丁協(xié)剛，劉 波,2，李世文，王行環(huán)

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院泌尿外科，湖北十堰 442000)

·基礎(chǔ)研究·

枸杞多糖通過(guò)氧化應(yīng)激途徑促海綿體神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究

丁協(xié)剛1，劉 波1,2，李世文1，王行環(huán)1

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院泌尿外科，湖北十堰 442000)

目的 探討氧化應(yīng)激在枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)促海綿體神經(jīng)(cavernousnerves，CN)鉗夾損傷后再生中的作用。方法 84只雄性SD大鼠隨機(jī)平均分成3組，即假手術(shù)組、CN損傷對(duì)照組、LBP處理組。LBP處理組于術(shù)后第1天開(kāi)始，連續(xù)灌胃2周。分別于術(shù)后1周、2周、4周、12周每組隨機(jī)取7只大鼠行血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)活性測(cè)定，術(shù)后12周電刺激CN測(cè)定海綿體內(nèi)壓，隨后取CN進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色記錄神經(jīng)有髓鞘軸突數(shù)目。結(jié)果 在術(shù)后第1、2和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著高于假手術(shù)組及損傷對(duì)照組；在術(shù)后第2周和第4周，LBP處理組MDA含量明顯低于假手術(shù)組及損傷對(duì)照組；術(shù)后12周LBP處理組平均海綿體內(nèi)壓、CN橫切面有髓鞘軸突數(shù)目均明顯高于損傷對(duì)照組，但均低于假手術(shù)組。結(jié)論LBP可通過(guò)減輕CN鉗夾損傷后的氧化應(yīng)激來(lái)促進(jìn)CN神經(jīng)再生及勃起功能的恢復(fù)。

枸杞多糖；勃起功能障礙；海綿體神經(jīng)

我們前期的研究表明，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)可以在一定程度上促鉗夾損傷海綿體神經(jīng)的再生[1]。為進(jìn)一步闡述其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將LBP用于雙側(cè)CN鉗夾損傷后的大鼠，通過(guò)血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)和與勃起功能相關(guān)的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，探討LBP是否通過(guò)其抗氧化機(jī)制促進(jìn)CN再生修復(fù)和勃起功能恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 甲苯胺藍(lán)(上海試劑三廠)；還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸(nicotinamideadeninedinucleotide2′-phosphate，NADPH)、硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazoliumblue，NBT)、TritonX-100(美國(guó)Sigma公司)；OCT包埋劑、EM812包埋劑(北京中杉生物試劑公司)；丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。枸杞多糖在武漢大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)學(xué)系實(shí)驗(yàn)室制備，參照我們前期的提取方法[2]，用前將枸杞多糖用生理鹽水稀釋，配成1mg/mL的溶液，4 ℃保存。

1.2 主要設(shè)備SXP-1C型手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用儀器廠)；HC-X020顯微血管夾(寧波市成和顯微器械廠)；BL420-F生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)；超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；CM1900恒冷式冰凍切片機(jī)(瑞典LKB公司)；OLYMPUS-DP12顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 84只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重250～300g，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0004，均經(jīng)性交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)有正常性功能。隨機(jī)均分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組及LBP組，每組28只。

1.4 動(dòng)物模型的建立 在無(wú)菌狀態(tài)下，大鼠經(jīng) 1%戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于鼠臺(tái)上，取下腹正中切口，延長(zhǎng)至陰莖根部，在外科手術(shù)顯微鏡(SXP-1B型，上海醫(yī)用儀器廠)下于兩側(cè)前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)及海綿體神經(jīng)，用顯微器械游離海綿體神經(jīng)后，參照我們前期的模型制作方法[3]，用顯微血管夾鉗夾兩側(cè)海綿體神經(jīng)各2min后逐層關(guān)腹。假手術(shù)組僅游離海綿體神經(jīng)而避免損傷。LBP組于術(shù)后第1天起每天按10mg/kg劑量行LBP灌胃,連續(xù)灌胃2周，對(duì)照組及假手術(shù)組灌胃給予同體積的生理鹽水。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 分別于術(shù)后第1、2、4、12周每組各隨機(jī)取7只大鼠，經(jīng)心臟采血提取血清，測(cè)定大鼠血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激水平。術(shù)后12周大鼠先行勃起功能測(cè)定再行心臟采血。

1.6 陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定 術(shù)后3個(gè)月，各組大鼠再次用1%戊巴比妥(50mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉。再取下腹正中切口，在手術(shù)顯微鏡下找到CN并將其游離，然后延長(zhǎng)下腹切口暴露出陰莖腳。用連接在生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL420-F，成都泰盟科技有限公司)上的間距約1mm的雙極電極勾住CN，在陰莖腳處插入1只22號(hào)蝶形針頭，通過(guò)PE-50硅膠管連接壓力換能器，設(shè)置電極刺激參數(shù)為連續(xù)單刺激，電壓5V，波寬5ms，頻率20Hz，電刺激CN持續(xù)60s，記錄海綿體內(nèi)壓(intracavernouspressure，ICP)變化曲線。

1.7 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色 壓力測(cè)定完成后，立即取鉗夾處遠(yuǎn)端3mm的海綿體神經(jīng)，置于2%的戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中前固定，2%的餓酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹(shù)脂(Epon-812)定向包埋，中點(diǎn)半薄橫切片1μm厚，經(jīng)1%甲苯胺藍(lán)染色，在OLYMPUS-DP12顯微鏡下放大400 倍拍片，觀察CN整個(gè)橫切面有髓鞘軸突的數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清氧化應(yīng)激水平 如表1所示，術(shù)后第1周，3組大鼠血清丙二醛水平無(wú)顯著性差異，在第2周及第4周，LBP組丙二醛含量明顯低于假手術(shù)組及鉗夾損傷組(P<0.05)。如表2、表3所示，在術(shù)后第1、2周和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性明顯高于其他兩組(P<0.05)；但在術(shù)后12周，3組大鼠間血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠在術(shù)后不同時(shí)間血清丙二醛含量 (nmol/mL)

與假手術(shù)組和損傷對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 各組大鼠在術(shù)后不同時(shí)間血清超氧化物歧化酶活性 (U/mL)

組別 第1周 第2周 第4周 第12周假手術(shù)組44.72±11.2351.23±12.8554.26±11.5967.48±12.16損傷對(duì)照組41.29±11.5445.71±11.1350.64±12.9765.53±12.35LBP組78.54±12.29*86.98±13.26*75.04±14.28*67.02±12.59

與假手術(shù)組和損傷對(duì)照組比較，*P<0.05。

表3 各組大鼠在術(shù)后不同時(shí)間血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性 (U/mL)

組別 第1周 第2周 第4周 第12周假手術(shù)組124.52±13.14129.96±15.53138.41±16.55151.16±18.76損傷對(duì)照組120.35±15.91125.31±14.48133.22±17.18151.82±16.29LBP組163.79±16.17*179.41±17.36*159.24±17.63*152.02±17.39

與假手術(shù)組和損傷對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2ICP測(cè)定結(jié)果LBP組ICP值(82.8±8.9)mmHg顯著高于損傷對(duì)照組[(48.6±6.1)mmHg，P<0.05]，但低于假手術(shù)組[(125.6±9.8)mmHg，P<0.05]。

2.3 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 假手術(shù)組(圖1A)CN橫切面有豐富的有髓鞘軸突，軸突排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，外觀形態(tài)正常，而損傷對(duì)照組(圖1B)軸突排列紊亂，軸突粗細(xì)不一。LBP組(圖1C)與損傷對(duì)照組相比，軸突數(shù)目顯著再生，軸突排列、軸突大小均趨向于正常外觀。LBP組有髓鞘軸突數(shù)目為(106.8±17.9)，明顯高于損傷對(duì)照組(64.9±13.86，P<0.05)，但低于假手術(shù)組(180.9±15.3，P<0.05)。

圖1 各組海綿體神經(jīng)干甲苯胺藍(lán)染色(×1 000)

A：假手術(shù)組；B：鉗夾損傷組；C：枸杞多糖處理組。

3 討 論

枸杞多糖(LBP)是枸杞子提取液的主要成分，而枸杞子是中醫(yī)臨床上常用的一種傳統(tǒng)中藥，具有滋補(bǔ)肝腎、益睛明目、潤(rùn)肺、延緩衰老、壯陽(yáng)等多種功效，在中醫(yī)男科上，應(yīng)用較多。近年來(lái)的研究表明，LBP具有提高免疫、保護(hù)生殖系統(tǒng)、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等作用，而其諸多功效與其抗氧化作用有關(guān)[4]。枸杞多糖在體外細(xì)胞水平能明顯誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，且與LBP的抗氧化應(yīng)激功能明顯相關(guān)[5-6]。另有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)LBP對(duì)中樞神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)等具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用[7-9]。在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們也證實(shí)了枸杞多糖可促鉗夾損傷后CN的再生，因此，我們預(yù)測(cè)氧化應(yīng)激在此過(guò)程中起重要作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)建立大鼠雙側(cè)CN鉗夾損傷的模型，在應(yīng)用LBP灌胃處理后，監(jiān)測(cè)了不同時(shí)間段血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性測(cè)定來(lái)反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平的變化規(guī)律，術(shù)后3個(gè)月，通過(guò)測(cè)定最大海綿體內(nèi)壓的變化，反映其勃起功能的恢復(fù)情況，CN甲苯胺藍(lán)染色來(lái)觀察其神經(jīng)損傷及修復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第1、2周和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性明顯高于其他兩組；在第2周及第4周，LBP組丙二醛含量明顯低于假手術(shù)組及鉗夾損傷組；在術(shù)后12周，三組大鼠間血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但術(shù)后12周，損傷對(duì)照組ICP峰值的變化明顯降低，且CN橫切面軸突出現(xiàn)明顯萎縮和減少，而LBP應(yīng)用組ICP、CN有髓鞘軸突數(shù)目雖低于假手術(shù)組，但均顯著高于損傷對(duì)照組。

由此可見(jiàn)，應(yīng)用LBP可通過(guò)減輕CN鉗夾損傷后早期的氧化應(yīng)激水平來(lái)促進(jìn)CN損傷后的神經(jīng)再生和勃起功能的恢復(fù)。

[1] 劉波，丁協(xié)剛，趙頎涵，等.枸杞多糖對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)鉗夾損傷的修復(fù)作用[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科，2013，30(12):2560-2562.

[2] 羅瓊,閆俊,崔曉燕,等.枸杞多糖對(duì)輻照大鼠生殖系統(tǒng)損傷拮抗作用[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2011,27(10):1358-1359.

[3]DINGXG，LISW，ZHENGXM，etal.Theeffectofplatelet-richplasmaoncavernousnerveregenerationinaratmodel[J].AsianJAndrol，2009,11(2):215-221.

[4] 殷玥琪,印虹，孫桂菊.枸杞多糖抗氧化作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2012，7(5)：380-382.

[5] 陳曉嵐,陳芬,莫艷秀,等.枸杞多糖誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,7(8):1173-1175.

[6] 劉樹(shù)輝,馬云勝,曹中偉,等.枸杞多糖誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,8(3):281-283.

[7]HOYS，YUMS，YANGXF，etal.Neuroprotectiveeffectsofpolysaccharidefromwolfberry，thefruitsofLyciumbarbarum，againsthomocysteine-inducedtoxicityinratcorticalneurons[J].JAlzheimersDis，2010，19(3):813-827.

[8]HOYS，YUMS，YIKSY，etal.Polysaccharidefromwolfberry，antagonizesglutamateexcitotoxicityinratcorticalneurons[J].CellMolNeurobiol,2009，29(8)：1233-1244.

[9]CHIUK，CHANHC，YEUNGSC，etal.ModulationofmicrogliabyWolfberryonthesurvivalofretinalganglioncellsinaratocularhypertensionmodel[J].JOculBiolDisInfor,2009，2(2)：47-56.

(編輯 王 瑋)

The neuroprotective effect of lycium barbarum polysaccharide after cavernous nerve injury is mediated by antioxidative mechanism

DING Xie-gang1，LIU Bo1,2，LI Shi-wen1，Wang Xing-huan1

(1.DepartmentofUrology，ZhongnanHospital，WuhanUniversity，Wuhan430071; 2.DepartmentofUrology，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectoflyciumbarbarumpolysaccharides(LBP)mediatedbyantioxidativemechanismaftercavernousnerve(CN)injury.MethodsAtotalof84maleSDratswererandomlydividedintothreegroups：shamoperationgroup(shamgroup)，bilateralCNcrushedgroup(controlgroup)，bilateralCNcrushedwithanoraladministrationofLBP1dayafterCNinjuryfor2weeks(LBPgroup).Malondialdehyde(MDA)，superoxidedismutase(SOD)andglutathioneperoxidase(GPX)wereevaluatedinweek1，2，4，and12.Erectilefunctionwasassessedbycavernousnerveelectrostimulationinweek12andnerveregenerationwasassessedbytoluidinebluestainingofCN.ResultsSODandGPXactivitiesintheLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamandcontrolgroupinweek1，2and4.MDAlevelinLBPgroupwassignificantlylowerthanthatintheshamandcontrolgroupinweek2and4.Inweek12，themeanintracavernouspressure(ICP)，andthenumberofmyelinatedaxonsofCNsinLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup，butlowerthanthoseintheshamgroup.ConclusionLBPcouldpromotenerveregenerationanderectilefunctionrecoveryafterCNcrushinjurybyreducingantioxidativereaction.

lyciumbarbarumpolysaccharide;erectiledysfunction;cavernousnerve

2015-07-30

2016-09-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81100492)

李世文，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師.E-mail:drlishiwen@sina.com

丁協(xié)剛(1980-)，男，(漢族)，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師.研究方向：泌尿外科及男科的基礎(chǔ)與臨床研究.E-mail:dxg1014@aliyun.com

R

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.12.016