歐陽(yáng)劉健，魏昌瑛

（杭州第二中學(xué)高三611班（實(shí)驗(yàn)班），浙江 杭州 310053）

培養(yǎng)細(xì)胞體系中槐定堿抗EV71病毒的作用

歐陽(yáng)劉健，魏昌瑛△

（杭州第二中學(xué)高三611班（實(shí)驗(yàn)班），浙江 杭州 310053）

探究槐定堿抗EV71病毒的作用，為防治手足口病提供線索。在體外培養(yǎng)的Vero細(xì)胞體系中加入槐定堿，用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞毒性；在病毒感染的不同時(shí)期用槐定堿處理，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞病變等指標(biāo)，表征其對(duì)EV71病毒吸附、穿入的抑制作用及直接殺滅作用；用RT-PCR法檢測(cè)其對(duì)于病毒RNA復(fù)制的抑制作用。（1）槐定堿具有一定細(xì)胞毒性，其CC50為1.414mg/mL；（2）能夠抑制病毒對(duì)Vero細(xì)胞的感染，其IC50＝0.354mg/ mL；（3）其機(jī)制可能是抑制病毒的吸附和RNA復(fù)制，但對(duì)病毒穿入的抑制作用較弱?；倍▔A可抑制病毒吸附和病毒增殖，在病毒感染前后用藥效果都較好，且有效濃度遠(yuǎn)小于其CC50值，作為防治手足口病藥物的開發(fā)潛力較大。

Vero細(xì)胞，槐定堿，抑制，EV71病毒。

1 概述

手足口病 （Hand,foot and mouth disease，HFMD）是一種常見(jiàn)的病毒性傳染病，易感人群多為學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下發(fā)病率最高［1］。腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）可感染T淋巴細(xì)胞、人血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，觸發(fā)細(xì)胞凋亡［2～4］，引起持續(xù)高熱，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及并發(fā)癥［5］，致殘和死亡率較高［6］，是造成HMFD疾病的主要病原體［7］。因此引起全球廣泛關(guān)注。

EV71是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A組［8］。該病毒侵染細(xì)胞時(shí)，首先與細(xì)胞上的受體（CD55等）結(jié)合，吸附在細(xì)胞膜上并脫去蛋白質(zhì)衣殼，其RNA基因組進(jìn)入細(xì)胞，并立即進(jìn)行蛋白的翻譯加工，產(chǎn)生成為新的衣殼蛋白；同時(shí)在病毒RNA聚合酶的作用下生成負(fù)鏈RNA，再以負(fù)鏈RNA為模板生成新的正鏈RNA；在感染晚期組裝形成子代病毒，裂解細(xì)胞釋放出病毒顆粒［9］，并進(jìn)一步感染相鄰細(xì)胞。感染EV7l后1-2h，細(xì)胞自身的大分子合成迅速停止，染色質(zhì)邊緣化；感染3h后，胞質(zhì)空泡化，病毒蛋白質(zhì)合成開始；4h后質(zhì)膜通透性增大；6h后病毒在胞質(zhì)內(nèi)合成；10h后細(xì)胞裂解，病毒顆粒釋放。細(xì)胞裂解時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，稱致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。典型的細(xì)胞CPE表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮，分散，胞漿內(nèi)顆粒增加，折光性增強(qiáng)，直至細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落，細(xì)胞漂起。溫度、pH、宿主細(xì)胞、感染的多樣性等因素都會(huì)影響病毒的感染和復(fù)制。

目前，在抗EV71病毒藥物的研發(fā)聚焦于利用現(xiàn)有的抗病毒藥物、設(shè)計(jì)抗病毒藥物的衍生物和篩選新的抗病毒藥物等方面。Chem等發(fā)現(xiàn)吡唑啉［3,4-d］嘧啶類物質(zhì)在低濃度下對(duì)EV71有抑制作用［10］。Liu等發(fā)現(xiàn)I型干擾素可能對(duì)控制EV71感染起重要作用［11］。Sim等用針對(duì)EV71基因組的小干擾RNAr（siRNA）作用于病毒，可顯著減輕體外培養(yǎng)的EV71感染細(xì)胞病變［12］。Tan等發(fā)現(xiàn)一種化學(xué)合成的短發(fā)卡樣RNA（shRNA）可顯著抑制培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)EV71的復(fù)制［13］。但這些成果大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，能否應(yīng)用于臨床尚有待研究。

槐定堿（Sophoridine）是苦豆子、苦參的主要活性成分之一，可增強(qiáng)正常小鼠巨噬細(xì)胞功能，并促進(jìn)脾臟免疫細(xì)胞增殖［21］。在一定劑量范圍內(nèi)，槐定堿能劑量依賴性地抑制巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生TNF-α，這可能是其抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之一［14］。江西中醫(yī)藥大學(xué)李雪梅組獨(dú)立研制成功了抗癌新藥槐定堿及其制劑“鹽酸槐定堿注射液”，獲國(guó)家一類化學(xué)新藥證書和生產(chǎn)證書，獲江西省2007年度科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)（據(jù)江西中醫(yī)藥大學(xué)新聞，http://news.j xutcm.edu.cn/info/1002/14917.htm）。本研究以EV71敏感的Vero細(xì)胞為模型，研究槐定堿是否具有抗EV71病毒的作用，探討其臨床應(yīng)用的可行性，為尋找治療手足口病的新藥物提供線索。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

Vero細(xì)胞購(gòu)自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；EV71病毒株由邯鄲市疾病預(yù)防與控制中心惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；槐定堿購(gòu)自蘇州寶澤堂醫(yī)藥有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自Fermentas公司；TrizolReagent購(gòu)自Takara公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBA公司；EV71和18sPCR引物由上海捷瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見(jiàn)表1。

表1 所用EV71和18S引物序列

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)方法

取液氮凍存的Vero細(xì)胞管，置于42℃水浴中迅速解凍，低速離心后吸出上清液，用完全培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)基中加入1%青霉素和鏈霉素，10% FBS）吹起后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，在CO2濃度5%、37℃條件下培養(yǎng)12h，吸出原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次；加入等量新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)90%左右時(shí)，吸出原培養(yǎng)液，用D-Hanks緩沖液沖洗3次，加入2.5%胰蛋白酶-EDTA，37℃消化2min，輕輕吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，加入等量完全培養(yǎng)液終止消化，于800～1000rpm下離心5min；吸去上清液，加入5mL完全培養(yǎng)液，使細(xì)胞懸浮并充分分散，平均分裝到2-3個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至適量體積，在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞濃度＝四大格中的細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)/4。

2.2.2 EV71病毒的培養(yǎng)、檢測(cè)和TCID50測(cè)定

EV7l病毒株用無(wú)血清DMEM進(jìn)行10倍比梯度稀釋；接種于96孔板中的Vero細(xì)胞（5×103/孔）生長(zhǎng)至90%左右 （約10h）時(shí)，加入不同稀釋度的EV71病毒稀釋液50μL，每個(gè)梯度重復(fù)8孔，以未加病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)7d，期間連續(xù)觀察細(xì)胞病變，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞完全病變的孔數(shù)。按Behrens-Karber公式計(jì)算病毒滴度TCID50：logTCID50＝L-d（S-0.5），其中：L＝實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；D＝稀釋梯度的log值；S＝出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和。

當(dāng)CPE達(dá)75%以上時(shí)收取病毒裂解液，提取病毒RNA，用RT-PCR法檢測(cè)。反應(yīng)體積為20μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃變性20s，45℃退火25s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；后72℃延伸10min；目的片段預(yù)期長(zhǎng)度為226bp。以18sRNA作為內(nèi)標(biāo)，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 45s，30個(gè)循環(huán)；后 72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段。

◎23價(jià)疫苗：2歲以上有基礎(chǔ)疾病（比如艾滋，腎炎啥的免疫力低下）的兒童才打，正常的健康寶寶不要打，有報(bào)道正常兒童打過(guò)幾年后反而會(huì)對(duì)肺炎球菌的免疫有問(wèn)題。

2.2.3 槐定堿的細(xì)胞毒性檢測(cè)

接種Vero細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h，吸去原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度槐定堿（0.015、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）的維持培養(yǎng)液，以未加化合物組的培養(yǎng)細(xì)胞組為陰性對(duì)照，以DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照。每個(gè)濃度3復(fù)孔。各組均在37℃、5%CO2條件下孵育48h后，去除培養(yǎng)液，加入DMSO150μL，輕輕震蕩以溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光度值（A490），計(jì)算細(xì)胞存活率（%）。

2.2.4 槐定堿在不同侵染時(shí)期的抗病毒作用

接種Vero細(xì)胞于96孔板（1×105個(gè)/mL，每孔100μl）中，培養(yǎng)24h后分為6組。組Ⅰ：加入病毒，同時(shí)加入槐定堿（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL）。并據(jù)本組數(shù)據(jù)計(jì)算槐定堿對(duì)于EV71病毒的半抑制濃度（IC50）；組Ⅱ：將病毒與槐定堿混合后于37℃作用2h，隨后重懸病毒加入96孔板中；組Ⅲ：加入病毒并吸附2h后，吸去病毒液并加入槐定堿；組Ⅳ：用槐定堿預(yù)處理細(xì)胞2h后，加入病毒；組Ⅴ：空白對(duì)照組（不做任何添加）；組Ⅵ：陰性對(duì)照組（加入病毒，不加藥物處理）。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后吸盡培養(yǎng)液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μl，37℃下繼續(xù)孵育4h，小心去除培養(yǎng)液，參照2.2.3測(cè)定其A490，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）。除組Ⅰ外各組的毒量均按IC50加入，每濃度重復(fù)3孔。

2.2.5 槐定堿對(duì)病毒吸附、穿入及RNA復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)

參照2.2.4的方法細(xì)胞培養(yǎng)24h后分為三組：組Ⅶ：置于4℃預(yù)冷1h，加入EV71病毒，隨即加入含有槐定堿（濃度同2.2.4）的維持培養(yǎng)液，4℃靜置孵育3h，棄去全部培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入完全培養(yǎng)液；組Ⅷ：將96孔板在4℃預(yù)冷1h并加入病毒，繼續(xù)靜置3h，隨即加入含有不同濃度槐定堿（濃度同2.2.3）的維持培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)，使病毒最大限度穿入細(xì)胞。每10min為間隔，以pH11的PBS沖洗細(xì)胞以終止病毒穿入，隨后立即加入pH3的PBS沖洗細(xì)胞以中和堿性PBS，加入完全培養(yǎng)液；組Ⅸ：處理與2.2.4中組Ⅳ相同?？瞻讓?duì)照和陰性對(duì)照組與2.3.4相同。各組均繼續(xù)培養(yǎng)48h，第Ⅶ、Ⅷ兩組參照2.2.3用MTT法測(cè)定A490，計(jì)算細(xì)胞存活率；第Ⅸ組用RT-PCR法半定量檢測(cè)EV71病毒RNA（參照2.2.2），每個(gè)濃度重復(fù)3孔。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用GraphpadPrism5.0軟件處理。并用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和誤差分析。

3 結(jié)果與分析

正常Vero細(xì)胞的形態(tài)如圖1（A）所示，EV71病毒感染引發(fā)的細(xì)胞CPE反應(yīng)如圖1（B）所示，病毒基因組RT-PCR結(jié)果如圖1（C）所示。被病毒感染的細(xì)胞表現(xiàn)為圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加、折光性增強(qiáng)、從培養(yǎng)板上脫落漂起等征狀。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了EV71病毒特有的226bp條帶。用Behrens-Karber法計(jì)算出該病毒株的 TCID50值為 1×10-4.25/100μL，即病毒液稀釋104.25倍后，每孔添加100μl可引起50%的細(xì)胞產(chǎn)生CPE反應(yīng)。即病毒滴度為1×105.25TCID50/mL，在此滴度下Vero細(xì)胞被病毒感染48h后可完全漂浮。

圖1 EV71病毒導(dǎo)致的Vero細(xì)胞CPE反應(yīng)（40×）及病毒基因組檢測(cè)結(jié)果

3.2 槐定堿對(duì)于Vero細(xì)胞的毒性

由圖2可見(jiàn)：細(xì)胞存活率隨著槐定堿濃度的增加逐漸降低，說(shuō)明槐定堿具有一定的細(xì)胞毒性。濃度低于31.25μg/mL時(shí)，對(duì)Vero細(xì)胞損傷較小（～10%）；濃度達(dá)到2mg/mL時(shí)仍有約10%細(xì)胞存活。計(jì)算出槐定堿對(duì)于Vero細(xì)胞的CC50為1.414mg/mL。

圖2 槐定堿對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用（N=3）

3.3 槐定堿不同處理對(duì)EV71病毒的抑制作用

槐定堿對(duì)EV71病毒感染后細(xì)胞CPE反應(yīng)的抑制作用參如圖3（A～C）所示。在感染的不同時(shí)期給藥（第Ⅰ～Ⅳ組）對(duì)病毒抑制（對(duì)細(xì)胞保護(hù)）的檢測(cè)結(jié)果參如圖3（D～G）所示（N＝3）。

圖3 槐定堿不同處理對(duì)EV71病毒的作用

3.4 槐定堿對(duì)EV71病毒吸附、穿入和復(fù)制的抑制作用

病毒危害細(xì)胞的過(guò)程大致可以分為吸附、穿入和復(fù)制。圖4-A（組Ⅶ）顯示：31.25μg/mL的槐定堿對(duì)于病毒吸附即具有較好的抑制作用（p＜0.001），且抑制作用與濃度正相關(guān)。圖4-B（組Ⅷ）顯示槐定堿對(duì)病毒穿入的抑制作用較弱。圖4-B（組Ⅸ）顯示：較低濃度槐定堿（62.5μg/mL）對(duì)于病毒RNA復(fù)制即具有明顯的抑制作用，其抑制作用與濃度正相關(guān)。

圖4 槐定堿對(duì)EV71病毒吸附、穿入和復(fù)制的抑制作用

4 討論與結(jié)論

Vero細(xì)胞是非洲綠猴腎細(xì)胞，對(duì)EV71病毒感染較為敏感，以成為病毒學(xué)研究的常用細(xì)胞體系。我們選用體外培養(yǎng)的Vero細(xì)胞體系，探究了槐定堿抗EV71病毒的作用，并對(duì)其抗EV71病毒的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。盡管培養(yǎng)細(xì)胞體系中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床還有相當(dāng)距離，但也為該藥物的臨床應(yīng)用提供了有益的線索。

中藥及其提取物的抗EV71病毒已有許多相關(guān)研究，見(jiàn)表2。本研究發(fā)現(xiàn)：槐定堿可有效抑制EV71病毒對(duì) Vero細(xì)胞的感染，其 IC50值為0.35mg/mL，該值優(yōu)于丹參提取液的IC50值。而槐定堿對(duì)于 Vero細(xì)胞的半致死濃度 （CC50值）為1.346mg/mL，遠(yuǎn)高于IC50值，說(shuō)明該藥物細(xì)胞毒性較低，而安全性較高。

表2 部分抗EV71病毒藥物的IC50值

EV71病毒感染細(xì)胞大致包括病毒吸附、脫衣殼、病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞（穿入）、病毒RNA復(fù)制、衣殼蛋白合成和病毒組裝等關(guān)鍵步驟。這些關(guān)鍵的步驟都可成為抗病毒化合物研究的作用靶點(diǎn)［22］。本研究主要就病毒吸附、穿入及復(fù)制三個(gè)方面初步探究了槐定堿抑制EV71病毒對(duì)Vero細(xì)胞感染的機(jī)制。結(jié)果表明：低濃度（31.25μg/mL）的槐定堿即可抑制EV71病毒的吸附，而較高濃度（62.5μg/mL以上）的槐定堿還可以抑制病毒RNA的復(fù)制。劉曉玲等的研究表明：槐定堿等苦參系列生物堿可有效抑制柯薩奇B3病毒(CVB3)所致的Vero細(xì)胞和大鼠原代心肌細(xì)胞病變抑制作用、病毒繁殖抑制反應(yīng)［23］。我們的結(jié)果與劉曉玲等的研究結(jié)果能夠相互印證。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)可得出如下結(jié)論：在體外，槐定堿在病毒感染早期具有較好的抗病毒作用，在感染后期對(duì)EV71的復(fù)制也具有較強(qiáng)的抑制作用。說(shuō)明該化合物可能具有一定的預(yù)防和治療作用，作為抗EV71病毒藥物的開發(fā)潛力較大。

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：魏昌瑛，男，指導(dǎo)老師。Email:512667205@qq.com.