薛震，李蓮，任方元，姜芳馨，陳寶元，曹潔△

OSAS模式IH對(duì)肺癌細(xì)胞系YAP以及P-YAP表達(dá)的影響

薛震1，李蓮1，任方元1，姜芳馨2，陳寶元1，曹潔1△

目的 探討阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）模式間歇低氧（IH）對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞YES相關(guān)蛋白（YAP）及磷酸化YAP（P-YAP）表達(dá)的影響。方法IH分別處理A549細(xì)胞1 h、3 h、6 h（IH1組、IH3組、IH6組），IH頻率為：5%O2300 s，21%O2300 s，并設(shè)置常氧對(duì)照組（N組）。qRT-PCR檢測(cè)YAP mRNA表達(dá)；Western blot檢測(cè)YAP及P-YAP蛋白表達(dá)。結(jié)果IH1組（2.50±0.18）、IH3組（4.07±0.25）、IH6組（9.18±0.58）YAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于N組（1.00±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），IH1組、IH3組、IH6組YAP蛋白的表達(dá)量較N組上調(diào)，并隨暴露時(shí)間增加而上調(diào)；IH1組、IH3組、IH6組P-YAP蛋白的表達(dá)量較N組下調(diào)，并隨暴露時(shí)間增加而下調(diào)。結(jié)論YAP信號(hào)通路可能在OSAS模式IH促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起重要的調(diào)控作用。

睡眠呼吸暫停,阻塞性；細(xì)胞低氧；肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞；YES相關(guān)蛋白；磷酸化YAP；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；蛋白質(zhì)免疫印跡法

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是以睡眠狀態(tài)下出現(xiàn)的多發(fā)的、短暫的睡眠呼吸暫停和低通氣為特征的一類疾病，其核心與重要的生理學(xué)基礎(chǔ)是間歇低氧（intermittent hypoxia，IH），其IH以高頻率地發(fā)生，導(dǎo)致嚴(yán)重的低血氧和大幅度血氧的變化為特點(diǎn)［1］。OSAS是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，可以引起包括呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)或器官的損害［2］。嚴(yán)重OSAS患者若未經(jīng)過規(guī)范的治療，5年病死率可高達(dá)13%左右［3］。近年流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OSAS患者的腫瘤發(fā)病率和死亡率增加，且與IH有關(guān)［4］；后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)OSAS可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［5］，但是目前關(guān)于IH促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制尚不清楚。YAP即YES相關(guān)蛋白，是一種在胞內(nèi)起連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共激活作用的重要因子，在Hippo信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，而Hippo信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［6］。正常情況下，YAP以磷酸化形式（P-YAP）存在于胞漿中，當(dāng)其上游的Hippo信號(hào)調(diào)控發(fā)生異常時(shí)，P-YAP進(jìn)行去磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并作為轉(zhuǎn)錄共激活因子而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一［7］。本實(shí)驗(yàn)將初步探討OSAS模式IH對(duì)A549肺癌細(xì)胞系YAP和P-YAP表達(dá)的影響，為揭示OSAS促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人肺癌細(xì)胞可傳代細(xì)胞株A549由天津南開大學(xué)生命科學(xué)院肺發(fā)育和疾病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。21%的O2與5%的O2混合氣體（天津六方氣體有限公司）。O2、CO2濃度監(jiān)測(cè)儀（瑞士Hamilton公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega Leiden公司），SYBR?Select Master Mix（美國(guó)AMBION公司），YAP、內(nèi)參β-actin實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），YAP、P-YAP抗體（美國(guó)Santa Cruze公司），β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含有10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3傳代，傳至3～5代后，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成單細(xì)胞溶液，按照2 mL/孔接種于P35培養(yǎng)皿中，繼續(xù)上述條件培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，采用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗，調(diào)整無(wú)血清培養(yǎng)基至1 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后暴露。

1.2.2 暴露方式用O2、CO2濃度監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)培養(yǎng)艙中O2、CO2濃度。暴露裝置采用Visual C++語(yǔ)言編制程序（呼吸仿真系統(tǒng)1.0），設(shè)置所需低氧/復(fù)氧循環(huán)。IH頻率為低氧300 s、復(fù)氧300 s，控制低氧時(shí)艙內(nèi)濃度最低為5%，復(fù)氧時(shí)濃度為21%。IH組給予1 h、3 h、6 h（IH1、IH3、IH6）的低氧/復(fù)氧刺激，對(duì)照組細(xì)胞（N）放置在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR用TRIzol法提取暴露細(xì)胞總RNA后分裝，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后SYBR?Select Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次；72℃延伸7 min。以β-actin為內(nèi)參來校正目的基因表達(dá)量。根據(jù)目的基因和內(nèi)參β-actin的相對(duì)表達(dá)繪制柱狀圖表。引物設(shè)計(jì)見表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

1.2.4 Western blot分析收集暴露后的細(xì)胞，在4℃、12 000 r/min離心機(jī)上離心15 min，取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，加入5×sample buffer，100℃煮5 min，根據(jù)蛋白濃度取一定量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，恒定電壓100 V，時(shí)間100 min，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，后分別加入相應(yīng)抗體，4℃冰箱孵育過夜。第2天TBST洗膜5次，7 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育4 h后洗膜，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSAS模式IH對(duì)A549肺癌細(xì)胞系YAP表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，IH1組（2.50±0.18）、IH3組（4.07±0.25）、IH6組（9.18±0.58）的YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量較N組（1.00±0.01）均顯著增高（P＜0.05），見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，IH1、IH3、IH6組YAP蛋白的表達(dá)量較N組均顯著增高，且其表達(dá)量隨著IH處理時(shí)間增加而逐步增加，見圖1B。

2.2 OSAS模式IH對(duì)A549肺癌細(xì)胞系P-YAP表達(dá)的影響Western blot分析結(jié)果示，IH1、IH3、IH6組P-YAP蛋白的表達(dá)量較N組低，且基本隨著IH處理時(shí)間增加而逐步降低，見圖1B。

3 討論

OSAS是一種十分常見的睡眠呼吸疾病，因其發(fā)生在患者難以感知的睡眠過程當(dāng)中，導(dǎo)致不容易被發(fā)現(xiàn)。OSAS易合并包括呼吸、循環(huán)、血液等在內(nèi)的各種其他系統(tǒng)疾病，為全身性疾病。2007年Abrams［8］探討了腫瘤與OSAS的關(guān)聯(lián)，認(rèn)為腫瘤可能與OSAS模式IH有關(guān)。2012年美國(guó)威斯康辛的一項(xiàng)隊(duì)列研究報(bào)道了OSAS患者腫瘤病死率升高，與對(duì)照組相比，輕、中、重度OSAS的病死率分別達(dá)到1.1倍、2.0倍、4.8倍，去除如年齡、性別、腰圍、吸煙史、體質(zhì)指數(shù)（BMI）等影響因素后，患者腫瘤病死率仍與OSAS有關(guān)［9］。2013年美國(guó)Harvard醫(yī)學(xué)院在一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)二十余年的觀察性研究中發(fā)現(xiàn)，睡眠較正常人時(shí)間長(zhǎng)且伴有打鼾者的結(jié)腸癌發(fā)病率上升，推測(cè)可能與患者長(zhǎng)期處于OSAS模式IH環(huán)境有關(guān)［10］。后續(xù)相關(guān)流行病學(xué)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)OSAS模式IH可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與進(jìn)展［11］，但是關(guān)于其具體機(jī)制的相關(guān)研究仍然較少。Hippo信號(hào)通路與眾多嚴(yán)重疾病尤其是腫瘤密切相關(guān)，該通路已經(jīng)被證實(shí)參與了多個(gè)器官腫瘤的進(jìn)展過程［12］。YAP是此信號(hào)通路下游的一個(gè)效應(yīng)因子，YAP可以進(jìn)入細(xì)胞核并與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的合成，YAP在Hippo信號(hào)通路中處于關(guān)鍵樞紐地位［13］。Hippo-YAP信號(hào)通路最初發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)該通路主要由Mst1/2、WW45、LAST1/2、Mob、YAP等構(gòu)成，其中YAP處于關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)［14］。人體內(nèi)Hippo-YAP信號(hào)通路通過負(fù)性調(diào)控其下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP的活性來抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡［15］。Hippo-YAP信號(hào)通路失調(diào)可以引起腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，這在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中已經(jīng)得到了證實(shí)［16］。Steinhardt等［17］也證實(shí)YAP在結(jié)腸腺癌、肺腺癌等腫瘤中高度表達(dá)。Wang等［18］的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在92例非小細(xì)胞肺癌中，YAP蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率可高達(dá)66.3%。正常情況下，YAP蛋白表達(dá)于胞漿與胞核中，P-YAP蛋白主要表達(dá)于胞漿中，YAP發(fā)揮致癌基因作用的先決條件是去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，即YAP蛋白致癌活性的大小取決于其磷酸化狀態(tài)［19］。本研究中檢測(cè)不同IH暴露時(shí)間下A549細(xì)胞中YAP、P-YAP蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)IH1、IH3、IH6組YAP蛋白的表達(dá)量較N組均顯著增高，P-YAP蛋白的表達(dá)量較N組均顯著降低。這表明OSAS模式IH時(shí)，細(xì)胞內(nèi)更多的YAP處于非磷酸化狀態(tài)，以更多地進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)下游癌基因的表達(dá)；且本研究還發(fā)現(xiàn)YAP mRNA的表達(dá)量、YAP蛋白的表達(dá)量隨IH暴露時(shí)長(zhǎng)增加而逐步增加，P-YAP蛋白的表達(dá)量隨IH暴露時(shí)長(zhǎng)而逐步降低，這提示OSAS模式IH時(shí)間越長(zhǎng)腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增加。

Fig.1 Effects of intermittent hypoxia with different exposure time points on the expression levels of YAP and P-YAP in A549 cell lines圖1 不同的IH處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)A549細(xì)胞中YAP及P-YAP表達(dá)量的影響

綜上所述，OSAS模式IH致使Hippo-YAP信號(hào)通路中YAP表達(dá)上調(diào)、P-YAP表達(dá)下降，這可能為OSAS模式IH促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及臨床OSAS腫瘤患者病死率增加的原因之一，且腫瘤進(jìn)展程度可能與IH暴露時(shí)間有關(guān)。OSAS患者腫瘤發(fā)病率和病死率增高的分子作用機(jī)制十分復(fù)雜，本研究顯示YAP信號(hào)通路可能在其中扮演著重要角色，為進(jìn)一步研究提供了新的思路和方向。

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（2016-09-10收稿 2016-10-18修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of OSAS model IH on the expressions of YAP and P-YAP in lung cancer cell lines

XUE Zhen1,LI Lian1,REN Fangyuan1,JIANG Fangxin2,CHEN Baoyuan1,CAO Jie1△
1 Department of Respiratory Medicine,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China; 2 College of Life Sciences,Nankai University△

ObjectiveTo explore the effect of obstructive sleep apnea syndrome(OSAS),OSAS-like intermittent hypoxia(IH）on the expression levels of P-YAP and YAP in A549 lung cancer cell lines.MethodsA549 cells were treated with IH exposure(exposed to 5%O2for 300 seconds and 21%O2for 300 seconds)for 1,3 and 6 h(IH1,IH3,IH6)or normoxia exposure(N group).Quantificational real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of YAP. Western blot assay was used to detect the protein expression levels of YAP and P-YAP.ResultsThe mRNA expression levels of YAP were significantly increased with the increase of IH exposure time points in IH1(2.50±0.18),IH3(4.07±0.25) and IH6(9.18±0.58)groups than those in N group(1.00±0.01)(all P＜0.05).The protein expression levels of YAP were significantly increased with the increase of IH exposure time points in IH1,IH3 and IH6 groups than those in N group.The protein expression levels of P-YAP were significantly decreased with the increase of IH exposure time points in IH1,IH3 and IH6 groups than those in N group.ConclusionYAP cell signaling plays an important role in the process of OSAS-like IH induced tumor development.

sleep apnea,obstructive;cell hypoxia;A549 cell;YAP;P-YAP；qRT-PCR;Western blot

R734.2

A

10.11958/20161061

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81500070，81670084）；天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院青年孵育基金項(xiàng)目（ZYYFY2014011）

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科（郵編300052）；2南開大學(xué)生命科學(xué)院

薛震（1988），男，碩士在讀，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與腫瘤相關(guān)研究

△通訊作者E-mail:tjcaojie@sina.com