趙林勝，陳子英，許海華，郎榮容，胡曉麗，徐國棟

雄激素、雌激素受體在尿道下裂患兒陰莖皮膚中的表達(dá)

趙林勝，陳子英，許海華，郎榮容，胡曉麗，徐國棟△

目的 探討雄激素受體（AR）及雌激素受體（ER）在尿道下裂患兒陰莖不同部位表皮及真皮中的分布特點(diǎn)。方法收集30例尿道下裂患兒陰莖背側(cè)皮膚（背側(cè)組）、異位尿道口腹側(cè)皮膚（腹側(cè)組）及尿道板皮膚組織（尿道板組），應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測各組中AR和ER在表皮和真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，Image Pro plus 6.0分析AR和ER在不同部位的表皮和真皮中的光密度（OD）值。結(jié)果各組AR、ER主要表達(dá)于陰莖皮膚基底細(xì)胞及棘細(xì)胞的細(xì)胞核，也表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核。AR在表皮中的表達(dá)，尿道板組低于背側(cè)組和腹側(cè)組（P＜0.05）；各組AR在真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ER在表皮中的表達(dá)，背側(cè)組高于腹側(cè)組和尿道板組（P＜0.05）；ER在真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，背側(cè)組、腹側(cè)組和尿道板組呈依次升高趨勢（P＜0.05）。結(jié)論陰莖尿道板組織中AR表達(dá)數(shù)量減少在尿道下裂發(fā)生中起重要作用，陰莖皮膚真皮成纖維細(xì)胞中ER表達(dá)的失衡可能參與了尿道下裂的發(fā)生。

尿道下裂；受體，雄激素；受體，雌激素；兒童發(fā)育

尿道下裂是小兒泌尿生殖系統(tǒng)最常見的畸形之一，在新生男嬰中發(fā)病率高達(dá)0.4%［1］。研究顯示，隨著環(huán)境惡化及低體質(zhì)量患兒存活率的提高，尿道下裂發(fā)病率呈逐年增高趨勢［2］。正常尿道的形成需要體內(nèi)雄激素與雌激素水平之間的平衡，性激素作用的失衡為尿道下裂形成的重要影響因素［3］。雄激素受體（androgen receptor,AR）和雌激素受體（estrogen receptors,ER）為性激素發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，AR和ER在尿道下裂皮膚中的表達(dá)與尿道下裂的關(guān)系尚無定論。本研究通過分析尿道下裂患兒陰莖不同部位的表皮和真皮成纖維細(xì)胞中AR和ER的表達(dá)情況，探討其與尿道下裂的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2012年6月—2015年12月天津市兒童醫(yī)院收治的先天性尿道下裂男性患兒30例，年齡1～5歲，平均（2.5±0.8）歲；采集尿道下裂患兒陰莖背側(cè)包皮（背側(cè)組）、異位尿道口腹側(cè)皮膚（腹側(cè)組）及尿道板組織（尿道板組）。所有標(biāo)本采集不影響患兒手術(shù)并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器鼠抗人AR和ER單克隆抗體（北京中杉金橋有限公司），通用HRP-DAB顯色試劑盒（羅氏公司）；BX51生物顯微鏡（Olympus公司）；Motic3.0圖像采集系統(tǒng)（麥克奧迪廈門有限公司）；Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化儀（羅氏公司）。

1.3 免疫組化染色標(biāo)本經(jīng)4%的中性甲醛充分固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后4 μm切片，65℃烤片1 h后，采用Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化儀染色。用已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果觀察AR和ER陽性定義為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。Image Pro Plus 6.0軟件分析AR和ER在不同部位的表皮和真皮中的光密度（OD）值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR、ER的表達(dá)定位在陰莖皮膚不同部位表皮和真皮中，真皮成纖維細(xì)胞AR表達(dá)差異不明顯；AR、ER主要表達(dá)于鱗狀上皮基底細(xì)胞及棘細(xì)胞的細(xì)胞核，也表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核，見圖1。

2.2 各組陰莖皮膚中AR和ER表達(dá)尿道板組表皮中AR的表達(dá)低于背側(cè)及腹側(cè)組，ER的表達(dá)低于背側(cè)組（P＜0.05）。AR在各組真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。背側(cè)組、腹側(cè)組和尿道板組真皮成纖維細(xì)胞中ER的表達(dá)呈依次升高趨勢（P＜0.05），見圖1、表1。

Tab.1 Comparison of AR and ER between three groups of epidermis and dermis表1 各組AR和ER在表皮和真皮中的表達(dá)情況比較（n=30，OD值×103，）

Tab.1 Comparison of AR and ER between three groups of epidermis and dermis表1 各組AR和ER在表皮和真皮中的表達(dá)情況比較（n=30，OD值×103，）

＊＊P＜0.01；a與背側(cè)組比較，b與腹側(cè)組比較，P＜0.05

AR表皮418.17±23.56 397.47±49.33 245.30±29.38ab208.200＊＊組別背側(cè)組腹側(cè)組尿道板組F真皮153.29±29.11 145.53±32.05 139.22±26.51 1.980 ER表皮335.21±26.34 211.52±33.15a197.22±24.50a216.500＊＊真皮98.73±25.35 115.73±22.23a175.25±24.51ab86.630＊＊

3 討論

3.1 尿道下裂陰莖不同部位皮膚中AR的表達(dá)尿道下裂發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已有研究表明尿道的形成是一個(gè)性激素依賴的過程，環(huán)境因子、遺傳因素及性激素失衡可導(dǎo)致性激素作用的偏差［2］。通常情況下，雄激素通過與尿道組織上的AR結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，因而AR的異常與尿道下裂的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，尿道下裂患兒皮膚中AR主要表達(dá)于表皮基底層及棘細(xì)胞的細(xì)胞核，且尿道下裂患兒尿道板組織表皮中AR的表達(dá)低于陰莖背側(cè)及腹側(cè)皮膚，此結(jié)果與安宇等［4］報(bào)道的部分結(jié)果一致，后者應(yīng)用免疫組化分析25例尿道下裂患兒及18例包皮環(huán)切患者的陰莖皮膚，發(fā)現(xiàn)先天性尿道下裂及單純性陰莖下曲陰莖皮膚組織中AR的表達(dá)低于包皮環(huán)切組陰莖皮膚，尿道板皮膚中AR的表達(dá)降低尤為突出，近端型尿道下裂陰莖背側(cè)、腹側(cè)皮膚AR的表達(dá)低于遠(yuǎn)端和中段型尿道下裂，而不同類型尿道下裂尿道板中AR的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該研究未對AR在真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行獨(dú)立分析。Baskin等［5］研究結(jié)果顯示，尿道下裂組陰莖皮膚中AR mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常人組；認(rèn)為AR與DNA結(jié)合能力及功能的下降可導(dǎo)致尿道下裂陰莖皮膚中AR mRNA代償性表達(dá)增多。林俊山等［6］研究顯示，在不同類型的尿道下裂尿道板中，單獨(dú)應(yīng)用生理水平的睪酮時(shí)，中遠(yuǎn)端型尿道下裂組與對照組（低端型尿道下裂）AR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而提高睪酮水平后，中遠(yuǎn)端型尿道下裂組AR的活化水平低于對照組；同時(shí)應(yīng)用表皮生長因子和生理水平的睪酮時(shí)，近端型和遠(yuǎn)端尿道下裂組的成纖維細(xì)胞AR的活化水平較對照組明顯升高，認(rèn)為尿道下裂尿道板成纖維細(xì)胞AR的表達(dá)與活化均存在異常。本研究結(jié)果提示尿道板表皮中AR表達(dá)降低可能為尿道下裂的致病因素之一。本研究中AR在不同部位真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與不同嚴(yán)重程度尿道下裂中真皮成纖維細(xì)胞AR的表達(dá)數(shù)量或AR的功能異常不盡一致有關(guān)。

3.2 尿道下裂陰莖不同部位皮膚中ER的表達(dá)與AR比較，ER在對生殖結(jié)節(jié)中的細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、纖維細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnt信號傳導(dǎo)通路等多種調(diào)控中起相反的作用，但AR和ER的信號同時(shí)影響陰莖發(fā)育［7］。Walker等［8］利用基因敲除技術(shù)敲除鼠的ERα、β基因及芳香化酶基因后，發(fā)現(xiàn)被覆上皮的間充質(zhì)相互融合，形成尿道口和包皮，此過程依賴雄激素和雌激素信號共同作用，且雌激素信號顯得更為重要。Cunha等［9］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在尿道形成過程中雌激素可促進(jìn)上皮的融合，決定尿道口組織的彈性；相反，應(yīng)用來曲唑抑制雌激素合成，可導(dǎo)致尿道下裂及陰莖頭畸形，且雌激素的合成障礙與陰莖的ER表達(dá)水平有關(guān)。Qiao等［10］應(yīng)用RT-PCR和免疫組化分析35例尿道下裂和15例正常包皮環(huán)切陰莖皮膚中ER的表達(dá)，RTPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿道下裂陰莖皮膚中ERα和ERβ mRNA的表達(dá)均明顯降低，且與尿道下裂的程度無關(guān)；免疫組化分析顯示ERβ主要表達(dá)于表皮的基底層和棘細(xì)胞層，ERα弱表達(dá)于正常和中度尿道下裂的陰莖皮膚，在重度尿道下裂中未檢測到ERα的表達(dá)。因此該研究認(rèn)為，尿道皮膚中ER的表達(dá)下降參與尿道下裂的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，陰莖尿道板和腹側(cè)表皮中ER表達(dá)低于陰莖背側(cè)皮膚，結(jié)果與上述報(bào)道一致。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，背側(cè)組、腹側(cè)組和尿道板組真皮成纖維細(xì)胞中ER的表達(dá)水平依次升高。研究認(rèn)為，在陰莖的發(fā)育過程中，ER信號的增強(qiáng)可抑制陰莖的發(fā)育，成纖維細(xì)胞中ER表達(dá)增高可能抑制尿道板成纖維細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致尿道板的發(fā)育遲緩，從而導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生［5］。因此，結(jié)合相關(guān)研究，筆者認(rèn)為，皮膚真皮成纖維細(xì)胞中ER表達(dá)增高可能為尿道下裂的重要致病機(jī)制，保留尿道板的尿道成形術(shù)后局部激素干預(yù)方案值得進(jìn)一步研究。

通常情況下，尿道板生長較陰莖的其他部位生長發(fā)育遲緩，為尿道下裂患兒陰莖下彎及尿道口異位的組織學(xué)基礎(chǔ)；AR和ER表達(dá)的失衡可能為尿道下裂發(fā)生的重要作用機(jī)制。在眾多的尿道下裂矯形方法中，保留致AR和ER表達(dá)失衡的尿道板的術(shù)式，術(shù)后尿道瘺并發(fā)癥發(fā)生率可達(dá)38%［11］。然而，最近的Meta分析6項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，僅1項(xiàng)研究顯示術(shù)前激素干預(yù)能有效降低并發(fā)癥，4項(xiàng)研究顯示術(shù)前激素干預(yù)后并發(fā)癥發(fā)生率升高，余1項(xiàng)研究未顯示有差異［12］。Chao等［13］研究則顯示，術(shù)前激素干預(yù)不會(huì)提高術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率。因此，是否需要根據(jù)尿道下裂局部皮膚性激素受體失衡的特點(diǎn)，行個(gè)體化的精準(zhǔn)的激素干預(yù)，值得進(jìn)一步探討。

（圖1見插頁）

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（2016-07-19收稿 2016-10-16修回）

（本文編輯 陸榮展）

Distribution of androgen receptor and estrogen receptor in penis skin of patients with hypospadias

ZHAO Linsheng,CHEN Ziying,XU Haihua,LANG Rongrong,HU Xiaoli,XU Guodong△
Department of Pathology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300384,China△

ObjectiveTo characterize the expressions of androgen receptor(AR)and estrogen receptor(ER)in penis skin of patients with congenital hypospadias.MethodsDorsal prepuce,ventral prepuce,and urethral plate were harvested from 30 patients with congenital hypospadias.The expressions of AR and ER in epidermal cells and dermal fibroblasts were assessed respectively by automated immunohistochemistry.Image Pro plus 6.0 was used to analyze the optical density(OD) value of AR and ER in different parts of epidermal cells and dermal fibroblasts.ResultsAR and ER were located mainly in nucleis of the squamous basal cells and prickle cells,and were also found in nucleis of subcutaneous fibroblast cells.The expression of AR was lower in epidermis of urethral plate than that of dorsal prepuce and ventral prepuce(P＜0.05),but no significant difference was detected in dermal fibroblasts.The expression of ER was higher in epidermis of dorsal prepuce than that of urethral plate and ventral prepuce(P＜0.05).The dermal expression of ER in fibroblast cells was increased successively in dorsal prepuce,ventral prepuce and urethral plate(P＜0.05).ConclusionLower expression of AR in urethral plate may contribute the development of hypospadias.Disorder of ER in dermal fibroblast cells of prepuce may play an important role in hypospadias.

hypospadias；receptor,androgen；receptor,estrogen；child development

R695.3

A

10.11958/20160701

天津市衛(wèi)生計(jì)生委資助項(xiàng)目（2011ky13）

天津市兒童醫(yī)院病理科（郵編300384）

趙林勝（1978），男，碩士，主要從事兒童病理診斷

△通訊作者E-mail:dongyan615@163.com