■ 張學雯 王玉松 李紅亞 王樹香 王 全 李術(shù)娜*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定071001；2.河北省黃驊市農(nóng)業(yè)局，河北黃驊061100）

兔是單胃動物，在其日糧中粗纖維是必不可少的，粗纖維是家兔能量來源的一部分，并構(gòu)成其合理的飼糧結(jié)構(gòu)，維持正常的消化功能，預防腸道疾病，從而減少發(fā)病率和死亡率。過低或過高水平的粗纖維都會嚴重影響家兔的生產(chǎn)性能和健康。另外，家兔的生長與健康的需要量不僅取決于粗纖維的供給量，還取決于粗纖維的質(zhì)量。

甘露聚糖是線狀多糖，以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結(jié)而成，它是植物半纖維素的必要部分之一。因為甘露聚糖在單胃動物的消化道內(nèi)呈凝膠狀，使消化道內(nèi)容物黏性增強，不僅降低飼料利用率，使動物腸道負擔增加，導致畜禽拉稀，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最終影響畜禽的生長與飼料利用率。甘露聚糖酶可以降解非淀粉多糖、使腸道黏度降低、促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。消除甘露聚糖能提高飼料利用率，改善動物體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)，提高動物的免疫功能及健康狀態(tài)，但是畜禽的消化酶系中不含甘露聚糖酶。

很多研究表明，飼料中添加甘露聚糖酶能降解甘露聚糖，從而降低食糜的黏度，維持腸道正常結(jié)構(gòu)，從而提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益。但直接添加酶制劑的成本比較高，在飼料中直接添加產(chǎn)芽孢菌劑，利用其抗逆性極強的特點，在胃腸道環(huán)境下產(chǎn)酶，因此可以幫助動物消化吸收甘露聚糖，提高飼料的利用率，降低養(yǎng)殖成本。

本實驗室前期已經(jīng)篩選獲得一株在動物胃腸道環(huán)境中產(chǎn)甘露聚糖酶菌株Y-3-2，本研究通過在肉兔飼料中添加產(chǎn)甘露聚糖酶芽孢桿菌菌粉的方式，測定肉兔生長性能、腸道菌群、腸道消化酶活力和日糧中物質(zhì)消化情況，從而探究產(chǎn)甘露聚糖酶芽孢桿菌制劑對肉兔飼料利用率提高的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌粉

河北農(nóng)業(yè)大學制藥工程系實驗室篩選菌株Y-3-2，由河北民得富生物科技有限公司進行液體發(fā)酵，噴霧干燥，并用麩皮吸附制成菌粉，最終制得含Y-3-2生物量為1.5×1011cfu/g的試驗菌粉。

1.1.2 試驗動物及飼料

肉兔：河北農(nóng)業(yè)大學標本園養(yǎng)殖基地購買的60日齡肉兔600只飼養(yǎng)于籠內(nèi)，隨機分為6組，每組100只。

肉兔飼料：河北省禽塔集團購買，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

菌株Y-3-2發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10 g、酵母粉10 g、CaCl21.0 g、K2HPO40.2 g、KH2PO40.4 g，pH值調(diào)至6，蒸餾水1 000 ml，115℃滅菌30 min。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

伊紅美蘭培養(yǎng)基：0.65%美蘭溶液10 ml、2%伊紅Y溶液20 ml、磷酸氫二鉀2 g、乳糖10 g、瓊脂17 g、蛋白胨20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值調(diào)至7.1，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、乙酸鈉5 g、酵母粉5 g、K2HPO42 g、檸檬酸二銨2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫80溶液1 ml，蒸餾水1 000 ml、121 ℃滅菌20 min。

BBL培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蛋白胨15 g、番茄浸粉5 g、氯化鈉5 g、酵母浸粉2 g、肝浸粉2 g、可溶性淀粉0.5 g、L-半胱氨酸0.5 g，pH值調(diào)至7.1，蒸餾水1 000 ml，115 ℃滅菌 30 min。

NA培養(yǎng)基：瓊脂20 g、蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、NaCl 5 g，pH值7.2～7.4，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌20 min。

DNS試劑：稱取3.15 g的3，5-二硝基水楊酸于500 ml水中，加熱至45℃，緩慢加入100 ml氫氧化鈉溶液，攪拌至溶液清澈透明，再緩慢加入91.0 g四水酒石酸鉀鈉、2.50 g苯酚、2.50 g亞硫酸鈉，攪拌并冷卻至室溫，定容至1 000 ml。棕色瓶保存，室溫放置7 d后使用。

1.2 方法

1.2.1 肉兔的分組和管理

試驗設(shè)計成6組，飼料配方如下：對照組：飼喂全價飼料，不添加菌劑。試驗1～5組：在全價飼料的基礎(chǔ)上添加Y-3-2菌劑，添加量分別為0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%，即分別配制成活菌體生物量為7.5×107、1.5×108、3.0×108、4.5×108、7.5×108cfu/g的飼料。

飼喂：3次飼喂肉兔，保持水量充足。預飼期2 d，飼喂期28 d。

1.2.2 供試動物生長性能測定

試驗前后對肉兔分別稱重。計算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

平均日采食量[g/(d·只)]＝（給料量-剩料量）/（天數(shù)·只數(shù)）；

平均日增重[g/(d·只)]＝（試驗后體重-試驗初體重）/（天數(shù)·只數(shù)）；

料重比=采食量/增重。

1.2.3 試兔腸道中菌群變化

分別在1、7、13、18、23、28 d對5只肉兔進行解剖，取其盲腸內(nèi)容物，通過無菌水浸提與活菌計數(shù)法測定其中芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌菌群數(shù)目的變化，依據(jù)食品衛(wèi)生微生物學檢驗方法測定。

1.2.4 試兔盲腸中消化酶變化

對上述盲腸內(nèi)容物進行浸提、離心，測定上清液中甘露聚糖酶活力、蛋白酶活力、纖維素酶活力、α-淀粉酶活力的變化。

甘露聚糖酶活力測定，采用Akino等的DNS法。蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶活力測定分別采用SB/T 10317-1999、NY-T912-2004、GB8275-2009的方法。

1.2.5 試兔糞便中常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)變化

分別在1、7、13、18、23、28 d的早上進行糞樣采集，測定糞便中常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)。粗纖維、粗蛋白、淀粉、粗脂肪含量測定分別依據(jù)GB/T 6434—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 6433—2006進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 試兔生長性能變化（見表2）

表2 試兔生長性能變化統(tǒng)計

由表2可知，試驗組日均增重較對照組都有提高，料重比則降低。相比對照組，試驗1～5組日增重分別增加3.48%（P＞0.05）、9.23%（P＜0.01）、7.62%（P＜0.01）、5.79%（P＜0.05）和5.57%（P＜0.05），料重比分別降低了 4.75%（P＜0.05）、8.65%（P＜0.01）、3.89%（P＜0.05）、2.78%（P＞0.05）和2.33%（P＞0.05）。

試驗中發(fā)現(xiàn)，菌劑添加量太少或太多都不能使試驗動物生長性能達到最佳。菌劑添加量太少，產(chǎn)酶量不足，達不到充分酶解飼料中的甘露聚糖的作用；而菌劑添加量太多，又有可能造成動物本身胃腸道菌群失衡。因此，菌劑最佳添加比例為0.10%。

2.2 試兔盲腸中菌群變化

由圖1可知，相比對照組，試驗1～5組腸道中芽孢桿菌菌數(shù)分別增加了2.47%（P＞0.05）、6.41%（P＜0.01）、4.94%（P＜0.01）、4.40%（P＜0.01）和3.94%（P＜0.05）。雙歧桿菌菌數(shù)分別增加了2.20%（P＜0.05）、3.59%（P＜0.01）、2.40%（P＜0.01）、2.13%（P＜0.05）和 1.53%（P＞0.05）。乳酸桿菌菌數(shù)分別增加了1.06%（P＞0.05）、2.64%（P＜0.01）、2.24%（P＜0.01）、1.72%（P＜0.05）和1.58%（P＞0.05），差異均較為顯著。而大腸桿菌菌數(shù)分別降低了10.78%（P＜0.05）、17.16%（P＜0.01）、15.92%（P＜0.01）、13.68%（P＜0.01）和7.96%（P＞0.05），差異均較為顯著。充分表明日糧中添加產(chǎn)酶菌劑，可以改善試兔腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進有益菌增長、抑制有害菌數(shù)量。

2.3 試兔盲腸中消化酶變化

由圖2可知，飼喂產(chǎn)酶菌劑可以增加試兔腸道消化酶活力。相比對照組，試驗1～5組腸道中甘露聚糖酶活力分別增加10.93%（P＞0.05）、40.35%（P＜0.01）、29.58%（P＜0.01）、26.69%（P＜0.01）和 18.01%（P＜0.05）。蛋白酶活力分別增加4.64%（P＞0.05）、10.52%（P＜0.01）、8.14%（P＜0.01）、6.03%（P＜0.01）和 4.23%（P＞0.05）。纖維素酶活力分別增加了12.02%（P＜0.01）、18.14%（P＜0.01）、14.86%（P＜0.01）、10.62%（P＜0.05）和8.6%（P＞0.05）。淀粉酶活力分別增加5.63%（P＜0.05）、14.06%（P＜0.01）、9.95%（P＜0.01）、7.95%（P＜0.01）和6.48%（P＜0.05）。差異均較為顯著。

圖1 菌劑對肉兔盲腸內(nèi)4種微生物菌數(shù)的影響

圖2 菌劑對肉兔盲腸內(nèi)4種酶活力的影響

2.4 試兔糞便中常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)的變化

對試兔糞便進行常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)粗纖維、粗蛋白、淀粉、粗脂肪的測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，飼喂產(chǎn)酶菌劑使得試兔糞便中常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢。相比對照組，試驗1～5組試兔糞便中粗纖維含量分別降低6.16%（P＜0.05）、9.16%（P＜0.01）、7.37%（P＜0.01）、6.37%（P＜0.05）和5.51%（P＞0.05）。粗蛋白含量分別降低 7.36%（P＞0.05）、13.07%（P＜0.01）、10.87%（P＜0.01）、9.33%（P＜0.01）和8.98%（P＜0.05）。淀粉含量分別降低7.07%（P＜0.05）、11.84%（P＜0.01）、8.16%（P＜0.01）、7.21%（P＜0.05）和4.08%（P＞0.05）。粗脂肪含量分別降低6.49%（P＜0.05）、9.50%（P＜0.01）、6.19%（P＜0.05）、6.18%（P＜0.05）和5.28%（P＞0.05）。差異均較為顯著。

圖3 菌劑對肉兔糞便中4種常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在兔日糧中添加0.10%比例的產(chǎn)甘露聚糖酶的芽孢桿菌菌粉，可達到促進試兔生長、提高飼糧消化率的目的。

本研究所使用的功能菌株Y-3-2為一株枯草芽孢桿菌，屬好氧菌，它經(jīng)飼喂進入試兔胃腸道后在其中停留并定植，其生長會消耗腸道內(nèi)的氧氣，促進胃腸道中的土著雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌的生長。已有大量文獻報道，枯草芽孢桿菌屬于一種多功能菌株，除可產(chǎn)甘露聚糖酶外，它還可產(chǎn)生抑菌蛋白、抗菌肽等益生物質(zhì)及多種酶（蛋白酶、淀粉酶等），因此菌株Y-3-2可能在腸道定植過程中產(chǎn)生了益生物質(zhì)及其它消化酶，抑制了腸道有害菌大腸桿菌的生長，并促進了胃腸道甘露聚糖酶、蛋白酶等消化酶活力的提高。腸道菌群與消化酶含量雙方面因素的變化，共同導致了試兔對日糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率的提高，進而促進了試兔的生長。

大腸桿菌對于動物有腹瀉作用，屬于有害菌種；而腸道中芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌對于動物有提高免疫力與抗病能力的作用，飼喂菌劑后，試驗組中大腸桿菌數(shù)量降低，而芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌增加。試驗結(jié)果表明，在肉兔飼糧中添加菌劑可提高肉兔抵御外界環(huán)境能力，增強生存生長能力，可促進肉兔快速健康生長。

4 結(jié)論

兔日糧中添加0.10%的菌劑可以顯著促進肉兔的生長，與對照組相比，日增重提高9.23%（P＜0.01），料重比較對照組降低8.65%（P＜0.01）；飼喂菌劑可改善試兔腸道菌群結(jié)構(gòu)，有益菌群芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量分別提高6.41%（P＜0.01）、3.59%（P＜0.01）、2.64%（P＜0.01），而致腹瀉大腸桿菌數(shù)量降低17.16%（P＜0.01）；肉兔腸道內(nèi)容物中甘露聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶含量較對照組分別提高40.35%（P＜0.01）、10.52%（P＜0.01）、18.14%（P＜0.01）、14.06%（P＜0.01）；與對照組相比，實驗組肉兔糞便中粗纖維、粗蛋白、淀粉、脂肪含量分別降低13.99%（P＜0.01）、13.07%（P＜0.01）、11.84%（P＜0.01）、9.50%（P＜0.01）。說明在肉兔飼糧中添加產(chǎn)酶菌劑可促進肉兔生長、提高飼料利用率。本研究結(jié)果為肉兔的高效養(yǎng)殖提供了新的思路。