■ 李 潔 張孟陽 郭 宏 黃 娟 王德培，3*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津牧豐飼料有限公司，天津300380；3.工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457）

發(fā)酵液體飼料（Fermented liquid feed，F(xiàn)LF）是指在 人工控制條件下，料水比按1∶1.5～1∶4的比例混合，通過微生物自身的代謝活動，經(jīng)過足夠長時間的發(fā)酵后，形成一種低pH值、狀態(tài)穩(wěn)定、易被畜禽采食、消化、吸收的飼料[1-2]。較干料和液體飼料，發(fā)酵液體飼料具有許多優(yōu)點：①適口性好，易消化；②飼料原料來源廣泛，如食品工業(yè)副產(chǎn)物，降低生產(chǎn)成本；③符合豬的消化生理特點；④微生物某些代謝產(chǎn)物可消除飼料中的抗影響因子，可減少抗生素的使用；⑤降低腸道pH值，抑制有害菌繁殖，提高腸道健康等[3-4]。李永明等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼喂發(fā)酵谷物液體料組平均日采食量提高22.63%，豐富腸道微生物菌群多樣性，進而改善仔豬生長性能。陳鮮鑫等[6]用30.88 kg左右的杜×長×大三元雜交生長豬進行飼喂試驗，結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵液體飼料組與對照組相比日增重提高34.03%、采食量提高12.55%、料肉比降低15.84%，飼喂發(fā)酵液體飼料組與未發(fā)酵液體飼料組相比日增重提高16.86%、采食量降低6.44%、料肉比降低19.83%。楊建松等[7]對仔豬飼料發(fā)酵工藝優(yōu)化后，還原糖含量、酸溶蛋白質(zhì)含量和乳酸含量分別增加了1.23%、1.75%和3.3%，同時含有大量益生菌，有效抑制大腸桿菌。發(fā)酵液體飼料的品質(zhì)受諸多因素的影響，包括發(fā)酵菌種、溫度、時間、料水比和日糧組成等。Nuria Canibe等[8]研究顯示，使用3種含有不同乙酸濃度的FLF日糧飼喂仔豬，結(jié)果顯示，高乙酸濃度的FLF略微降低飼料的pH值，在不影響體增重的情況下，降低仔豬的飼料采食量。C.Pedersen等[9]研究液體發(fā)酵飼料對生長育肥豬的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干料與水1∶3混合飼料與單純干料相比，有降低日糧GE、DM和CP的回腸消化率的趨勢。在發(fā)酵過程中，芽孢菌和乳酸菌能產(chǎn)生多種益生素，能有效抑制腸道有害菌的生長，維持腸道健康，如郭紅炳等[10]試驗結(jié)果表明，在斷奶仔豬飼料中使用益生素，可大幅降低飼料中抗生素的用量，并有減少仔豬腹瀉、提高增重的趨勢。本文以枯草芽孢桿菌和乳酸菌發(fā)酵仔豬全價液態(tài)飼料進行研究，并通過仔豬飼喂試驗探究發(fā)酵液體飼料對仔豬生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

枯草芽孢桿菌WL-BA-1（Bacillus subtilis WLBA-1）、枯草芽孢桿菌B10-5（Bacillus subtilis B10-5）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、糞腸球菌LJ(Enterococcus faecalis LJ)，均由本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、酵母粉10、NaCl 5，pH值7.5。

淀粉培養(yǎng)基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨5、NaCl 5、可溶性淀粉20、瓊脂18，pH值7.2。

MRS培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨 10、牛肉粉5、葡萄糖20、酵母粉4、乙酸鈉5、磷酸氫二鉀2、硫酸鎂0.2、檸檬酸三銨2、硫酸錳0.05、吐溫80 1，pH值6.2。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨20、乳糖10、牛膽鹽5、NaCl 5、中性紅0.03、瓊脂18，pH值7.0。

1.3 飼料原料

試驗所用飼料原料由天津牧豐飼料有限公司提供，將料水重量體積比1∶3.5混合，糊化前經(jīng)檢測其還原糖含量為0.19%，乳酸、乳酸菌數(shù)均檢測不出。

1.4 飼料液體發(fā)酵

將飼料與水按一定比例混合后，裝入發(fā)酵瓶中，置于100℃滅菌鍋中糊化20 min，冷卻到室溫后接入相關(guān)菌株種子液，混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.5 測定方法

1.5.1 還原糖含量的測定[11]

采用DNS法測定發(fā)酵飼料中還原糖的含量。

1.5.2 乳酸含量的測定

稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有45 ml蒸餾水的250 ml三角瓶里，充分搖勻并浸提1 h，之后離心取上清液，稀釋相應倍數(shù)后用SBA-40 E型生物傳感分析儀測其中乳酸含量。

1.5.3 活菌數(shù)的測定[12]

乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基，42℃厭氧培養(yǎng)48 h計數(shù)；芽孢桿菌用淀粉培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基進行計數(shù)，30℃靜置培養(yǎng)24 h計數(shù)；大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基，37℃靜置養(yǎng)24 h計數(shù)。

1.6 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

在前期預試驗中，發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌比例為1∶1，兩株芽孢菌接種比例為1∶1，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，總接種量為8%，發(fā)酵后液體飼料具有酸甜香味，在此基礎(chǔ)上對各因素進行優(yōu)化。

1.6.1 芽孢菌與乳酸菌接種比例的確定

選取芽孢菌與乳酸菌接種比例分別為1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1這5個水平進行發(fā)酵試驗。

1.6.2 兩株芽孢菌比例的優(yōu)化

選取兩株芽孢菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3這5個水平進行發(fā)酵試驗。

1.6.3 兩株乳酸菌比例的優(yōu)化

選取兩株乳酸菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3這5個水平進行發(fā)酵試驗。

1.6.4 總接種量的確定

選取總接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%這5個水平進行發(fā)酵試驗。

1.6.5 料水比的確定

選取料水比分別為1∶3，1∶3.5，1∶4，1∶4.5，1∶5這5個水平進行發(fā)酵試驗。

1.6.6 發(fā)酵條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素進行正交試驗。采用L9(34)型三水平三因素正交表，以芽孢菌與乳酸菌接種比例、總接種量、料水比3個因素作為考察因素，研究對發(fā)酵結(jié)果的影響。

1.7 發(fā)酵溫度的確定

選取溫度分別為20、26、32、37、42 ℃這5個水平進行分析，20、26℃發(fā)酵5 d，32、37℃和42℃發(fā)酵3 d。

1.8 仔豬飼喂試驗

1.8.1 試驗動物與日糧

微生物發(fā)酵仔豬全價飼料，飼喂7日齡～35日齡仔豬，共24只，分兩個處理組，每個處理組三個重復，對照組飼喂全價粉料，試驗組微生物發(fā)酵仔豬液態(tài)飼料替代50%全價粉料。試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.8.2 飼養(yǎng)管理

試驗仔豬斷奶后立即轉(zhuǎn)入保育舍，圈舍均為高床平養(yǎng)，保持舍內(nèi)通風順暢。試驗組每天定時飼喂4次，喂料時根據(jù)上次喂料采食情況，適當增減給料量，使仔豬保持自由采食狀態(tài)。乳頭式飲水器飲水，豬舍溫度控制在25～30℃，每天打掃2次豬舍。其他日常管理按常規(guī)進行。

1.8.3 測定指標

詳細記錄每天圈舍的溫濕度和采食飲水狀況等變化。觀察每天仔豬糞便變化、健康狀況。試驗初、中和末期稱重，計算耗料。計算平均日耗料、料肉比、日增重、腹瀉率等。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液體飼料芽孢菌與乳酸菌接種比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中兩株芽孢菌接種比例為1∶1，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，總接種量為8%，芽孢菌與乳酸菌比例見表2。

由表2可以看出，芽孢菌與乳酸菌接種比例對發(fā)酵液pH值和發(fā)酵后乳酸和還原糖含量影響相對較小，且pH值＜4.0，有效抑制有害菌的生長，芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1時，還原糖含量最高，且乳酸含量、芽孢菌數(shù)和乳酸菌數(shù)也有較高的水平，所以確定發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌比例為2∶1。

表2 芽孢菌與乳酸菌接種比例對發(fā)酵液體飼料的影響

2.2 發(fā)酵液體飼料兩株芽孢菌比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，接種量為8%，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，兩株芽孢菌比例如表3。

表3 兩株芽孢菌混合比例對發(fā)酵液體飼料的影響

由表3可看出，兩株芽孢菌的比例對乳酸和及益生菌數(shù)影響較小，而對發(fā)酵產(chǎn)生還原糖含量影響明顯，當兩株芽孢菌比例為1∶1時，還原糖含量最高，所以確定發(fā)酵液體飼料中兩株芽孢菌WL-BA-1和B10-5的比例為1∶1。

2.3 發(fā)酵液體飼料兩株乳酸菌比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，接種量為8%，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例如表4。

從表4可以看出，兩株乳酸菌的比例為1∶2時，還原糖含量最高，益生菌總數(shù)也處于較高水平，從而確定發(fā)酵液體飼料中兩株凝結(jié)芽孢桿菌和糞腸球菌LJ的比例為1∶2。

2.4 發(fā)酵液體飼料總接種量的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例分別為1∶2，接種量如表5。

由表5可以看出，隨著接種量的增加，接種量對還原糖含量影響不明顯，對乳酸含量影響也不顯著，但接種量高，生產(chǎn)上所需的菌液也高，成本也隨之增加，而4%接種量還原糖和乳酸含量以及益生菌數(shù)都處于一個較高的水平，所以最終確定接種量為4%。

表4 兩株乳酸菌比例對發(fā)酵液體飼料的影響

表5 總接種量對發(fā)酵液體飼料的影響

2.5 發(fā)酵液體飼料料水比的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，接種量為4%，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例為1∶2，飼料與水比例(W/V)如表6。

表6 料水比對發(fā)酵液體飼料的影響

液體飼料能提高豬的生長性能，飼料的含水量有助于飼料中營養(yǎng)成分的吸收利用，同時影響液體發(fā)酵的質(zhì)量。研究報道，料水比達到1∶3或1∶3.5時能提高生長效率和飼料利用率。由表6可知，隨著水分的提高，對發(fā)酵產(chǎn)乳酸和活菌數(shù)沒有明顯影響，而對發(fā)酵產(chǎn)生還原糖影響較大呈先增大后減少，料水比1∶3.5時達到最大值，所以確定料水比為1∶3.5。

2.6 發(fā)酵條件的正交試驗

以單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件，采用L9(34)型三水平三因素正交試驗研究接種量、芽孢菌與乳酸菌的接種比例、料水比對發(fā)酵結(jié)果的影響，以還原糖含量作為指標進行分析，如表7和表8所示。

通過正交試驗中各組發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖進行分析可以看出各因素無顯著性影響，各因子的主次順序為：接種量＞料水比＞接種比例，即優(yōu)化后的條件是接種量為4%，芽孢菌與乳酸菌接種比例為1∶1，料水比為1∶3.5。正交試驗中第4組既是這個組合，其還原糖含量可達到2.12%，乳酸含量3.2%，芽孢菌數(shù)為1.3×106CFU/g，乳酸菌數(shù)為1.7×1010CFU/g，并且有效抑制了大腸桿菌，最終確定發(fā)酵條件。

表7 正交試驗極差分析

表8 正交試驗方差分析

2.7 發(fā)酵液體飼料溫度的優(yōu)化

以優(yōu)化后的最佳條件接種發(fā)酵，進行發(fā)酵溫度的確定，如表9。

表9 溫度對發(fā)酵液體飼料的影響

從表9可看出，隨著溫度的升高，還原糖含量先增加后減小，37℃達到最高。其原因可能在于35℃左右芽孢菌代謝活躍，產(chǎn)生了淀粉酶、纖維素酶等，將飼料中的大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，而溫度過高，加上飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)熱，將會影響芽孢菌的生長以及代謝物的產(chǎn)生。在實際生產(chǎn)中，嚴格控制發(fā)酵溫度難以實現(xiàn)，應根據(jù)季節(jié)變化改變發(fā)酵時間，通過表中數(shù)據(jù)可知，在32～37℃間發(fā)酵都可以實現(xiàn)一個較好的效果。

2.8 發(fā)酵飼料對仔豬生長的影響

由表10可看出，各組豬初始體重、日采食量、料肉比無顯著性差異。與對照組相比，試驗組平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹瀉率下降54.88%。由于試驗仔豬為7日齡～35日齡，每天的采食量較少，加上正在開胃階段，所以試驗組的平均日采食量的提高不明顯，與許多研究有差距。由表11可以看出，發(fā)酵后飼料中有機酸以乳酸為主，含有少量的檸檬酸、丙酸和乙酸，使飼料中含有輕微酸甜香味。Van Winsen等（2011）[13]認為，發(fā)酵液體飼料的理想特性是：pH值＜4.5；乳酸菌菌數(shù)＞9 logCFU/ml；乳酸濃度＞150 mmol/l；乙酸濃度＜40 mmol/l；乙醇濃度＜0.8 mmol/l，本試驗發(fā)酵后飼料品質(zhì)基本與Van Winsen闡述的一致。表12可知，試驗組糞便中乳酸菌數(shù)是對照組的80倍，而對照組糞便中大腸菌數(shù)是試驗組的9倍，腹瀉率是試驗組的2.2倍，說明飼用發(fā)酵液體飼料增加了腸道乳酸菌，改變了腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。以上說明發(fā)酵液體飼料能提高仔豬生長性能，改善腸道健康，從而保證仔豬健康。

表10 發(fā)酵飼料對仔豬生長性能的影響

表11 發(fā)酵飼料發(fā)酵3 d后有機酸的含量

表12 發(fā)酵飼料對仔豬糞便中微生物的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵液體飼料前后營養(yǎng)品質(zhì)的變化

發(fā)酵飼料的品質(zhì)直接影響了仔豬的適口性，而影響液體發(fā)酵飼料的因素主要包括菌種、接種量、接種比例、溫度和料水比等。本試驗選用乳酸菌和芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中消耗了氧氣，產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，將飼料中大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，不僅有利于乳酸菌的生長，而且提高了飼料適口性，提高動物消化率；乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，降低pH值，抑制飼料中雜菌的生長，在腸道中還可抑制致病菌的繁殖。發(fā)酵前，飼料中含大量雜菌，還原糖、粗蛋白等含量較低，有益菌幾乎沒有，本試驗發(fā)酵后益生乳酸菌＞1010CFU/g，還原糖和乳酸含量分別達到2.17%和3.4%，含有少量檸檬酸和丙酸，從而飼料具有酸甜香味，大大提高仔豬適口性。李龍等[14]對復合益生菌發(fā)酵飼料工藝進行優(yōu)化后，結(jié)果發(fā)酵飼料品質(zhì)為金黃色、芳香味、質(zhì)地良好、pH值為4.27，游離氨基酸/總氮為13.73%，總菌數(shù)為5.50×108CFU/g，乳酸菌數(shù)和乳酸含量分別為16.17×108CFU/g和4.86 g/kg。張翠綿等[15]在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵高纖維固體飼料，結(jié)果顯示固體飼料中面包酵母菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的活菌數(shù)分別為5.67×107、1.31×109、8.06×108CFU/g，酸香味濃郁，適口性強。

3.2 發(fā)酵液體飼料對仔豬生長的影響

飼料在發(fā)酵過程中，不僅產(chǎn)生一些有益物質(zhì)，還能減少或消除抗營養(yǎng)因子，將植物蛋白降解成小肽、寡肽和游離氨基酸，很容易被小腸消化吸收。發(fā)酵液體飼料與母乳形態(tài)相似，減少斷奶綜合征對仔豬的影響。本試驗以優(yōu)化的最佳條件發(fā)酵后，將發(fā)酵料替代50%的仔豬全價粉料進行飼喂試驗，試驗組比對照組的平均日增重和日采食量都有所提高，腹瀉率下降，說明發(fā)酵飼料改善了仔豬的適口性，提高消化率和轉(zhuǎn)化率，并改善腸道健康。李小燕等（2013）研究結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵液體飼料組與顆粒料組和粉料組相比，平均日增重分別提高9.39%和11.39%，料重比降低7.34%和8.53%，有效提高腸胃中乳酸菌含量，降低大腸桿菌含量，并有效提高仔豬生長性能。

4 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗確定仔豬發(fā)酵液體飼料的發(fā)酵工藝為：接種量為4%，芽孢菌與乳酸菌接種比例為1∶1，料水比為1∶3.5，發(fā)酵溫度32～37℃范圍均可。按此條件37℃下發(fā)酵3 d后還原糖含量2.17%，乳酸含量3.4%，檸檬酸含量0.331%，丙酸含量0.130%，同時乳酸菌數(shù)達到1010CFU/g以上，大腸桿菌未檢出。添加50%發(fā)酵液態(tài)飼料飼喂仔豬，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹瀉率下降54.88%。