趙麗蒙 陸秀君 張麗杰 方詩雯

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽，110866)

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衛(wèi)矛莖段組織培養(yǎng)中消毒方法及不定芽誘導(dǎo)1)

趙麗蒙 陸秀君 張麗杰 方詩雯

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽，110866)

以衛(wèi)矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)莖段為外植體，通過在4—9月不同時間取材，并采用升汞和次氯酸鈉不同處理時間、升汞結(jié)合吐溫、紫外線照射等消毒方法，篩選外植體最佳取材時間和最佳消毒方法；同時，研究了不同質(zhì)量濃度的激素和瓊脂對不定芽誘導(dǎo)的影響，并采用L9(34)正交試驗設(shè)計，探討MS、B5、White不同培養(yǎng)基和不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、GA3對不定芽增殖的影響，篩選出不定芽誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：5月中旬為莖段的最佳取材時間；HgCl28 min并加入兩滴吐溫-20為消毒的最佳方法；MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+瓊脂7.0 g/L是衛(wèi)矛莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率高達(dá)70.67%；在正交試驗的9個處理中，以MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L的增殖系數(shù)最高為19.25，通過極差分析得出MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L是衛(wèi)矛不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為23.51。

衛(wèi)矛；莖段；取材時間；組織培養(yǎng)；不定芽誘導(dǎo)

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：21-25,63.

We used theEuonymusalatusstem segment as explants to study the effects of different sampling time on the disinfection of explants between 4 to 9 months, and the effects of different disinfection methods on the disinfection of stem segment, including mercuric chloride and sodium hypochlorite different processing time. We also studied the effect of hormone and agar in different concentrations on adventitious bud induction. Through L9(34) orthogonal test, we studied the effect of the MS, B5, White, and different concentration of 6-BA, NAA and GA3on the adventitious buds proliferation, and we finally chose out the optimum culture medium for adventitious bud induction and proliferation. Mid-May is the best sampling time ofEuonymusstem segments; mercuric chloride combined with two drops of tween-20 for 8 min is the best method forEuonymusstem segments sterilization; MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+agar 7.0 g/L is the best culture medium forEuonymusstem segments of adventitious bud induction, adventitious bud induction rate reaches 70.67%; Among nine procedures in orthogonal test, the proliferation coefficient is the highest (19.25) in the first processing. MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L is the optimum culture medium for adventitious bud proliferation inEuonymuswith the proliferation coefficient of 23.51.

衛(wèi)矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)是衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(EuonymusL.)落葉灌木，又名鬼箭羽、見腫消、千層皮等。其株形密集，秋葉紫紅色，假種皮橘紅色，極具觀賞價值，為重要的野生觀葉觀果的灌叢。同時，衛(wèi)矛根、皮均可入藥，具有破血、殺蟲、通經(jīng)、散疲止痛等功效和調(diào)血脂、降血糖、延緩動脈粥樣硬化等作用，近年來我國臨床上用于治療糖尿病已取得顯著效果[1]，衛(wèi)矛在韓國和日本也多用于對抗腫瘤[2-3]，具有很好的藥用價值。現(xiàn)如今衛(wèi)矛已在歐洲普遍栽培，中國雖然除新疆、青海、西藏、廣東及海南以外，各地均有分布，但是種植卻不普遍，還有待開發(fā)培育。

由于衛(wèi)矛種子具有假種皮，種子內(nèi)含油量高，休眠期長[4]，生產(chǎn)中獲得衛(wèi)矛實生苗難度大。而傳統(tǒng)的扦插、嫁接等無性繁殖技術(shù)，繁殖系數(shù)低、速度慢、品質(zhì)易退化、且操作比較困難等，無法規(guī)?；a(chǎn)以滿足市場的需求。植物組織培養(yǎng)技術(shù)，卻能很好的解決這一難題?，F(xiàn)已有學(xué)者對衛(wèi)矛科部分植物進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，如陜西衛(wèi)矛[5]、金葉衛(wèi)矛[6]、火焰衛(wèi)矛[7]、爬行衛(wèi)矛[8]、膠東衛(wèi)矛[9]等。然而至今為止并沒有學(xué)者對衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，因而衛(wèi)矛組織培養(yǎng)技術(shù)還有待開發(fā)。在組織培養(yǎng)中不定芽誘導(dǎo)途徑具有很高的繁殖系數(shù)。本試驗便以衛(wèi)矛莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽，再通過不定芽增殖獲得叢生芽，以期為衛(wèi)矛快繁體系建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

衛(wèi)矛莖段外植體取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)后山自然生長狀態(tài)下的野生實生苗。2015年4—9月中旬，選取某一個晴天，在14:00左右，在2～3年生長勢良好的植株上選取具有3～5個節(jié)間并且長勢良好的當(dāng)年生枝條若干，置于自封袋內(nèi)帶回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將枝條剪去葉片，并剪成2 cm的帶芽莖段，放在流水下沖洗10 min，以去除表面臟物；再用1 g/L的洗衣粉水浸泡30 min，同時用毛筆不斷刷洗莖段的腋芽處，進(jìn)行深層清理；流水再沖洗2 h；用干凈濾紙吸干水分，移至超凈工作臺備用。在超凈工作臺內(nèi)，用75%酒精表面消毒30 s，無菌水洗3次，之后使用HgCl2等消毒液消毒，無菌水沖洗5次備用。

1.2.2 外植體最佳取材時間

分別于4—9月的中旬選取外植體，使用同樣的消毒方法進(jìn)行消毒(0.1% HgCl25 min)。將消毒后的莖段切去材料與藥液接觸的傷口后，接種于MS空白培養(yǎng)基中，其中添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH為5.8。培養(yǎng)室溫度(24±1)℃，空氣相對濕度50%～60%，光照時間16 h/d，光照強度2 000～3 000 lx。每處理20個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后，統(tǒng)計污染數(shù)、死亡數(shù)、存活數(shù)，進(jìn)而計算外植體污染率、死亡率、存活率。

1.2.3 外植體適宜消毒方法

對8月份采集的外植體進(jìn)行預(yù)處理后，用75%酒精表面消毒30 s，無菌水洗3次后采用7種不同消毒方法進(jìn)行消毒。1)0.1% HgCl26 min；2)0.1% HgCl27 min；3)0.1% HgCl28 min；4)1% NaClO 20 min；5)1% NaClO 30 min；6)使用加入的0.1% HgCl2+吐溫-20(每50 mL HgCl2中加入1滴吐溫)消毒8 min；7)將外植體用紫外線直射10 min，然后使用0.1% HgCl2消毒6 min。進(jìn)行完以上消毒后，再用無菌水沖洗5次。將得到的外植體接種在添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L的MS空白培養(yǎng)基上，每處理20個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后，統(tǒng)計污染數(shù)、死亡數(shù)、存活數(shù)，進(jìn)而計算外植體污染率、死亡率、存活率。

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將獲得的無菌外植體轉(zhuǎn)接到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+瓊脂6.5 g/L；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+瓊脂7.0 g/L；MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+瓊脂6.5 g/L；MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+瓊脂7.0 g/L，每種培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L。每處理20個外植體，重復(fù)3次。觀察不定芽誘導(dǎo)情況，培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計不定芽發(fā)生的外植體總數(shù)和芽數(shù)。

1.2.5 不定芽增殖培養(yǎng)基篩選

選用L9(34)正交表選取3種基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、GA34個因子，每個因子3個水平(見表1)。

將誘導(dǎo)出的不定芽分離成單個小芽，接種在不同的培養(yǎng)基中，每處理20個外植體，重復(fù)3次。觀察不定芽增殖情況，培養(yǎng)60 d時，統(tǒng)計芽數(shù)、芽長。

表1 不定芽增殖培養(yǎng)基篩選的正交試驗設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)分析

污染率=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

死亡率=(死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種的外植總體數(shù))×100%。

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植總體數(shù))×100%。

增殖系數(shù)=不定芽總數(shù)/起始芽數(shù)。

使用Excel 2003對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和統(tǒng)計，使用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時間對外植體消毒的影響

以不同取材時間的衛(wèi)矛莖段為外植體，采用同樣的消毒方法，接種在MS空白培養(yǎng)基中，其消毒效果會因取材時間的不同而不同(表2)。

表2 不同取材時間對外植體消毒的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同大寫字母表示在0.01水平差異極顯著，同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

從4月中旬到9月中旬，隨著取材月份的增加，外植體染菌率逐漸上升，由4月的0.33%到9月的99.67%，而死亡率卻逐漸下降，由35.33%到0.33%。但是存活率在5月中旬是最高的達(dá)76.67%，而4月中旬存活率僅達(dá)64.33%，而5月中旬時其染菌率也很低(3.00%)，此時外植體抵抗滅菌劑傷害的能力也逐漸增強，死亡率相對于4月中旬有所降低。之后的6、7月份正值夏季多雨，微生物較多，染菌率較高，達(dá)30%左右，存活率在50%左右。而8、9月份，染菌率接近100%，可見外植體在自然狀態(tài)下暴露的時間越長，其上的微生物越多，其滅菌的難度越高，但同時其抵抗滅菌劑傷害的能力也很強。因此根據(jù)染菌率和死亡率這兩方面的整體情況，可以得出5月中旬是外植體取材進(jìn)行消毒處理的最佳時期。

2.2 消毒方法對外植體消毒的影響

消毒方法、消毒劑和消毒時間不同，其外植體的染菌率、存活率也不同(表3)。

表3 不同消毒方法對外植體的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同大寫字母表示在0.01水平差異極顯著，同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

次氯酸鈉的消毒效果次于HgCl2，使用1% NaClO消毒20、30 min對外植體滅菌效果毫無影響，染菌率都為100%。而使用0.1% HgCl26 min，染菌率就有顯著的降低(50.33%)。然而當(dāng)HgCl27、8 min時，染菌率并未有多大改善，然而隨著HgCl2消毒時間的加長，外植體的死亡率也在逐漸增加(6.33%、14.67%、17.67%)。這主要是因為過長的消毒時間會對外植體造成傷害，因此在考慮降低污染率的同時，也應(yīng)該考慮到由滅菌劑所造成的死亡率。而從外植體存活率指標(biāo)來看，單獨使用HgCl26 min時，存活率達(dá)43.33%，并不理想。為了更好的控制染菌率，本試驗采用了紫外線直射外植體10 min后，再用HgCl26 min，這種辦法確實有效的降低了染菌率(15.33%)，但其死亡率卻大大的增加了(66.67%)，存活率也僅有18.00%，可見紫外線對外植體的傷害非常大。HgCl2加2滴吐溫8 min的染菌率(17.67%)與單獨使用HgCl28 min的染菌率(44.67%)相比降低了一半多，這是因為吐溫作為表面活性劑，可以使HgCl2和外植體表面接觸的更充分，加快消毒進(jìn)程，消毒效果較好，從而使外植體的存活率達(dá)到了峰值59.67%，因此HgCl2與2滴吐溫一同作用消毒8 min為外植體消毒的最佳方法。

2.3 衛(wèi)矛莖段不定芽誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA對獲得的無菌莖段進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，結(jié)果見表4。

表4 不同培養(yǎng)基對衛(wèi)矛莖段不定芽誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同大寫字母表示在0.01水平差異極顯著，同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

在對不定芽誘導(dǎo)時觀察到，莖段外植體在培養(yǎng)10 d左右時莖段中部開始發(fā)育出淺綠近透明狀的愈傷組織(圖1，a)，之后愈傷顏色逐漸加深(圖1，b)，在培養(yǎng)了40 d左右外植體的褐色愈傷中開始長出不定芽(圖1，c)。試驗結(jié)果表明，在添加了6-BA2.0 mg/L和NAA0.05 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體的不定芽的誘導(dǎo)率(62.33%、70.67%)和平均芽數(shù)(4.87、5.60)均高于添加了6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素與生長素的比越高越有利于不定芽誘導(dǎo)。在1和3處理中，所獲得的不定芽均為淺綠色(圖1，d)，在2和4處理中所獲得的不定芽深綠色且長勢較好，這是因為2、4處理中瓊脂濃度為7.0 g/L，1、3處理中瓊脂濃度為6.5 g/L，瓊脂質(zhì)量濃度較高時，可束縛住水分，減少外植體對水分的吸收，使葉綠素濃度有所提高，顏色深綠，長勢較好。因此，MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+瓊脂7.0 g/L是衛(wèi)矛莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率達(dá)70.67%，平均芽數(shù)達(dá)5.60個(圖1，e)。

2.4 衛(wèi)矛莖段不定芽增殖

將誘導(dǎo)出的不定芽分離成單一的小芽，接種在增殖培養(yǎng)基中，每個處理使用了不同的培養(yǎng)基類型，并添加了不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、GA3。9組試驗的增殖系數(shù)分別為19.25、14.50、13.00、2.75、10.50、8.75、1.00、1.10、1.00。培養(yǎng)基類型和不同質(zhì)量濃度的激素對不定芽增殖均有很大影響，試驗結(jié)果極差分析見表5。

a.培養(yǎng)10 d愈傷淺綠色;b.培養(yǎng)20 d愈傷黃褐色;c.培養(yǎng)40 d后不定芽;d.瓊脂6.5 g/L時不定芽淺綠色;e.最佳處理方法不定芽平均為5.6個。

極差A(yù)(培養(yǎng)基類型)B(6-BA)C(NAA)D(GA3)K146．7523．0029．1030．75K222．0026．1018．2524．25K33．1022．7524．5016．85k115．587．679．7010．25k27．338．706．088．08k31．037．588．175．62R14．551．123．624．63

注：K1、K2、K3對應(yīng)的數(shù)值分別代表每個因素各個水平下的增殖系數(shù)的總和；k1、k2、k3對應(yīng)的數(shù)值分別代表每個因素各個水平下的增殖系數(shù)的平均值；R為極差，即每因素下的平均極大值與平均極小值的差。

從表5可知，基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA和GA3這4種因素均對增殖系數(shù)有影響，由R值(因素內(nèi)水平極差)大小可以看出各因素對試驗結(jié)果的影響程度。這4因素對衛(wèi)矛不定芽增殖系數(shù)的影響由主到次依次為A、D、C、B，即基本培養(yǎng)基、GA3、NAA、6-BA。在以上9個處理中，以含高無機鹽成分的MS為基本培養(yǎng)基的3個處理中的不定芽增殖系數(shù)分別為19.25、14.50、13.00(圖2A，B，C)，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種，且長勢良好，均為深綠色芽；而以含低無機鹽成分的White為基本培養(yǎng)基的3個處理中的芽數(shù)幾乎相同，且不定芽長勢較弱，為淺黃綠色(圖2D)。較低質(zhì)量濃度的生長素有利于誘導(dǎo)不定芽增殖，而細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度過高或過低都會對增殖有抑制作用，由正交數(shù)據(jù)分析中也得出NAA為0.05 mg/L、6-BA為1.0 mg/L時的增殖系數(shù)較高。在GA3的3個水平當(dāng)中，隨著GA3的質(zhì)量濃度的增大，增殖系數(shù)卻逐漸在減小(8.08、5.62、4.63)，可見赤霉素對不定芽增殖有一定的抑制作用，因而由正交表分析出最優(yōu)組合為A1B2C1D1，即MS+NAA0.05 mg/L+6-BA1.0 mg/L。在對正交試驗結(jié)果驗證時所獲得結(jié)果與正交分析結(jié)果一致，在這個培養(yǎng)基上獲得的增殖系數(shù)高達(dá)23.51(圖2E)，因而MS+NAA0.05 mg/L+6-BA1.0 mg/L為衛(wèi)矛不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)取材季節(jié)和時間不同對滅菌效果的影響很大。春季空氣干燥，陽光充足，不利于微生物滋生，外植體消毒效果較好，夏季雖然光照充足但降雨量多，微生物伴著雨水附著在外植體表面，滅菌困難，而秋季氣溫高、濕度大，更利于微生物滋生和蔓延，較難滅菌[10]。同時外植體在自然狀態(tài)下暴露時間越長，外植體表面附著的微生物越多，染菌率越高。吳群英等[11]在以青錢柳(Cyclocaryapaliurus.)嫩枝莖段為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時，發(fā)現(xiàn)莖段外植體宜在春季取材，5月份為最佳的取材時期[12]。紫外線能夠穿透微生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞核并且破壞DNA，使其失去復(fù)制能力或活性[13]，因而紫外燈照射能抑制附著在衛(wèi)矛莖段表面真菌、細(xì)菌的快速繁殖，具有很好的滅菌效果，但其同時對植物的危害也不容小覷，紫外線照射在降低滅菌率的同時也提高了死亡率，因而不易用于外植體消毒。吐溫作為表面活性劑，可使滅菌更徹底，染菌率低，成活率高。在紅腺忍冬(Lonicerahypoglauca)[14]和錐栗(Castaneahenryi)[15]的消毒過程中得出吐溫和HgCl2結(jié)合為外植體消毒的最佳方法。與本研究得出吐溫-20和HgCl2的結(jié)合使用可大大降低染菌率這一結(jié)果相似。

A.處理1，MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+GA30 mg/L;B.處理2，MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+GA31.0 mg/L;C.處理3，MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+GA32.0 mg/L;D.處理9中不定芽的生長狀況;E.正交最優(yōu)組合中叢生芽生長狀況。

圖2 培養(yǎng)60d后不定芽增殖情況

植物組織培養(yǎng)中，不定芽誘導(dǎo)最常用的細(xì)胞分裂素和生長素是6-BA和NAA[16]。本研究發(fā)現(xiàn)激素質(zhì)量濃度配比較高時，不定芽誘導(dǎo)率也較高，不定芽數(shù)也較高。這表明高細(xì)胞分裂素低生長素有利于不定芽的形成。張娜[17]在文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)不定芽研究中也得出類似結(jié)論，6-BA與NAA質(zhì)量濃度比值為20∶1時的誘導(dǎo)率高于質(zhì)量濃度的10∶1，隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，激素配比降低，不定芽誘導(dǎo)率和每個外植體產(chǎn)生的芽數(shù)也呈下降趨勢。

本研究還發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基類型對不定芽增殖的影響最大，其影響程度：MS>B5>White，這是由于每種基本培養(yǎng)基的含鹽成分及質(zhì)量濃度不一樣，對于衛(wèi)矛來說，最喜含鉀鹽、銨鹽、硝酸鹽質(zhì)量濃度較高的MS培養(yǎng)基；而僅硝酸鹽含量較高的B5培養(yǎng)基則不能夠提供衛(wèi)矛所需要的一些基本營養(yǎng)；各類無機鹽含量均較低的White培養(yǎng)基更加不能提供衛(wèi)矛所需的營養(yǎng)成分，長勢很差。張倩等[18]在對薄荷(Menthahaplocalyx)莖段誘導(dǎo)時也發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果優(yōu)于B5培養(yǎng)基。由此可見，培養(yǎng)基中無機鹽種類及濃度是組織培養(yǎng)中最關(guān)鍵的因素。赤霉素對不定芽增殖的影響僅次于培養(yǎng)基類型，雖然GA3具有促進(jìn)植物莖葉生長的作用，但它對不定芽的增殖卻有一定的抑制作用，由于赤霉素作用在外植體生長時，促進(jìn)細(xì)胞縱向分化，抑制了細(xì)胞橫向分化，因而抑制了不定芽的形成。在本研究中6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L為不定芽增殖的最佳的激素配比。因為在增殖過程中，若6-BA質(zhì)量濃度過高則會對不定芽增殖有一定的抑制作用，如若不添加NAA，則會導(dǎo)致芽體弱小，葉片黃花[19]，N.AhamedSherif等[20]在金線蓮(AnoectochiluselatusLindley)的研究中也認(rèn)為細(xì)胞分裂素與低質(zhì)量濃度的生長素結(jié)合對增殖的效果是最好的。

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Adventitious Bud Induction in Tissue Culture from Stem Segment ofEuonymusalatus(Thunb.) Sieb

Zhao Limeng, Lu Xiujun, Zhang Lijie, Fang Shiwen

(Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, P. R. China)

Euonymusalatus; Stem segment; Sampling time; Tissue culture; Adventitious bud induction

趙麗蒙，女，1993年5月生，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:1076222612@qq.com。

陸秀君，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:lxjsyau@126.com。

2016年5月24日。

S715.3

1)遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(2014207005、2011207003)。

責(zé)任編輯：潘 華。