陳潔 祝文博 蘇越 鄭妍婕 劉雪峰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150000)

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爬地柏枯梢病病原菌鑒定1)

陳潔 祝文博 蘇越 鄭妍婕 劉雪峰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150000)

在黑龍江省內(nèi)采集病植物標本，對爬地柏枯梢病病原菌進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定爬地柏枯梢病病原物為微色二孢屬(Microdiplodiasp.)。通過對該病原菌rDNA進行PCR擴增和序列測定，得出該序列與GenBank中微色二孢屬的同源性為99%。從爬地柏枯梢病癥狀、病原菌、病菌生物學(xué)特性和防治技術(shù)4個方面描述爬地柏枯梢病，為該病害的防治提供借鑒。

爬地柏；枯梢?。晃⑸邔?；癥狀

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：68-70.

Sabinadavurica(Pall.) Ant. Shoot Blight Pathogen in Heilongjiang Province was identified asMicrodiplodiasp. based on morphological characteristics and ITS sequence analysis. By the rDNA PCR amplification and sequencing, the pathogen was 99% identity withMicrodiplodiasp. sequence from GenBank. We studied the symptoms of the disease, pathogens, biological characteristics of bacteria and control to introduceS.davuricaShoot Blight.

爬地柏(Sabinadavurica(Pall.) Ant.)又名興安圓柏，為柏科圓柏屬的一種，喜光，也比較耐蔭，生于多石山地或山峰巖縫處，產(chǎn)于黑龍江大興安嶺海拔400～1 400 m地帶，匍匐灌木，為常綠樹種，其部分枝條斜立而顯得姿態(tài)優(yōu)美，比較有氣勢，而且具有壽命長、耐修剪、適應(yīng)性強等特點，是園林綠化、水土保持及防沙治沙的優(yōu)勢品種。20世紀七八十年代黑龍江省防護林研究所引進了該樹種，它生長良好，表現(xiàn)了極強的適應(yīng)性，但長期以來未引起重視和開發(fā)利用。近幾年由于生態(tài)建設(shè)、治沙及園林綠化的需要才逐漸引起關(guān)注，但在黑龍江省發(fā)現(xiàn)了一種新的病害，即爬地柏枯梢病，該病已經(jīng)表現(xiàn)出現(xiàn)蔓延的趨勢，有關(guān)其病原學(xué)的研究對病害蟲防治有重要意義。

目前，關(guān)于爬地柏枯梢病病原以及防治技術(shù)的研究在國內(nèi)還未見報道。爬地柏常見的病蟲害，包括梨檜柏銹病、蘋果銹病、莖葉腐爛型立枯病、小地老虎和蠐螬等[1]。有資料表明圓柏枯梢病(Diplodiapinea)在呼和浩特地區(qū)一些苗圃發(fā)生嚴重，發(fā)病率為82%，影響了圓柏的綠化效果，同時也給生產(chǎn)單位造成很大的經(jīng)濟損失[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年先后從黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)校園花壇采集50株，雙鴨山市農(nóng)墾紅星隆管理局苗圃50株，齊齊哈爾市動植物園采集20株病葉、病枝標本，作為爬地柏枯梢病形態(tài)學(xué)分離和鑒定材料。

1.2 方法

1.2.1 癥狀觀察

觀察植株的危害部位及危害癥狀。取爬地柏枯梢病發(fā)病枝干，借助手持擴大鏡或?qū)嶓w解剖鏡觀察病癥特征，確認是否有病原菌的繁殖體或營養(yǎng)體。

1.2.2 病原菌分離培養(yǎng)

按發(fā)病部位分類(枝、葉)分別切取各部分3～5 mm，先用75%酒精消毒2～3 s，再用石灰水消毒1～2 min之后，用無菌水洗3～4遍。在超凈工作臺下，接種于PDA平板培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)。將不同的菌落分離純化到平板上，放入培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。觀察各種子實體的形態(tài)特征，了解植物上可能引起不同病害的病原。

采用單胞分離法對材料上的分生孢子器進行挑取單胞，放在PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。分離純化后得到純菌落，挑取菌絲于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得病原菌純菌落并保存。

1.2.3 致病性測定

按照柯赫氏法則，采用有傷和無傷接種方法對健康的爬地柏葉和梢接種，對其分離物進行致病性測定。

從阿城區(qū)玉泉龍達苗圃購買的健康爬地柏種苗。利用純菌種配制孢子懸浮液(數(shù)量大致為100×鏡視野下200個)。涂抹于針葉(50株)和梢(50株)上進行傷口(無菌針刺傷)和無傷口接種，并設(shè)對照實驗組。接種后套袋用濕紗布保濕48 h，以套袋保濕不接種為對照。常溫條件下觀察發(fā)病癥狀變化及發(fā)病率。

1.2.4 病原菌再分離

從已經(jīng)發(fā)病的植株上，分離培養(yǎng)病原菌，進行分離、純化。徒手切片，用水作承載劑鏡檢病害標本的分生孢子器、分生孢子等形態(tài)特征、大小、顏色等，與最初的接種分離物進行比較。

1.2.5 病原菌形態(tài)鑒定

取新鮮發(fā)病葉片，在實體顯微鏡下切取分生孢子器，徒手切片，用水作承載劑制成簡易玻片標本，然后在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子器、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)，利用電子顯微鏡拍攝照片，并用工具測量其大小。

將病原菌接種于PDA上進行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特征。

①生長速率：在28 ℃條件下察觀各階段生長形態(tài)變化。

②孢子形態(tài)：8 d左右在顯微鏡下觀察其分生孢子器，產(chǎn)孢細胞，孢子大小，并照相記錄其形態(tài)。

1.2.6 病原菌分子鑒定

用真菌的通用引物ITS1/ITS4對病原菌進行PCR擴增，對獲得的擴增產(chǎn)物進行測序，將得到的序列進行對比，通過同源性分析對病原菌進行分子水平鑒定。

①DNA的提?。翰捎美鋬鲆旱心TAB法提取病原菌DNA[3]。

②PCR擴增：使用的引物是核糖體ITS區(qū)段通用序列ITS1(5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGCTTATT-GATATGC-3′)，進行20 μL體系擴增后，再做瓊脂糖凝膠電泳檢測。

③DNA測序：將PCR產(chǎn)物送入上海生工測序公司測序。

④測序與對比：將PCR測序獲得的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列對比分析，做病原菌的同源性分析，并與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合確定病原菌分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 爬地柏枯梢病癥狀

爬地柏的葉、枝均受此病害的危害。針葉受害時，初期梢部針葉從葉尖向葉基逐漸變黃枯死，出現(xiàn)埋生的小黑點；后期枯死的針葉呈黃棕色，枯梢向下蔓延，直立不脫落。病葉上形成半埋生的表面光滑球狀小黑點，枯死枯枝成灰褐色。枝干部受害時逐漸褪綠，由淡褐色變?yōu)楹稚?，最后變?yōu)榛液稚?。病枝上形成半埋生的表面光滑球狀小黑點，即病菌的分生孢子器。受害感病植株易產(chǎn)生倒伏現(xiàn)象(見圖1)。

圖1 爬地柏枯梢病病害癥狀

2.2 病原菌形態(tài)特征

暗處的條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后接種點長出白色絨毛狀菌落，呈圓形，邊緣整齊，長滿培養(yǎng)皿。未見色素產(chǎn)生情況，未見分生孢子器。自然光培養(yǎng)5～8 d逐漸在白色菌落背面產(chǎn)生呈灰色同心圓的波紋，菌落背面波紋從中央依次向邊緣加深，邊緣顏色最深。8～10 d后逐漸變?yōu)楹谏?，菌落正面邊緣長出的黑色表面光滑小點為病原菌的分生孢子器。

分生孢子器球形，單生，初埋生后外露，呈半埋生于表皮下，有孔口。分生孢子器外壁是暗色的，內(nèi)壁是無色的。內(nèi)壁上連接有無色的分生孢子梗，分生孢子梗形式為全壁芽生單生式。分生孢子初期無色單胞，中期淡色雙胞，橫隔逐漸變寬，顏色加深。成熟后為淡褐色雙胞、橢圓形或卵形，橫隔顏色深于孢子壁顏色。尺寸為(16.0～22.5)μm×(8.5～13.0)μm，平均19.35 μm×9.90 μm。標本號：MD.01。

a.分生孢子器；b.分生孢子器橫截面；c.分生孢子梗及產(chǎn)孢方式；d.分生孢子；e.菌落正反面宏觀形態(tài)特征；標尺=10 μm。

圖2 微色二孢(Microdiplodiasp.)

2.3 致病性測定結(jié)果

用從紅星隆管理局苗圃采集到的病梢組織中分離得到菌株01接種健康植株。48 h后進行拆袋癥狀觀察，接種7～10 d后，傷口接種的枝和葉有38株和40株有感病情況，無傷口接種枝葉共3株有感病情況，對照組均無感病情況。21 d左右感染了傷口接種組內(nèi)接種部位及接種的整株植株，并可見黑色半埋生的分生孢子器。傷口接種病害發(fā)病率78%～80%。

2.4 病原物分子生物學(xué)測定

根據(jù)DNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對比，得出病原菌分類地位與Microdiplodiasp.(登記號：KF010841.1)的相似度為99%，病原菌分類地位與Diplodiapinea(登記號：JHUM01000052.1)的相似度為94%。同時該病原菌DNA測序結(jié)果已提交NCBI數(shù)據(jù)庫(登記號：KX034227.1)。

3 結(jié)論與討論

從哈爾濱市中醫(yī)藥大學(xué)、雙鴨山市農(nóng)墾紅星隆管理局、齊齊哈爾市動植物園采集大量發(fā)病的病葉、病枝，經(jīng)過對其分離、純化，根據(jù)菌落生長速度、菌落形態(tài)、色素產(chǎn)生情況、孢子及分生孢子器的基本形態(tài)相似度和分子鑒定，得出該菌種序列與Microdiplodiasp.相似度為99%，而與Diplodiapinea相似度僅為94%，共同確定爬地柏枯梢病的病原為Microdiplodiasp.微色二孢屬。

色二孢屬與微色二孢屬病癥基本相同，都是變黃枯死，在發(fā)病部位產(chǎn)生半埋生的小黑點。成熟分生孢子均為淡褐色雙胞，但分生孢子成熟過程稍有差別，色二孢屬孢子成熟后產(chǎn)生橫隔，微色二孢屬孢子未成熟就產(chǎn)生橫隔。

已有資料表示1969年10月在Gulab Gardens的荔枝上發(fā)現(xiàn)一種嚴重的葉部病害，葉部受害處從黃褐色至磚紅色，出現(xiàn)黑色點狀物體。在真菌學(xué)文獻中，該屬種已被描述并認為是不同的，考慮其宿主特異性的，被命名為Microdiplodialitchi.。2005年8月W. Gams & Y. Degawa，在Sophorachrysophylla上發(fā)現(xiàn)并命名為MicrodiplodiaAllesch.[4]。針對這微色二孢屬國內(nèi)外研究過少，需要我們進一步研究討論。

[1] 蘭麗萍.園林綠化樹種圓柏的病蟲害防治[J].中國園藝文摘,2013(4):97-98.

[2] 袁秀英,韓艷潔.圓柏枯梢病病原菌的研究[J].內(nèi)蒙古林學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),1997,12(4):37-40.

[3] 莊彩云,李潞濱,胡陶,等.適用于rDNA的ITS分析的蘭屬菌根真菌培養(yǎng)及DNA提取方法[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2007,22(3):4-6.

[4] CROUS P W. Groenewald Johannes Z.MicrodiplodiahawaiiensisCrous, sp. nov.[EB/OL]. Fungal Planet, 2006:7(2006-08-20)[2016-10-31].(http://www.fungalplanet.org/content/descriptions/descriptions_001.htm).

Identification ofSabinadavurica(Pall.) Ant. Shoot Blight Pathogens Human

Chen Jie, Zhu Wenbo, Su Yue, Zheng Yanjie, Liu Xuefeng

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

Sabinadavurica(Pall.) Ant.； Shoot blight；Microdiplodiasp.； Symptom

1)國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目。

陳潔，女，1994年8月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，本科生。E-mail：1256985001@qq.com。

劉雪峰，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，研究員。E-mail：757489401@qq.com。

2016年3月16日。

S763.15

責任編輯：戴芳天。