子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c呈廣泛、彌漫分布。治療前創(chuàng)面組織可見(jiàn)信號(hào)分子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織信號(hào)通路分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2呈廣泛、彌漫分布。見(jiàn)圖1、2。

表2 創(chuàng)面信號(hào)通路分子與免疫表達(dá)變化

3 討 論

由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，糖尿病足是一種目前機(jī)制尚未完全闡明的糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥，同時(shí)臨床上也還沒(méi)有確切、有效的治療手段[6-8]。目前臨床上對(duì)糖尿病足的治療多采用在代謝控制的基礎(chǔ)上予改善循環(huán)、創(chuàng)面局部換藥等手段進(jìn)行綜合的治療，其中創(chuàng)面處理是糖尿病足治療的重要手段。在臨床中，可有多種方法對(duì)糖尿病足創(chuàng)面進(jìn)行處理，但長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明，傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥療法通過(guò)去腐生肌等作用機(jī)制，在促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合方面有其較為突出的治療效果。MEBO組方均為傳統(tǒng)中醫(yī)中藥，MEBT/MEBO由MEBO發(fā)展而來(lái)，其以MEBO為主要的治療藥物，中醫(yī)機(jī)制上采用MEBT為治則，簡(jiǎn)稱MEBT/MEBO，臨床上已經(jīng)有20余年的實(shí)踐歷史，被認(rèn)為是中醫(yī)藥外治治療潰瘍創(chuàng)面的較好方法之一[9]。目前有多項(xiàng)臨床研究表明，MEBT/MEBO對(duì)糖尿病足創(chuàng)面的治療亦有較好的臨床效果[10-11]，本研究結(jié)果顯示，采用MEBT/MEBO治療糖尿病足創(chuàng)面，創(chuàng)面面積明顯縮小，顯效率達(dá)35%，有效率達(dá)62.5%，再次證實(shí)了MEBT/MEBO對(duì)糖尿病足創(chuàng)面的較好療效。

作為MAPK類激酶，已有研究表明，ERK1/2和p38信號(hào)通路在傷口創(chuàng)面修復(fù)中起著較為關(guān)鍵的作用[3-4]，同時(shí)研究表明抑制p38及ERK1/2信號(hào)通路或者過(guò)度激活p38信號(hào)通路可以致使創(chuàng)面愈合時(shí)間延遲或?qū)е掠虾篑：坌纬蒣12-13]。還有研究表明，ERK1/2及p38可發(fā)生交互作用，致使c-myc、Akt及ATF2(下游重要目標(biāo)分子)被調(diào)控，進(jìn)一步對(duì)潰瘍創(chuàng)面愈合的生理過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用[14]。從免疫學(xué)機(jī)制上得知，免疫在維持機(jī)體健康和穩(wěn)定過(guò)程中發(fā)揮著重要的防御及保護(hù)作用，糖尿病足形成是一種機(jī)體健康組織受破壞的生理過(guò)程，在糖尿病患者足部受到外來(lái)感染等不良侵蝕時(shí)，機(jī)體可通過(guò)增強(qiáng)局部免疫，清除局部壞死腐敗組織，維護(hù)健康組織的穩(wěn)定，從而參與潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程。本研究顯示，經(jīng)MEBT/MEBO治療后，創(chuàng)面組織ERK1/2和p38信號(hào)通路關(guān)鍵分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2陽(yáng)性表達(dá)明顯升高，且與此同時(shí)，免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c的陽(yáng)性表達(dá)率亦明顯上升，表明MEBT/MEBO可能促進(jìn)了糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2和p38信號(hào)通路分子及免疫表達(dá)，ERK1/2和p38信號(hào)通路及其交互作用可能通過(guò)增加創(chuàng)面組織免疫表達(dá)而促進(jìn)了糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合。

受醫(yī)學(xué)倫理及科研條件所限，尚還無(wú)法建立空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究，ERK1/2和p38信號(hào)通路的研究還沒(méi)有足夠深入，研究缺陷擬在后續(xù)建立動(dòng)物模型研究中進(jìn)一步深入探討及完善。

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The relationship between ERK1/2 and p38 signaling pathway with the immune expression of diabetic based on MEBT/MEBO*

WuBiaoliang1，TangQianli2△，QinXiaojie3▲,FengLie4,WangMingdeng1,HEMingjie1,LvZhen5

(1.DepartmentofEndocrine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;2.DepartmentofSurgery,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;3.DepartmentofICU,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;4.DepartmentofEndocrine,theFirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guanzhou,Guangdong510632,China;5.DepartmentofSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate the regulation on extracellular signal regulated kinase(ERK)1/2 and p38 signaling pathways and immune expression by moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment(MEBT/MEBO)in diabetic foot and their relationship,to explore the repair mechanism of MEBT/MEBO on diabetic foot ulcers.Methods Totally 40 diabetic foot patients were treated by MEBT/MEBO,to take wound tissue before and after treatment and detect the expression of ERK1/2,p38,MAPKK6,c-myc,Akt,ATF2,IgA,IgM,IgG,C3c and C4c by immunohistochemistry,to investigate their relationship.Results After treatment with MEBT/MEBO,the area of foot wounds in 39 patients was reduced in different degree.Only one patient had no obvious change.14 patients(35.00%) were markedly effective,25 patients(62.50%) and 1 patient(2.50%) were ineffective.Before and after treatment, all positive expression, positive immunoreactivity(any index) and positive expression(specific index) of signal pathway molecules were statistically significant(P<0.05).While the positive rate of molecular expression in wound pathway increased,the positive expression rate of immune factor increased.Before treatment,a small amount of immune factors were found in the wound tissue.After treatment, the immune factors IgA,IgM,IgG,C3c,C4c were distributed widely and diffusely.Before treatment,the wound tissue showed a very small number of signal molecules.After treatment, the signal pathway molecules MEBT/MEBO and p38,MAPKK6,c-myc,Akt,ATF2 showed broad and diffuse distribution.Conclusion MEBT/MEBO may promote the expression of ERK1/2 and p38 signaling molecules and immune in diabetic foot,p38 and ERK1/2 signaling pathway may promote the healing of diabetic foot wound by increasing the expression of immune.

diabetic foot;burn skin regenerative medical technique;extracellular signal regulated kinase1/2;p38;immune

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.009

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360547)；2013年廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013GXNSFDA019020)。 作者簡(jiǎn)介：吳標(biāo)良(1978-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事內(nèi)分泌代謝性疾病研究?！?/p>

E-mail：htmgx@163.com?！ㄓ嵶髡?，E-mail：yyqinxj@163.com。

吳標(biāo)良1，唐乾利2△，覃曉潔3▲，馮 烈4，王民登1，何明杰1，呂 震5

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西百色 533000；4.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，廣州 510632；5.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科,南寧 530023)

R

A

1671-8348(2016)36-5069-03

2016-07-16

2016-10-03)