張 鵬

（遼寧省大連普蘭店市中心醫(yī)院骨二科，大連116200）

補(bǔ)腎壯骨方治療大鼠骨質(zhì)疏松癥效果的實(shí)驗(yàn)研究

張 鵬

（遼寧省大連普蘭店市中心醫(yī)院骨二科，大連116200）

目的通過(guò)運(yùn)用自擬補(bǔ)腎壯骨方治療骨質(zhì)疏松癥，觀察大鼠的體重、骨密度、骨生物力學(xué)等一般情況變化，并對(duì)血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標(biāo)影響進(jìn)行研究。方法采用SPF級(jí)雌性大鼠，80只，按體重進(jìn)行分層隨機(jī)分為正常組、模型組、補(bǔ)腎壯骨方治療組、阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組。采用摘除卵巢對(duì)非正常組大鼠進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥造模，正常組和模型組給予1 mL/100 g的生理鹽水，日2次，灌胃；補(bǔ)腎壯骨方治療組給予補(bǔ)腎壯骨中藥湯劑（1 mL/100 g，1 mL含1 g生藥），日2次，灌胃；阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組給予阿侖膦酸鈉溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg藥粉），日2次，灌胃。連續(xù)灌胃3個(gè)月。觀察大鼠股骨重量、骨密度變化、骨生物力學(xué)變化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3等指標(biāo)變化。結(jié)果大鼠股骨重量骨密度變化；骨生物力學(xué)變化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)后，與正常組比較，模型組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)改變明顯（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)腎壯骨中藥治療組、阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組與模型組大鼠比較，均改善明顯（P＜0.05），補(bǔ)腎壯骨方治療組與阿侖膦酸鈉觀察組比較股骨重量（右側(cè)）、骨生物力學(xué)、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3變化明顯（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骨密度變化不明顯（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論補(bǔ)腎壯骨中藥治療骨質(zhì)疏松癥模型大鼠效果明顯，能夠改善大鼠股骨重量、骨密度、骨生物力學(xué)、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等，通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑的促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，骨形成與重建，骨鈣磷代謝。

補(bǔ)腎壯骨方；骨質(zhì)疏松癥；摘除卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型；實(shí)驗(yàn)研究

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是骨科臨床中常見的疾病，其病因復(fù)雜多樣，發(fā)病率較高，尤其中老年人發(fā)生率更高。隨著我國(guó)人口老年化的來(lái)臨，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥將迎來(lái)發(fā)生率的高峰[1]。西醫(yī)僅以補(bǔ)鈣作為主要治療方法，療效不佳。本研究通過(guò)運(yùn)用自擬補(bǔ)腎壯骨方治療骨質(zhì)疏松癥（摘除卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型），觀察大鼠骨密度、骨生物力學(xué)變化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標(biāo)水平的變化，報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，雌性大鼠，80只，體重(200± 20)g，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXI（遼）ISO010-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物（1）補(bǔ)腎壯骨湯是由《十藥神書》中補(bǔ)髓丹和《活人心統(tǒng)》中的河車大造丸化裁而成，主要組成為豬骨髓30 g，紫河車20 g，阿膠20 g，牛膝15 g，杜仲15 g，熟地黃20 g，補(bǔ)骨脂15 g，淫羊藿15 g。所用中藥由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將豬骨髓、紫河車、牛膝、杜仲、熟地黃、補(bǔ)骨脂、淫羊藿等中藥浸泡30 min，煎煮30 min后取湯，加水再次煎煮30 min，再次取湯，將兩次所取湯藥混合，加熱，濃縮，加入阿膠粉。所有制備中藥湯劑存放于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

（2）阿侖膦酸鈉（福善美）：片劑，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20080073。

1.3 主要試劑及設(shè)備OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D公司，批號(hào)：201409）。無(wú)水乙醇、甲醛、戊巴比妥鈉等試劑，所有試劑由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。酶標(biāo)儀(奧地利)型號(hào)：Anthos 2010；37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊醫(yī)療設(shè)備公司)型號(hào):HXP-9052MBE；離心機(jī)(法國(guó)Jouan)型號(hào):C4-12；微量移液器(美國(guó)熱電)；電子秤(上海精密儀器有限公司)型號(hào):JY5022；雙能X線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)GE公司）型號(hào)：LUNAR-Prodigy生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(美國(guó)MTS-858型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法根據(jù)大鼠體重，取3%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射，注射標(biāo)準(zhǔn)為0.2 ml/100 g。麻醉后進(jìn)行卵巢摘取，全程無(wú)菌操作，于大鼠劍突下約1.5 cm處，沿腹白線進(jìn)行縱向切割，切口約2 cm，剝離腹部肌肉及腹膜，充分暴露腹腔，確定子宮下角位置并向上找尋卵巢，結(jié)扎輸卵管及周圍血管組織，防止出血。正常組切除卵巢周圍脂肪組織，其他組摘除雙側(cè)卵巢。止血、縫合、并做好預(yù)防感染（術(shù)后肌肉注射20萬(wàn)單位的青霉素，連續(xù)5天），擦涂云南白藥于手術(shù)切口。造模后觀察1周，期間自由飲水進(jìn)食，一周后進(jìn)行正式藥物實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及處理采用SPF級(jí)雌性大鼠，80只，于通風(fēng)、潔凈、安靜的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間自由飲水進(jìn)食，一周后進(jìn)行稱重。按體重進(jìn)行分層隨機(jī)分為正常組、模型組、補(bǔ)腎壯骨方治療組、阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組，造模成功后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。正常組和模型組給予1 mL/100g的生理鹽水，日2次，灌胃；補(bǔ)腎壯骨方治療組給予補(bǔ)腎壯骨中藥湯劑（1 mL/100 g，1 mL含1 g生藥），日2次，灌胃；阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組給予阿侖膦酸鈉溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg藥粉），日2次，灌胃。連續(xù)灌胃3個(gè)月。

2.3 觀察指標(biāo)股骨重量：實(shí)驗(yàn)結(jié)束停藥24 h后，處死大鼠，摘取大鼠右側(cè)股骨，稱取重量。骨密度：采用雙能X線骨密度測(cè)定儀，對(duì)取材進(jìn)行BMD分析。骨生物力學(xué)變化：應(yīng)用MTS-858型生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)進(jìn)行骨生物力學(xué)的檢測(cè)。大鼠血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3：取大鼠股動(dòng)脈血液5 mL左右，送往遼寧中醫(yī)藥大學(xué)血液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行離心，分離血清和紅細(xì)胞，采用ELISA法進(jìn)行血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠股骨重量骨密度變化；骨生物力學(xué)變化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)后，與正常組比較，模型組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)改變明顯（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)腎壯骨中藥治療組、阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物觀察組與模型組大鼠比較，均改善明顯（P＜0.05），補(bǔ)腎壯骨方治療組與阿侖膦酸鈉觀察組比較股骨重量（右側(cè)）、骨生物力學(xué)、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3變化明顯（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骨密度變化不明顯（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1 股骨重量（右側(cè)）具體結(jié)果見表1。

表1 股骨（右側(cè)）指數(shù)變化

3.2 骨密度具體結(jié)果見表2。

表2 骨密度變化（±s）

表2 骨密度變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數(shù)股骨上端股骨下端正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 0.168±0.009 0.131±0.012△0.165±0.015☆0.165±0.011☆0.184±0.016 0.141±0.013△0.190±0.008☆0.185±0.019☆股骨全部0.147±0.013 0.126±0.018△0.153±0.013☆0.153±0.012☆

3.3 骨生物力學(xué)具體結(jié)果見表3。

表3 骨生物力學(xué)變化（±s）

表3 骨生物力學(xué)變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數(shù)最大載荷（N）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 135.03±4.71 83.06±5.03△130.05±4.70☆114.02±4.96☆剛度（N/mm）230.58±6.92 155.85±7.64△195.95±7.12☆177.78±8.21☆

3.4血清OCN、PICP的影響具體結(jié)果見表4。

表4 血清OCN、PICP變化（s）

表4 血清OCN、PICP變化（s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數(shù)OCN（ng/ml）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 6.412±1.031 4.053±1.132△6.351±1.011☆6.741±0.993☆PICP（ng/ml）9.655±0.899 8.249±0.959△9.901±0.791☆9.255±0.949☆

3.5 血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3的影響具體結(jié)果見表4。

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3變化（±s）

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數(shù)25(OH)D3（ng/L）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 429.88±15.45 415.07±23.01 447.22±39.87 439.04±20.55 1,25(OH)2D3（ng/ml）586.32±38.19 493.99±55.01▲604.03±42.99★590.11±36.74★

4 討論

本研究結(jié)果表明：①股骨重量（右側(cè)）提示補(bǔ)腎壯骨方具有補(bǔ)腎生精壯骨的作用，能夠充實(shí)腎臟，壯實(shí)股骨。腎主骨，補(bǔ)腎壯骨方中還有補(bǔ)腎中藥，故腎氣與腎精充盛，精能生髓，髓能壯骨，腎精盛則股骨壯。②骨密度的檢測(cè)能夠充分反映機(jī)體內(nèi)骨礦物的含量，直接、客觀的判斷藥物療效[2]。補(bǔ)腎壯骨湯能夠增加機(jī)體內(nèi)骨礦物質(zhì)的含量，增加機(jī)體內(nèi)鈣質(zhì)的含量。③骨生物力學(xué)為評(píng)價(jià)骨質(zhì)量的重要指標(biāo)，能夠充分反映骨質(zhì)量的水平。摘除大鼠雙側(cè)卵巢后，性激素生成代謝紊亂，膠原纖維的合成減少，骨形成能力下降，骨力學(xué)強(qiáng)度下降、脆性上升，易發(fā)骨折[3]。補(bǔ)腎壯骨湯治療組效果顯著，可能參與抑制骨吸收、促進(jìn)骨增殖、增加膠原蛋白。④OCN是一種非膠原蛋白質(zhì)激素樣多肽，是非增殖期成骨細(xì)胞合成分泌的，其水平和骨組織水平呈正相關(guān)關(guān)系，能夠直接反應(yīng)骨細(xì)胞的活性和相關(guān)代謝變化[4]。阿侖膦酸鈉陽(yáng)性藥物對(duì)照組與補(bǔ)腎壯骨湯能夠影響機(jī)體骨細(xì)胞的改變和鈣的代謝，改善骨骼發(fā)育。⑤PICP能夠反映OP病理改變、療效機(jī)制、診斷疾病、判斷疾病發(fā)展等[5]。補(bǔ)腎壯骨湯能夠改善PICP的水平，提高骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成，抑制破骨細(xì)胞，從而達(dá)到抗OP的效果。⑥25-(OH)D3水平能夠準(zhǔn)確反映機(jī)體內(nèi)維生素D的水平，25-(OH)D3也和BMD呈正相關(guān)關(guān)系[6]。⑦1，25-(OH)2D3是腎臟近端腎小管內(nèi)經(jīng)過(guò)25-(OH)D-1α-羥化酶的又一次轉(zhuǎn)化形成的[7]。另外胎盤和巨噬細(xì)胞也能夠合成少量的1，25-(OH)2D3[8]。1，25-(OH)2D3能夠同時(shí)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，同時(shí)參與骨形成和骨代謝的兩個(gè)變化，對(duì)骨具有雙向調(diào)節(jié)功用，若其發(fā)生改變?cè)斐晒俏盏脑龆鄤t平衡破壞，發(fā)生OP。補(bǔ)腎壯骨湯能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3水平，改善機(jī)體體內(nèi)骨形成與吸收的平衡，達(dá)到治療目的。

綜上所述，《十藥神書》中補(bǔ)髓丹和《活人心統(tǒng)》中的河車大造丸化裁而成的自擬補(bǔ)腎壯骨湯能夠改善骨質(zhì)疏松大鼠各項(xiàng)指標(biāo)，從不同角度、不同途徑起到治療作用，值得應(yīng)用于臨床。

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Experimental Study on the Effect of Bushen Zhuanggu Decoction in the Treatment of Osteoporosis Rats

ZHANG Peng
(Department of Orthopedics,Pulandian Central Hospital,Liaoning Province,Dalian 116200,China)

Objective By using self-made Bushen Zhuanggu decoction in the treatment of osteoporosis,to observe generally changes of rats weight,bone mineral density,bone biomechanics,and to study the indexes of Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3etc.Methods 80 female rats of SPF,according to body weight,were randomized to normal group,model group,Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate sodium positive drug observation group.The introduction of ovariectomized rats in the non normal group of osteoporosis rats,normal group and model group were given physiological saline 1ml/ 100g,2 times a day,gavage.Bushen Zhuanggu decoction treatment group was given Bushen Zhuanggu Chinese medicine decoction (1ml/100g,1ml contains 1g crude drug),2 times a day,gavage.Alun phosphonic acid sodium positive drug observation group was treated with alendronate sodium solution(1ml/100g,1ml contains 0.74mg powder),2 times a day,gastric lavage.The treatment continued irrigation for 3 months.The changes of the weight,bone mineral density,bone biomechanical changes,serum OCN,PICP, 25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3and other indexes in rats were observed.Results The changes of rat femur weight bone density,bone biomechanics,serum OCN,PICP,25-(OH)D31,25-(OH)2D3index after experiment were compared with the normal group,the indexes of model group rats changed significantly(P＜0.05),and there was statistical significance.The Bushen Zhuanggu treatment group and the alendronate positive drug observation group was compared with the model group,and the improvement was significant (P＜0.05).Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate observation group was compared the weight of femur (right),bone biomechanics,serum OCN,serum PICP,25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3,changes were significant(P＜0.05),and there was statistical significance,but bone density did not change significantly(P＞0.05),there was no statistical significance. Conclusion The Bushen Zhuanggu Chinese medicine in the treatment of osteoporosis model rats has obvious effect,can improve the rat bone weight,bone density,bone biomechanics,Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3,through multiple targets and multiple ways to promote the proliferation of bone cells,bone formation and reconstruction,bone calcium and phosphorus metabolism.

Bushen Zhuanggu decoction;osteoporosis;ovariectomized rat model of osteoporosis;experimental study

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.066

1672-2779（2016）-24-0145-03

張文娟本文校對(duì)：侯長(zhǎng)福

2016-08-11）