郭志欣 朱俊義 顧地周 孫弋博 崔悅 宋慧

(通化師范學(xué)院，通化，1340022)(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

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五味子藥渣多糖的提取及其免疫活性1)

郭志欣 朱俊義 顧地周 孫弋博 崔悅 宋慧

(通化師范學(xué)院，通化，1340022)(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

提取并純化得到五味子藥渣多糖，對(duì)其體外免疫活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。經(jīng)水提醇沉、乙醇分級(jí)、活性碳脫色、Sevage法和鏈蛋白酶聯(lián)合脫蛋白，從五味子藥渣中獲得cSDP、fSDP和SDP 3種多糖。通過(guò)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證3種多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明：3種五味子藥渣多糖在一定質(zhì)量濃度下對(duì)未經(jīng)活化的小鼠淋巴細(xì)胞有增殖作用,對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用；多糖的純化程度越高對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用越強(qiáng)；五味子藥渣粗多糖中的蛋白對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。

五味子；藥渣；多糖；純化；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：80-82.

We extracted and purified the polysaccharides from dregs ofSchisandrachinensis(Turcz.) Bailey to discuss the effects of polysaccharides on lympgocyte transformation of mice spleen lymphocyte. The polysaccharides (cSDP, fSDP and SDP) were extracted and isolated from dregs ofS.chinensisby alcohol precipitation method, decoloration and deproteinization. We studied the lymphocyte transformation in vitro of the three kinds of polysaccharides. The three kinds of polysaccharides had effects under a certain concentration and significant promotion effects on the lymphocyte proliferation of mice spleen activated by ConA. Polysaccharides with high purification degree could promote the proliferation of mice spleen lymphocyte. The protein in the crude polysaccharides from dregs ofS.chinensishad no effects on the proliferation of mice spleen lymphocyte.

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Bailey)是五味子科，五味子屬多年生藤本植物。果實(shí)入藥，主治咳喘、自汗、盜汗、遺精、久瀉、神經(jīng)衰弱、健忘失眠等癥[1]。目前，制藥企業(yè)主要通過(guò)回流方式獲得其脂溶性成分入藥，剩余藥渣被焚燒或丟棄，這既對(duì)環(huán)境造成了污染，又是一種資源浪費(fèi)[2]，實(shí)際上被廢棄的藥渣中還存在多糖等多種活性成分[3]。近幾十年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，多糖及糖復(fù)合物在生物體中不僅是作為結(jié)構(gòu)和能源物質(zhì)，更重要的是與細(xì)胞的生命活動(dòng)和多種多樣的生物學(xué)功能密切相關(guān)。多糖類物質(zhì)是許多中草藥的主要免疫活性物質(zhì),具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等多種功能，其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，逐漸被用于多糖類保健食品的開發(fā)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，五味子多糖不僅具有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗氧化等多種生物學(xué)活性[4-5]，還具有預(yù)防和治療癌癥的潛在價(jià)值[6-7]。若將五味子藥渣中多糖充分利用[8]，既可以避免環(huán)境污染，又會(huì)帶來(lái)較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文研究了五味子藥渣多糖cSDP，fSDP和SDP在體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，確定五味子藥渣多糖的質(zhì)量濃度、純化程度以及粗多糖中的蛋白在體外對(duì)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響，為五味子藥渣多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，及相關(guān)藥品及保健食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

五味子藥渣為護(hù)肝片生產(chǎn)后五味子殘?jiān)?，由修正藥業(yè)提供；試驗(yàn)所用小白鼠購(gòu)于吉林長(zhǎng)春高新開發(fā)區(qū)；試劑RPMII 1640培養(yǎng)液、ConA(刀豆素A)為Sigma公司產(chǎn)品，二甲基亞砜為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，其余試劑均為分析純；6010型紫外分光光度計(jì)，754可見光分光光度計(jì)，CO2培養(yǎng)箱，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀等。

1.1 五味子藥渣多糖的提取和純化

粗多糖的提?。喝∥逦蹲铀幵? 000 g，加入30 L水，100 ℃提取2 h，收集3次提取液進(jìn)行過(guò)濾，濾液濃縮后加入0.1%的活性炭脫色，再加入3倍體積95%乙醇，4 ℃過(guò)夜，離心取沉淀，常規(guī)干燥，即得五味子藥渣水溶性粗多糖cSDP。

凍融：將5%粗多糖溶液冷凍過(guò)夜(-20 ℃)，室溫融化，離心20 min(8 000 r/min，4 ℃)，除去少量沉淀。該過(guò)程重復(fù)數(shù)次，直至無(wú)沉淀為止。

乙醇分級(jí)：將凍融后的粗多糖溶液加無(wú)水乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)30%，4 ℃過(guò)夜后離心，常規(guī)干燥后獲得多糖fSDP。

脫蛋白：采用鏈蛋白酶和Sevag法聯(lián)合脫蛋白[9-10]。將fSDP配制為5%的糖溶液，糖液中加入鏈蛋白酶(m酶∶m蛋白=1∶200)，加入二甲苯防腐，37 ℃，保溫24 h，糖液總體積1/4加入Sevag試劑，搖床振蕩2 h后離心，取上清重復(fù)操作，直至無(wú)游離蛋白為止，常規(guī)干燥即得五味子藥渣純化多糖SDP。

1.2 五味子藥渣多糖量的測(cè)定

采用苯酚—硫酸法[11]測(cè)糖量。將0.1 g/L的糖溶液、6%的苯酚溶液、濃H2SO4按體積比1.0∶0.5∶2.5依次加入試管，振蕩，靜止，冷卻，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即得糖量。

1.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

采用MTT法[12-16]，將小鼠用頸椎脫臼法處死，用75%的酒精浸泡消毒(約15 min)，無(wú)菌條件下解剖小鼠。沿腹腔中線剪開小鼠胸腔，取出脾，用剪刀剔除結(jié)締組織和脂肪后將其剪碎，加入3 mL 1640培養(yǎng)液,用勻漿器研磨脾組織，制成脾細(xì)胞液。將脾細(xì)胞液置于盛有Hanks液的平皿內(nèi)，用紗布過(guò)濾，吸取Hanks液沖洗紗布。將懸液離心(1 500 r/min，5 min)，用0.01 mol/L Tris-NH4Cl低滲裂解紅細(xì)胞1 min后，棄上清液，用Hanks液洗滌細(xì)胞2次。

取待測(cè)的細(xì)胞懸液0.1 mL，與Hanks液及0.4%的臺(tái)盼藍(lán)0.1 mL均勻混合，2～5 min后滴入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，于顯微鏡下按照白細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察并計(jì)數(shù)。

用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成一定濃度，制成單細(xì)胞懸液。將懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL。96孔板中分別加入3種不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，將培養(yǎng)板放入含有5% CO2的培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)48～72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4～6 h時(shí)，向培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入1 g/L MTT液，10 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)6 h。然后向各孔內(nèi)加入酸性異丙醇110 μL，30 min內(nèi)用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)OD值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖性質(zhì)分析

按1.1和1.2中方法對(duì)五味子藥渣粗多糖進(jìn)行提取后，通過(guò)凍融、乙醇分級(jí)、脫蛋白和含量測(cè)定等步驟后獲得粗多糖cSDP，提取的cSDP為淺棕色粉末，易溶于水，收率為3.56%，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.39%。純化多糖SDP為淺黃色粉末，易溶于水，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.2%。

2.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

由表1可知：與陰性對(duì)照相比，cSDP在質(zhì)量濃度低于5.00 mg/L時(shí)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用；fSDP、SDP在質(zhì)量濃度為5.00、10.00 mg/L時(shí)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用，并且在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。說(shuō)明多糖單獨(dú)作用時(shí)，多糖的純化程度和多糖質(zhì)量濃度均對(duì)其免疫活性存在影響。

表1 cSDP、fSDP和SDP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；與陰性對(duì)照組相比，*表示差異顯著(p<0.05)。

由表2可知：與陽(yáng)性對(duì)照組ConA相比，cSDP在質(zhì)量濃度2.50、5.00 mg/L時(shí)，能協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖；fSDP及SDP在質(zhì)量濃度2.50～10.00 mg/L時(shí)，能協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖；fSDP在質(zhì)量濃度5.00 mg/L時(shí)有極顯著的促進(jìn)作用。說(shuō)明這3種多糖在與ConA協(xié)同作用時(shí)，其對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖作用與多糖的純化程度關(guān)系不大，并且在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3種多糖質(zhì)量濃度均在5 mg/L時(shí)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最為顯著。

表2 cSDP、fSDP和SDP體外協(xié)同ConA對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

3種多糖質(zhì)量濃度/mg·L-1ODcSDPODfSDPODSDP陽(yáng)性對(duì)照0．351±0．0130．351±0．0130．351±0．0131．250．312±0．0250．336±0．0380．353±0．0062．50(0．423±0．001)?(0．421±0．003)?(0．416±0．004)?5．00(0．425±0．020)?(0．441±0．016)??(0．433±0．004)?10．000．402±0．083(0．420±0．012)?(0．418±0．010)?

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；與ConA陽(yáng)性對(duì)照組相比，*表示差異顯著(p<0.05)，** 表示差異極顯著(p<0.01)。

由表3可知：與LPS陽(yáng)性對(duì)照組相比，cSDP、fSDP及SDP在不同質(zhì)量濃度下，均無(wú)顯著的促進(jìn)作用。說(shuō)明這3種多糖在與LPS協(xié)同作用時(shí)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響不顯著。

表3 cSDP、fSDP和SDP體外協(xié)同LPS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

3種多糖質(zhì)量濃度/mg·L-1ODcSDPODfSDPODSDP陽(yáng)性對(duì)照0．395±0．0390．395±0．0390．395±0．0391．250．372±0．0640．322±0．0390．357±0．0112．500．385±0．0670．302±0．0160．378±0．0035．000．405±0．1650．325±0．0260．348±0．04710．000．446±0．1370．390±0．1760．311±0．068

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)通過(guò)醇沉分級(jí)、脫色、脫蛋白，從五味子藥渣中獲得3種多糖，對(duì)其體外免疫活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：cSDP、fSDP和SDP在一定質(zhì)量濃度下對(duì)未經(jīng)活化的淋巴細(xì)胞有增殖作用，對(duì)經(jīng)ConA活化的淋巴細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用，說(shuō)明了其有較好的免疫興奮作用。這一結(jié)果與苗明三等[17]對(duì)五味子多糖能促進(jìn)正常小鼠免疫功能的研究結(jié)果一致，這說(shuō)明五味子用于提取護(hù)肝片生產(chǎn)的成分，其殘?jiān)腥匀缓酗@著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性多糖，說(shuō)明護(hù)肝片生產(chǎn)后的五味子藥渣存在很高的再利用價(jià)值。

研究中發(fā)現(xiàn)，五味子藥渣多糖的質(zhì)量濃度以及純化程度均會(huì)影響小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫的程度。在低質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫無(wú)影響；在本試驗(yàn)有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，五味子藥渣多糖質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，在體外促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)。試驗(yàn)中，SDP較cSDP促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的質(zhì)量濃度范圍增大，說(shuō)明多糖純化程度越高，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越顯著。五味子藥渣多糖除蛋白前后，對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用差別不大，說(shuō)明五味子藥渣粗多糖中的蛋白對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。目前，未見報(bào)道說(shuō)五味子蛋白具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，但王巍等[18]研究的免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，說(shuō)明五味子蛋白和免疫調(diào)節(jié)肽的結(jié)構(gòu)從本質(zhì)上是不同的。本研究結(jié)果為護(hù)肝片生產(chǎn)后的五味子藥渣再利用和深度開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

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Extraction and Immunological Activity of Polysaccharide from Dregs ofSchisandrachinensis(Turcz.) Bailey

Guo Zhixin, Zhu Junyi, Gu Dizhou, Sun Yibo, Cui Yue

(Tonghua Normal University, Tonghua 134002, P. R. China); Song Hui(Jilin Agricultural University)

Schisandrachinensis(Turcz.) Bailey； Dregs； Polysaccharide； Purification； Lymphocyte transformation

郭志欣，女，1980年3月生，通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，講師；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，博士研究生。E-mail:guozhixin800317@163.com.cn。

宋慧，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail:conghuinongda@163.com。

2016年7月8日。

Q539

1)吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2011-307)。

責(zé)任編輯：潘 華。