弓巧娟, 王永東, 楊海英, 原梅妮

(1.運(yùn)城學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，山西 運(yùn)城044000；2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原030006；3.中北大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，山西 太原030051)

氧化石墨烯對(duì)L-色氨酸熒光猝滅及機(jī)理研究

弓巧娟1,2, 王永東2, 楊海英1, 原梅妮3

(1.運(yùn)城學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，山西 運(yùn)城044000；2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原030006；3.中北大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，山西 太原030051)

采用改進(jìn)的Hummers 法制備氧化石墨烯，并用紅外、拉曼光譜和掃描電鏡等手段對(duì)氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)及形貌進(jìn)行表征，考察了不同溶劑對(duì)L-色氨酸熒光光譜的影響；分別以L-色氨酸、氧化石墨烯為熒光劑和熒光猝滅劑，借助熒光光譜法研究了氧化石墨烯對(duì)L-色氨酸的熒光猝滅作用。根據(jù)紫外吸收光譜、Stern-Volmer 方程和Lineweawer-Burk 雙倒數(shù)曲線方程，得出了氧化石墨烯對(duì)L-色氨酸熒光猝滅類型、猝滅速率常數(shù)(kq)和結(jié)合常數(shù)(K)等參數(shù)。結(jié)果表明，氧化石墨烯對(duì)L-色氨酸的熒光有較強(qiáng)的猝滅作用，其熒光猝滅機(jī)理是氧化石墨烯與L-色氨酸形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

氧化石墨烯; L-色氨酸; 熒光猝滅

1 前言

石墨烯自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其優(yōu)良的機(jī)械性能、熱學(xué)性質(zhì)、電學(xué)性質(zhì)及化學(xué)性能引起了科技工作者極大關(guān)注[1，2]?；谶@些優(yōu)良的性能，石墨烯在超級(jí)電容器、電化學(xué)傳感器、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、儲(chǔ)能等領(lǐng)域有較廣泛的研究[3-5]。

由于石墨烯在水中的分散性差和易團(tuán)聚等缺點(diǎn)，有關(guān)氧化石墨烯的研究有大量報(bào)道。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的前驅(qū)物，主要由石墨經(jīng)氧化剝離制得，是一種重要的石墨烯衍生物，其一般結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。GO表面含有大量環(huán)氧基、羥基和羧基等含氧親水基團(tuán)，易在水中形成穩(wěn)定的分散液[6]，進(jìn)而擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

圖 1 氧化石墨烯結(jié)構(gòu)Scheme 1 Structure illustration of GO.

L-色氨酸(L- tryptophan，L-Trp)又名α-氨基-β-吲哚丙酸(圖2)，是人和動(dòng)物必不可少的8種氨基酸之一，被稱為第二必需氨基酸，同時(shí)，L-Trp也是一種高效的熒光物質(zhì)，具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。目前，GO對(duì)量子點(diǎn)和熒光染料的猝滅行為研究已有報(bào)道，Swathi[7]報(bào)道了氧化石墨烯猝滅染料分子的熒光；高原等研究小組[8]研究發(fā)現(xiàn)，GO通過(guò)熒光能量共振轉(zhuǎn)移和非輻射偶極-偶極相互作用有效猝滅量子點(diǎn)的熒光；翟秋閣[9]發(fā)現(xiàn)GO對(duì)帶正電荷的熒光染料亞甲基藍(lán)有熒光猝滅作用，加入Bi3+可使體系的熒光增強(qiáng)，從而可靈敏測(cè)定Bi3+，檢出限為1×10-8mol·L-1；Huang[10]等將適體固定于熒光KGdF4納米粒子上，利用GO作為熒光猝滅劑，靈敏的測(cè)定了蓖麻蛋白，檢出限為8 pg·mL-1，Ji[11]等將GO作為熒光猝滅劑，可使熒光標(biāo)記的探針DNA熒光猝滅，目標(biāo)DNA與探針DNA形成雙鏈DNA后從GO表面脫落，熒光得以恢復(fù)，從而靈敏的檢測(cè)了去甲基化酶；Shi[12]等通過(guò)GO與多肽的熒光共振能量轉(zhuǎn)移超靈敏的檢測(cè)了肉毒神經(jīng)毒素。Huang[13]等采用GO猝滅釕配合物電致發(fā)光標(biāo)記的發(fā)夾探針定量檢測(cè)DNA。GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅及其猝滅機(jī)理研究尚未報(bào)道。

圖 2 L-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)Scheme 2 Molecular structure of L-tryptophan.

本文利用Hummers法合成了GO，研究GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅效應(yīng)，并得出GO猝滅L-Trp熒光的猝滅速率常數(shù)(kq)、結(jié)合常數(shù)(K)，進(jìn)一步研究了熒光猝滅形態(tài)機(jī)制。由于許多蛋白質(zhì)含有色氨酸殘基[14,15]，具有內(nèi)源熒光，進(jìn)行GO與L-Trp的熒光猝滅效應(yīng)的研究，對(duì)GO與生物分子相互作用研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

F4600熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；Cary5000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海大普公司)；JEM-2010HR 200 kV 透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；顯微共焦拉曼光譜儀(英國(guó)雷尼紹公司)。

石墨粉(上海試劑廠)；二甲基亞砜(DMSO)、硝酸鈉、高錳酸鉀、雙氧水(分析純，天津瑞金特化學(xué)品公司)；L-色氨酸(上海生工生物公司)。

2.2 氧化石墨的制備

采用改進(jìn)的Hummers方法制備氧化石墨[16]。

2.3 氧化石墨的表征及對(duì)L-Trp的熒光猝滅

采用英國(guó)雷尼紹公司的inVia顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)GO結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;采用德國(guó)布魯克公司的TENSOR27型傅里葉變換紅外譜儀對(duì)GO表面官能團(tuán)進(jìn)行定性分析;采用JEM-2010HR 200 kV 透射電子顯微鏡對(duì)GO的形貌及片層進(jìn)行表征。

將氧化石墨超聲分散在蒸餾水中，得到GO懸浮液，用DMSO作為L(zhǎng)-Trp的研究GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 氧化石墨烯的表征

圖3 石墨與氧化石墨烯的(a)紅外光譜與(b)拉曼光譜Fig. 3 (a) FT-IR spectra, (b) Raman spectra of graphite and GO.

由圖4a可以看出，GO為不規(guī)則片狀半透明結(jié)構(gòu),表面有微米級(jí)褶皺,平面結(jié)構(gòu)使其上下面均可接觸目標(biāo)分子，有效提高反應(yīng)效率。圖4b為GO的水溶液，可以看出，GO在水溶液中呈典型的棕黃色，且在水中分散較好，說(shuō)明成功制備了GO。

圖 4 GO的(a)透射電鏡照片和(b)水溶液中的分散效果照片F(xiàn)ig. 4 (a) TEM image of GO and (b) dispersion effect diagram(a′-d′ GO concentration: 0.2， 0.1， 0.05， 0.01 mg·mL-1).

3.2 熒光光譜分析

3.2.1 溶劑對(duì)L-Trp熒光光譜的影響

分別以水和DMSO作為L(zhǎng)-Trp溶劑，研究了L-Trp在不同溶劑中的熒光效應(yīng)。以279 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定不同濃度下L-Trp的熒光強(qiáng)度，從圖5a、5b可見(jiàn)，L-Trp在兩種溶液中均有較強(qiáng)的熒光。隨著溶液中L-Trp濃度的增加，其熒光強(qiáng)度均顯著增加。在濃度相同的情況下，L-Trp在DMSO中的熒光強(qiáng)度較以水做溶劑的熒光強(qiáng)度高5倍左右，作為對(duì)照，測(cè)定了DMSO在λex=279 nm,λem=360 nm下的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)給定條件下，DMSO無(wú)明顯熒光，說(shuō)明DMSO對(duì)L-Trp有熒光增強(qiáng)效應(yīng)，這是由于L-Trp及其衍生物的發(fā)光特性具有很強(qiáng)的微環(huán)境依賴性，其在溶液中的熒光強(qiáng)度取決于溶劑的極性、粘度以及激發(fā)波長(zhǎng)，L-Trp溶于DMSO后，二者之間的基團(tuán)發(fā)生了相互作用，從而增強(qiáng)了L-Trp的熒光強(qiáng)度[17]。

3.2.2 GO對(duì)L-Trp熒光光譜的影響

由圖6可知，在加入GO之前，L-Trp在279 nm光激發(fā)下，其熒光發(fā)射峰在360 nm處(a曲線)，當(dāng)L-Trp的濃度為2×10-5mol·L-1時(shí)，其熒光強(qiáng)度F=1019，固定L-Trp濃度不變，當(dāng)向L-Trp溶液中加入GO溶液后，L-Trp的熒光被極大的猝滅，但發(fā)射峰形及峰位變化不大，隨著GO濃度的增大，熒光強(qiáng)度逐漸減小，猝滅效率逐漸增大，L-Trp熒光的顯著猝滅，表明二者之間發(fā)生了較強(qiáng)烈的相互作用。

圖 5 L-Trp在(a)二甲基亞砜(DMSO)與(b)水溶液中的熒光光譜圖Fig. 5 The fluorescence of L-Trp in (a) DMSO and (b) H2O (a-f: 1×10-4, 5×10-5, 4×10-5, 3×10-5, 2×10-5, 1×10-5 mol·L-1, λex=279 nm, λem=360 nm).

圖 6 不同濃度GO對(duì)L-Trp熒光發(fā)射光譜的影響Fig. 6 Effects of concentrations of GO on fluorescence emission spectra of L-Trp. GO concentration a-f: 0, 0.5×10-5, 1×10-5, 2×10-5, 4×10-5, 6×10-5, 8×10-5, 10×10-5, 12×10-5, 14×10-5, 16×10-5 g·mL-1, L-Trp concentration: 2×10-5 mol·L-1,λex=279 nm, λem=360 nm.

熒光猝滅主要可分為兩種類型，即動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[18]。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑與激發(fā)態(tài)熒光分子之間發(fā)生碰撞而使熒光分子的熒光消失；靜態(tài)猝滅是熒光分子與猝滅劑形成復(fù)合物而使熒光消失。由紫外吸收光譜分析，發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)吸收光譜不發(fā)生變化，而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)吸收光譜發(fā)生變化[19]，從圖7的紫外吸收光譜曲線發(fā)現(xiàn)，GO與L-Trp相互作用后，L-Trp在279 nm處的吸光度顯著增強(qiáng)，而且峰形變寬，可能是由于帶正電荷的L-Trp通過(guò)靜電引力和π-π作用吸附在GO表面，形成了GO-L-Trp復(fù)合物，從而使熒光猝滅，由猝滅后的吸收光譜發(fā)生變化，可初步推斷GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖 7 (a)GO, (b)L-Trp, (c)GO/L-Trp紫外吸收光譜Fig. 7 UV spectra of (a) GO, (b) L-Trp and (c) GO/L-Trp.

要具體判定一種猝滅反應(yīng)屬于靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅，需要計(jì)算出猝滅劑與熒光物質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(kq)、 結(jié)合常數(shù)(K)等。若GO對(duì)L-Trp的猝滅過(guò)程是由于分子之間碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅，應(yīng)符合Stern-Volmer方程[20,21]：

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1) 中，F(xiàn)0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度，[Q] 為猝滅劑濃度，g·mL-1，τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子平均壽命，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于一般生物分子來(lái)說(shuō)，其τ0= 10- 8s，kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)，mL·(g·s)-1，Ksv為Sterm-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，其中：

Ksv=kqτ0

(2)

根據(jù)不同溫度下L-Trp熒光猝滅光譜，可得F0/F-[Q]的Stern-Volmer 關(guān)系圖(圖8)。

圖 8 GO對(duì)L-Trp 熒光猝滅的Stern-Volmer 圖Fig. 8 Stern-Volmer figure of GO on fluorescence quenching to L-Trp.

若該猝滅過(guò)程為彼此之間形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，應(yīng)符合Lineweaver-Burk 方程[17- 18]

(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1[Q]-1

(3)

式(3)中K為GO與L-Trp結(jié)合常數(shù)。

根據(jù)不同溫度下L-Trp熒光猝滅光譜，可得(F0-F)-1-[Q]-1Lineweaver-Burk 關(guān)系圖，見(jiàn)圖9。

圖 9 GO對(duì)L-Trp熒光猝滅的Lineweaver-Burk 圖Fig. 9 Lineweaver-Burk figure of GO on fluorescence quenching to L-Trp.表 1 不同溫度下GO與L-Trp相互作用常數(shù)Table 1 Interaction constants of GO and L-Trp at different temperatures.

t(℃)kSV(mL·g-1)kq(mL·(g·s)-1)r(Stern?Volmer)k(mL·g-1)r(Lineweaver?Burk)256．65×1046．65×10120．99822．03×1050．9978305．74×1045．74×10120．99411．83×1050．9998355．17×1045．17×10120．99771．63×1050．9998

由圖8、9可看出，F(xiàn)0/F與[Q]及(F0-F)-1與[Q]-1線性關(guān)系良好。由圖8、9 及式(1)、(2)、(3)可分別得出不同溫度下GO與L-Trp相互作用的Ksv、kq和K值(表1)。

當(dāng)猝滅過(guò)程為動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)，溫度升高，分子活化能增大，增加了猝滅劑和熒光分子之間的有效碰撞，從而使猝滅速率加快，kq、Ksv均增大( Stern-Volmer 直線斜率增大)，且最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·( mol·s)- 1[22]。而對(duì)于靜態(tài)猝滅，是由于猝滅劑和熒光分子之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移而生成不發(fā)熒光的復(fù)合物。溫度升高，導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性下降，K值減小( Lineweaver-Burk直線斜率增大)。

由圖8、9 和表1 可知, 隨溫度升高, Stern-Volmer 圖直線斜率逐漸減小,kq和Ksv值均減小,在本實(shí)驗(yàn)中猝滅劑GO的單位為g·mL-1,由前文GO的基本結(jié)構(gòu)單元可知，GO的式量遠(yuǎn)大于1 000 g·mol-1，故其熒光猝滅速率常數(shù)kq值遠(yuǎn)大于動(dòng)態(tài)猝滅中的最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·(mol·s)- 1, 這表明GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅不是由碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅。Lineweaver Burk 圖直線斜率增大,K值減小，該熒光猝滅與Lineweaver Burk方程相吻合，由圖8和圖9可知，GO對(duì)L-Trp的熒光猝滅不是由碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅, 而是由于形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。從表1 可看出, GO和L-Trp的結(jié)合常數(shù)K值較大, 說(shuō)明 GO與L-Trp所形成的復(fù)合物十分穩(wěn)定。另外，由GO的紅外光譜圖可知，GO結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、羧基等含氧官能團(tuán)，L-Trp中的氨基與GO中的羧基可部分發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)，L-Trp、GO分子中的氨基、羥基等可以相互作用形成氫鍵，再加上二者分子間的靜電吸引作用以及范德華力的作用，使兩種分子可以緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光猝滅的影響

3.3.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光猝滅的影響

為了考察實(shí)驗(yàn)條件的變化對(duì)熒光猝滅的影響，在實(shí)驗(yàn)中考察了反應(yīng)條件對(duì)熒光猝滅效應(yīng)的影響。圖10顯示了GO與L-Trp經(jīng)不同反應(yīng)時(shí)間后的熒光強(qiáng)度變化值，當(dāng)GO與L-Trp相互作用后，其熒光強(qiáng)度瞬間達(dá)到最低值，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，其熒光信號(hào)強(qiáng)度基本保持不變，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中待二者混合均勻后即可檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

圖 10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光猝滅的影響Fig. 10 Effect of reaction time on the fluorescence quenching.

3.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)熒光猝滅的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還探究了不同反應(yīng)溫度對(duì)熒光猝滅效應(yīng)的影響，其結(jié)果如圖11所示，隨著溫度的升高，猝滅效率逐漸減小，反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度逐漸增大，說(shuō)明隨著溫度的升高，不利于GO與L-Trp形成復(fù)合物，這一結(jié)果與上述Stern-Volmer、Lineweaver Burk方程討論的結(jié)果相一致，更進(jìn)一步說(shuō)明此熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖 11 反應(yīng)溫度對(duì)熒光猝滅的影響Fig. 11 Effect of reaction temperature on the fluorescence quenching.

4 結(jié)論

基于Hummers 法制備氧化石墨，經(jīng)超聲剝離制得GO，將GO作為熒光猝滅劑，考察了其對(duì)L-Trp的猝滅效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GO能有效的猝滅L-Trp的熒光，當(dāng)L-Trp的濃度為2×10-5mol·L-1，GO濃度為16×10-5g·mL-1時(shí)，猝滅效率為95.6%，且猝滅所用時(shí)間較短，幾乎可以在瞬間將其熒光猝滅。其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，作用過(guò)程中兩者發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，形成了復(fù)合物，且結(jié)合常數(shù)較大，說(shuō)明GO對(duì)L-Trp的作用非常牢固。本文對(duì)GO與L-Trp之間的相互作用研究，可為石墨烯材料在生物及其相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供重要的參考數(shù)據(jù)。

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The mechanism of the fluorescence quenching of L-tryptophan by graphene oxide

GONG Qiao-juan1,2， WANG Yong-dong2， YANG Hai-ying1， YUAN Mei-ni3

(1.DepartmentofAppliedChemistry,YunChengUniversity,YunCheng044000,China;2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;3.SchoolofMechatronicsofEngineering,NorthUniversityofChina,Taiyuan030051,China)

Graphene oxide (GO) was prepared by the modified Hummers method and used as a fluorescence quenching reagent of L-tryptophan (L-Trp). The structure of GO was characterized by FT-IR and Raman spectroscopy. The binding mechanism of L-Trp on GO and their reaction were investigated by UV spectroscopy and the fluorescence method. Results show that GO has a strong fluorescence quenching ability for L-Trp. The quenching efficiency is 95.6% for L-Trp with a concentration of 2×10-5mol·L-1when the GO concentration is 16×10-5g·mL-1. The binding constants of L-Trp on GO were 2.03×105, 1.83×105and 1.63×105mL·g-1at 25, 30 and 35 ℃, respectively, as revealed by the Lineweawer-Burk equation, indicating a strong interaction between GO and L-Trp. GO quenches the intrinsic fluorescence of L-Trp by the formation of a complex, and is a static quenching mechanism. The quenching rate constant was 6.65×1012mL·(g·s)-1at 25 ℃ as determined by the Stern-Volmer equation.

Graphene oxide; L- tryptophan; Fluorescence quench

GONG Qiao-juan, Ph. D, Professor. E-mail: gqjuan@163.com

1007-8827(2016)06-0639-07

TQ127.1+1

A

2016-06-27;

2016-10-24

山西省“131”領(lǐng)軍人才工程項(xiàng)目; 山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012011007-1); 運(yùn)城市科技局項(xiàng)目(2060499).

弓巧娟, 博士， 教授. E-mail: gqjuan@163.com

Foundationitem: Financial support from the Science Foundation of “131” Leading talents project of Shanxi Province.; Science Foundation of Shanxi (2012011007-1); Science Foundation of Bureau of Science and Technology of Yuncheng(2060499).