羅磊，王永坤，李世康

香芹酚誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌1299細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

羅磊，王永坤，李世康△

目的 探討香芹酚（CV）對人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）NCI-H1299細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲的作用及可能機(jī)制。方法以不同濃度的CV（20、40、60、80 μmol/L）處理NCI-H1299細(xì)胞，以未經(jīng)CV處理的細(xì)胞為對照組。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率；Transwell法檢測40 μmol/L CV處理組和對照組細(xì)胞侵襲能力；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測40 μmol/L CV處理組和對照組的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-9、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、TIMP-1的mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果與對照組比較，CV各處理組NCI-H1299細(xì)胞存活率均明顯降低，而凋亡率增加（P＜0.05），但抑制效應(yīng)均不呈濃度依賴性（P＞0.05）。CV處理組侵襲細(xì)胞數(shù)（40.67±3.63）個(gè)明顯低于對照組（76.00±5.78）個(gè)（P＜0.01）。CV處理組較對照組caspase-9、TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增高，MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）。結(jié)論CV可誘導(dǎo)人NSCLC NCI-H1299細(xì)胞凋亡，抑制其侵襲，作用機(jī)制可能與caspase-9的活性增加及MMP-9的下調(diào)有關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞凋亡；腫瘤侵潤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；基質(zhì)金屬蛋白酶9；金屬蛋白酶類組織抑制劑；香芹酚；人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞

研究顯示，在全世界癌癥中，肺癌發(fā)病率和死亡率均較高，每年可造成約150萬人死亡［1-2］。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC占所有肺癌的85%，而約75%的NSCLC患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期［3］。研究顯示，NSCLC的5年生存率僅為15%［4］。因此，探索肺癌發(fā)生、惡化的機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶標(biāo)非常重要。香芹酚（Carvacrol，CV）為一種單帖酚，化學(xué)結(jié)構(gòu)為5-異丙基-2-甲基苯酚，是百里香油、香薷精油的主要成分，作為安全的添加劑廣泛用于食品及日用品的生產(chǎn)過程中［5-7］。既往研究表明，CV具有抗炎［8］、抗氧化應(yīng)激［9］及抗腫瘤［10］等多種生物學(xué)活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，CV對多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，如肝癌HepG2［11］、轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDAMB231［10］等。目前，有關(guān)CV抗肺癌的作用及機(jī)制研究少見。因此，本研究將CV作用于NSCLCNCIH1299細(xì)胞，選擇半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及其抑制劑（TIMP-1）為作用靶點(diǎn)，觀察CV對腫瘤細(xì)胞凋亡和侵襲作用的影響，并初步探討相關(guān)機(jī)制，以期為NSCLC的精準(zhǔn)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人NSCLCNCI-H1299細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Gibco公司）；細(xì)胞裂解液和BCA蛋白含量測定試劑、Western blot檢測試劑盒（江蘇碧云天公司）；PVDF膜（Millipore公司）；caspase-9、MMP-9、TIMP-1抗體及GAPDH IgG抗體（武漢博士德）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、CV（美國SIGMA公司）；凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PI KIT、Matrigel基質(zhì)膠、流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Transwell板（美國Corning公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 NCI-H1299細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、鏈霉素100 mg/L和青霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2.0%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以5×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板（每孔100 μL），待細(xì)胞生長至90%融合后，加入0（對照組）、20、40、60、80 μmol/L濃度的CV處理48 h，其中，對照組細(xì)胞存活率設(shè)置為100%，加入MTT。各組分別于24和48 h在570 nm波長處測定吸光度（A）值，給藥組細(xì)胞存活率=給藥組A/對照組A× 100%，對照組細(xì)胞存活率=（24或48 h）對照組A/0 h對照組A×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)生長期NCIH1299細(xì)胞，每孔以5×104/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，分組同1.2.2，處理24 h后收集各組細(xì)胞，與AnnexinV-FITC結(jié)合，加入碘化丙啶染色液，輕輕混勻后避光冰浴孵育，流式細(xì)胞儀檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell上室內(nèi)膜。調(diào)整NCI-H1299細(xì)胞密度，按5×103/mL的密度接種上室，根據(jù)1.2.2的結(jié)果加入終濃度為40 μmol/L的CV進(jìn)行處理（CV處理組）；下室為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以未加入CV處理的細(xì)胞為對照組，各組于48 h后取出上室，PBS淋洗，4%甲醛固定15 min，晾干后結(jié)晶紫染液染色5 min，倒置顯微鏡下（×100）計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10個(gè)視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測caspase-9、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達(dá)分組同1.2.4。按TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定并定量后，依據(jù)TaKarRa公司逆轉(zhuǎn)錄說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：SYBR反應(yīng)體系共25 μL。目的基因和內(nèi)參基因引物序列設(shè)計(jì)由上海吉?jiǎng)P生物工程有限公司完成，見表1。擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，30個(gè)循環(huán)。熔解條件：95℃2 min，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次取平均值。

Tab.1 Primer sequence of quantitative real time-PCR表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.6 Western blot檢測caspase-9、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)分組同1.2.4。取2組細(xì)胞各加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取各組總蛋白40 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜。加入1∶5 000倍稀釋二抗，37℃孵育，ECL法進(jìn)行底物發(fā)光，曝光成像后分析。圖片結(jié)果用圖像分析軟件AlphaimagerTM 2200進(jìn)行分析,以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值反映相對蛋白表達(dá)量，以上步驟重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法；2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CV對NCI-H1299細(xì)胞存活率的影響與對照組比較，CV各處理組NCI-H1299細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.05)，但處理組間細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制效應(yīng)不呈濃度依賴性（P＞0.05），見表2。

2.2 CV對NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響對照組和20、40、60、80 μmol/L組處理24 h后的細(xì)胞凋亡率分別為（0.12±0.02）%、（94.12±2.79）%、（95.27± 2.34）%、（93.93±4.57）%、（96.12±2.79）%，各處理組均高于對照組（F=13.726，P＜0.05），但處理組間細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.3 CV對NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力的影響CV處理組侵襲細(xì)胞數(shù)（40.67±3.63）個(gè)，明顯低于對照組（76.00±5.78）個(gè)（t=43.296，n=3，P＜0.01），見圖2。

2.4 各組caspase-9、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)情況比較CV處理組較對照組caspase-9、TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增高，MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01），見表3、圖3。

Tab.2 The proliferation of NCI-H1299 cells treated with different concentrations and different time points of carvacrol表2 CV對NCI-H1299細(xì)胞存活率的影響（n=5,%，）

Tab.2 The proliferation of NCI-H1299 cells treated with different concentrations and different time points of carvacrol表2 CV對NCI-H1299細(xì)胞存活率的影響（n=5,%，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.05

組別對照組20 μmol/L組40 μmol/L組60 μmol/L組80 μmol/L組F 24 h 100.80±1.92 55.64±0.51a55.13±0.68a55.44±2.21a54.82±3.37a262.054＊＊48 h 95.48±6.50 52.44±1.07a52.20±2.11a51.51±1.04a51.05±3.30a235.962＊＊

Tab.3 The mRNA and protein expressions of caspase-9, MMP-9 and TIMP-1 in control group and carvacrol treatment group表3 對照組和CV處理組caspase-9、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)情況（n=3，）

Tab.3 The mRNA and protein expressions of caspase-9, MMP-9 and TIMP-1 in control group and carvacrol treatment group表3 對照組和CV處理組caspase-9、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)情況（n=3，）

＊＊P＜0.01

組別對照組CV處理組t mRNA相對表達(dá)量（2-ΔΔCt）caspase-9 1.18±0.09 4.32±0.24 33.080＊＊MMP-9 1.26±0.05 0.49±0.11 12.433＊＊TIMP-1 1.28±0.08 3.90±0.15 32.750＊＊組別對照組CV處理組t caspase-9 0.18±0.02 0.34±0.04 7.441＊＊蛋白相對表達(dá)量MMP-9 0.69±0.03 0.33±0.02 16.593＊＊TIMP-1 0.34±0.03 0.46±0.03 5.256＊＊

Fig.1 The apoptosis of NCI-H1299 cells treated with different concentrations of carvacrol圖1 不同濃度CV對NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

研究顯示，CV具有廣泛的抗腫瘤活性，抗腫瘤機(jī)制主要集中在絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）通路[10-11]，MAPK參與MMPs家族及caspase家族的表達(dá)調(diào)節(jié)［12-13］。

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，通常情況下其發(fā)生發(fā)展與癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲密切相關(guān)。癌細(xì)胞凋亡作為一種主動(dòng)性的程序性死亡，在肺癌治療中發(fā)揮重要作用［14］；這一過程包括凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡（如Bax、Bcl-2）、激活啟始caspase酶及效應(yīng)caspase酶、特異性結(jié)合細(xì)胞色素C等一系列生化級聯(lián)反應(yīng)［15］。caspase家族參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的一系列凋亡級聯(lián)反應(yīng)，可通過激活caspase-9、阻滯細(xì)胞周期從而發(fā)揮抗腫瘤作用［16-17］。caspase-9是主要的凋亡啟動(dòng)分子，是線粒體凋亡及死亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶［18］。在接受外界凋亡信號后，caspase-9可被細(xì)胞色素C激活，繼而阻礙DNA修復(fù)、降解細(xì)胞外基質(zhì)及骨架等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19］。有研究認(rèn)為，以caspase-9為靶點(diǎn)，可以干預(yù)腫瘤進(jìn)程，這可作為肺癌治療的策略之一［20］。

肺癌細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移為一個(gè)多步驟的生物學(xué)過程，其中肺癌細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。MMPs能有效降解肺癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)［21-22］；其中MMP-9在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［23］。

Fig.2 The invasion ability of NCI-H1299 cells inhibited by carvacrol（crystal violet staining，×100）圖2 CV對NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×100）

Fig.3 Comparison of protein expressions of caspase-9,MMP-9 and TIMP-1 between control and carvacrol treatment grounds圖3 對照組和CV處理組caspase-9、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)情況

本研究結(jié)果顯示，NCI-H1299細(xì)胞經(jīng)CV處理后，與對照組比較，CV各處理組NCI-H1299細(xì)胞存活率均明顯降低，凋亡率增加，表明NCI-H1299細(xì)胞增殖活性受到抑制，細(xì)胞凋亡顯著增加，但不呈濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系；而CV處理組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，提示CV在抑制NCI-H1299細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中也發(fā)揮作用。另外，本研究顯示，CV處理組較對照組caspase-9和TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增高，而MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，其中，caspase-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平增高表明作用機(jī)制可能涉及caspase-9激活，進(jìn)而引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮了抗腫瘤作用的過程；MMP-9表達(dá)受到抑制而TIMP-1表達(dá)升高，提示MMP-9可能參與抑制NCI-H1299細(xì)胞的侵襲活性，而上述作用是否具有濃度依賴性抑或是否與激活時(shí)間有關(guān)等尚不明確，并且這一過程是否涉及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路亦有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

綜上所述，CV能誘導(dǎo)NCI-H1299細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞侵襲，可能機(jī)制是通過增加caspase-9的活性和抑制MMP-9的表達(dá)來完成，因此，CV有可能成為臨床治療NSCLC的潛在有效藥物。

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（2016-06-28收稿 2016-09-12修回）

（本文編輯 陸榮展）

Study on the carvacrol induced apoptosis in human non-small cell lung cancer cell line H1299

LUO Lei,WANG Yongkun,LI Shikang△
Department of Thoracic and Cardiovascular Diseases,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China
△

ObjectiveTo study whether carvacrol can cause apoptosis in non-small cell lung cancer(NSCLC)cell line NCI-H1299,and explore its possible molecular mechanism.MethodsNCI-H1299 cells were treated with different concentrations of carvacrol(20,40,60 and 80 μmol/L)for 24 or 48 h.The viability of cells was evaluated by MTT assay, apoptosis was analyzed by flow cytometry(FCM)and the effect of carvacrol on metastasis of NCI-H1299 was analyzed by Transwell assay.The expression level of caspase-9,MMP-9 and TIMP-1 were detected by quantitative realtime-PCR and Western blot assay.ResultsAfter treatment with carvacrol,the viability of NCI-H1299 cells was suppressed dramatically (P＜0.05),without dose-dependent manner(P＞0.05).After being incubated with carvacrol for 24 h,FCM analysis indicated that carvacrol effectively induced apoptosis in NCI-H1299 cells(P＜0.05),without dose-dependent manner(P＞0.05).The ability of invasion was decreased(40.67±3.63 vs.76.00±5.78).Carvacrol inhibited the protein and mRNA expression levels of caspase-9,but increased the expression of MMP-9 and TIMP-1(P＜0.05).ConclusionCarvacrol can induce apoptosis of NCI-H1299 cells and inhibit their invasion,which may be associated with up-regulation of caspase-9 expression and down-regulation of MMP-9 expression.

carcinoma,non-small-cell lung；apoptosis；neoplasm invasiveness；caspase 9；matrix metalloproteinases 9; tissue inhibitor of metalloproteinases;Carvacrol；human non-small cell lung cancer NCI-H1299 cells

R285.5，R734.2

A

10.11958/20160597

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科（郵編530021）

羅磊（1983），男，主治醫(yī)師，碩士在讀，主要從事肺癌研究

△通訊作者E-mail：shikangli@hotmail.com