馮麗帥++王倩倩++馬旭++魏麗++王建波

[摘要] 目的 探討內質網應激相關蛋白1（serp1）對體外過氧化氫誘導大鼠血管內皮細胞凋亡的保護作用。 方法 體外培養(yǎng)的大鼠血管內皮細胞均勻種于6孔板內，分為空質粒組、空質粒+過氧化氫組、serp1質粒組、serp1質粒+過氧化氫組。根據(jù)不同的實驗目的各組加入不同濃度的過氧化氫。用PI/hochest熒光染色法對400 μmol/L過氧化氫組進行細胞凋亡的檢測；采用細胞劃痕實驗檢測100 μmol/L過氧化氫組進行傷口修復情況；采用Western blot法觀察serp1過表達對GLP-1R表達的影響。 結果 serp1質粒+過氧化氫組內皮細胞凋亡率明顯低于空質粒+過氧化氫組，而修復率卻明顯高于轉染空質粒過氧化氫組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；serp1質粒+過氧化氫組GLP-1R表達明顯高于空質粒+過氧化氫組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 serp1過表達可抑制過氧化氫引起的血管內皮細胞凋亡，并促進氧化應激狀態(tài)下血管內皮細胞的增值修復，其作用機制可能與serp1促進氧化應激狀態(tài)下血管內皮細胞的GLP-1受體表達有關。

[關鍵詞] 內質網應激相關蛋白1；GLP-1受體；血管內皮細胞

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）10（a）-0013-04

Protective effect of serp1 on endothelial cells induced by hydrogen peroxide

FENG Lishuai WANG Qianqian MA Xu WEI Li WANG Jianbo

The Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200023， China

[Abstract] Objective To investigate endoplasmic reticulum stress associated protein 1 （serp1）'s protective effect on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide. Methods Rat vascular endothelial cells were planted in 6-well plates and then divided into the empty plasmid transfection group， empty plasmid + hydrogen peroxide group， serp1 plasmid group， serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， different concentrations of H2O2 were added according to different experimental objective. Fluorescence PI/hochest stain were used to detect the cell apoptosis among group treated with 400 μmol/L hydrogen peroxide； and cell scratch test were used to observe wound repairing among group treated with 100 μmol/L hydrogen peroxide； the GLP-1 receptor expression were measured by Western blot. Results Compared with empty plasmid + hydrogen peroxide group， endothelial cells apoptosis rate was significantly lower among the serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， the repairing rate was significantly higher， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the expression of GLP-1 receptor in serp 1 plasmid + hydrogen peroxide group was obviously higher than that of empty plasmid + hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Serp1 can inhibit the apoptosis and improve the repair capacity of vascular endothelial cells under oxidative stress state， the mechanism may attribute to the promotion of GLP-1 receptor expression due to the over-expression of serp1.

[Key words] SERP1； GLP-1 receptor； Vascular endothelial cell

隨著現(xiàn)代人生活方式、工作壓力與環(huán)境因素的改變，肥胖、糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率逐年上升。而體內氧化應激反應則是解釋這些慢性疾病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[1-4]。內質網應激作為體內氧化應激最重要的形式，被證明參與了各種疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生[5]。而心血管疾病作為許多慢性疾病常見的并發(fā)癥，若不積極治療干預，將嚴重影響患者的預后，對患者的生命安全造成極大威脅[6-8]。血管內皮細胞因其具有血管防護屏障及通過釋放血管活性因子——一氧化氮（NO）改善微循環(huán)的功能，氧化應激對其凋亡的的誘導作用被認為在各種類型的心血管事件中發(fā)揮了重要作用。故對可能發(fā)生心血管事件高危人群進行有效且有針對性的防治，對改善患者預后及生活質量的提高意義重大。Serp1作為可緩解內質網應激損害的未折疊蛋白質應答（unfolded protein response，UPR）反應的重要伴侶蛋白之一，被證實在緩解內質網應激導致的組織凋亡中發(fā)揮了重要作用[9]。過氧化氫作為體外實驗中誘發(fā)氧化應激反應的常用試劑，將應用于本次實驗中檢測serp1對氧化應激反應的緩解作用。Real-time PCR及Western blot實驗分別從基因及蛋白水平證實serp1在血管內皮細胞中的表達，本研究進一步對serp1過表達在氧化應激作用下對機體的保護作用加以驗證及這一過程中所涉及機制的探討。

1 對象與方法

1.1 對象

大鼠血管內皮細胞（RAOEC，ATCC）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；PCMV6-SERP1-tGFP質粒、PCMV6-empty質粒（美國oriGENE公司）；熒光倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）、一抗GLP-1R（美國Novus公司）、一抗serp1（美國Abcam公司）、一抗β-actin（美國Cell Signaling公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Opti-MEM（美國GIBCO公司）；BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 內皮細胞轉染及藥物處理

將處于最佳生長期的內皮細胞接種于6孔板中，用未添加抗生素的含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。在6孔板上標記空質粒組；空質粒+過氧化氫組；serp1質粒組、serp1質粒+過氧化氫組，以便后續(xù)轉染及藥物處理等實驗操作。待細胞達到80%左右，開始轉染。先在Nanodrop 2000分光光度儀上測定PCMV6-SERP1-tGFP質粒和PCMV6-empty質粒的濃度，配制每孔所需的轉染試劑量；于一個EP管內加入250 μL Opti-MEM 后再加入2 μg PCMV6-empty或PCMV6-SERP1-tGFP質粒，混勻，室溫靜置5 min；另一EP管內加入250 μL Opti-MEM 后再加入5 μL Lipofectamine 2000；兩EP管1∶1混勻，室溫孵育30 min，在孵育期間，將待轉染的6孔板換液后，將混合液按6孔板上的標記分別相應待轉染的孔板內。轉染4 h后吸掉原培養(yǎng)液，換新鮮的完全培養(yǎng)基，放于5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染時間達24 h后，按6孔板上事先做好的標記分別加入400 μmol/L或100 μmol/L的過氧化氫。24 h后將不同濃度過氧化氫處理的血管內皮細胞分別用PI/Hochest雙染色法和細胞劃痕實驗檢測其凋亡和增殖情況。每次實驗至少重復3次。

1.3 細胞凋亡檢測

PI/Hochest雙染色是用來檢測細胞凋亡的一種方法，PI將晚期凋亡的細胞染色成紅色，Hochest將正常細胞核染成均勻藍色。本研究將熒光顯微鏡下紅光與藍光個數(shù)的比值記為內皮細胞的凋亡率進行觀察。將上述濃度為400 μmol/L的過氧化氫處理的一組細胞吸棄上清后用PBS清洗細胞1次后，在每孔細胞中加入1 mL PBS；再在每孔中加入1 mg/mL的Hochest 20 μL和50 mg/mL的PI染色液1 μL，置于脫色搖床避光搖勻后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察細胞凋亡情況，記錄紅光、藍光個數(shù)并將其比值記作細胞凋亡率。每次實驗至少重復3次。

1.4 細胞劃痕實驗

先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔穿過5條線。用上述轉染方法轉染24 h后，用濃度為100 μmol/L的過氧化氫處理相應孔板中的細胞后，用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃3條痕，槍頭垂直，不同孔之間使用同一只槍頭。PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，每組中均加入新鮮完全血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)；按0 h及24 h時間點取樣，拍照；統(tǒng)計方法：使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6～8條水平線，計算細胞間距離的均值，將0 h與24 h細胞間距的差值與0 h細胞間距的比值判定細胞增殖的修復率。每次實驗至少重復3次。

1.5 GLP-1R表達

采用Western blot法。對上述濃度為100 μmol/L過氧化氫處理的空質粒+過氧化氫組和serp1質粒+過氧化氫組兩組蛋白提取后，用BCA試劑盒測定蛋白含量后，各取30 μg蛋白進行電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量的不同切取不同分子量的條帶，一抗4℃孵育過夜：β-actin、serp1、GLP-1R；次日回收一抗，TBST洗膜10 min×3次；相應二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次。加入ECL發(fā)光劑，化學發(fā)光成像系統(tǒng)自動提取結果，應用Image J軟件測定條帶灰度值，以目標條帶與內參條帶灰度的比值作為上述各蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 內皮細胞凋亡率的比較

按上述方法轉染及藥物處理24 h后，空質粒組和空質粒+過氧化氫組血管內皮細胞的凋亡率分別為（3.54±0.78）%和（35.89±5.26）%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示400 μmol/L的過氧化氫引起內皮細胞凋亡作用明顯。serp1質粒組與serp1質粒+過氧化氫組血管內皮細胞凋亡率分別為（3.13±0.98）%和（12.32±1.26）%，與空質粒+過氧化氫組比較，serp1質粒+過氧化氫組血管內皮細胞凋亡率顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示serp1過表達能緩解過氧化氫誘發(fā)內皮細胞凋亡。

2.2 內皮細胞增殖修復率的比較

按上述方法轉染及藥物處理24 h后，空質粒組和空質粒+過氧化氫組血管內皮細胞的增殖修復率分別為（69.08±7.78）%和（30.86±5.26）%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示100 μmol/L的過氧化氫對內皮細胞增殖修復抑制作用明顯。serp1質粒組與serp1質粒+過氧化氫組血管內皮細胞的增殖修復率分別為（73.58±5.19）%和（55.75±3.13）%，與空質粒+過氧化氫組比較，serp1質粒+過氧化氫組血管內皮細胞增值修復率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示serp1過表達能提高內皮細胞在氧化應激下的增殖活性。見圖2。

2.3 Serp1轉染與GLP-1R表達量的變化

氧化應激條件下，在通過serp1質粒轉染對血管內皮細胞進行serp1的過表達時，可在蛋白水平上檢測到GLP-1R的表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示serp1可促進氧化應激狀態(tài)下GLP-1R的表達。

3 討論

隨著內質網應激與心血管系統(tǒng)疾病的關系日益明確，制訂能夠有效降低心血管事件的方案成為迫切需要共同攻克的難題。通過文獻復習總結出，作為UPR的重要伴侶蛋白之一，serp1通過參與蛋白轉錄后修飾，來緩解炎性反應，最終達到維持細胞的活性的目的[10]。而這一過程中所涉及的機制，主要與serp1通過參與胞內及胞膜蛋白的糖基化來緩解內質網應激過多未折疊蛋白應激壓力而抑制了疾病的進一步發(fā)展的功能有關[11-14]。通過課題組前期研究，我們已經通過免疫共沉淀及免疫熒光實驗證實，在HepG2肝癌細胞內，serp1和GLP-1受體可在細胞膜上結合，且serp1可以通過促進GLP-1受體糖基化而影響其功能。受到啟發(fā)，本研究在內皮細胞上通過蛋白質免疫印跡實驗證明亦有這兩種蛋白的表達，且在體外應激環(huán)境下，本研究發(fā)現(xiàn)過表達serp1可增加GLP-1受體的表達。這種現(xiàn)象發(fā)生的機制可能與氧化應激條件下，對serp1的過表達可使血管內皮細胞活性增加，從而間接改善了GLP-1受體的表達有關；肖元元等[15]也發(fā)現(xiàn)與氧化應激的發(fā)生關系密切的肝細胞脂肪變也可導致GLP-1R表達量降低；除了通過間接影響GLP-1R的表達，serp1還可以通過參與GLP-1R轉錄后的糖基化修飾而介導GLP-1R下游對微循環(huán)的改善有重大意義的相關信號通路的傳導：GLP-1R的激活已被證明可減少凋亡因子的產生而起到維持細胞活性的作用，其表達減少與許多疾病的發(fā)生密切相關；另外，在內皮細胞上與其配體結合后，GLP-1R介導的信號通路可通過激活eNOS，而產生使血管擴張的NO，這對降低心血管事件的發(fā)生意義重大[16-18]。目前，GLP-1受體激動劑已廣泛應用于臨床，來治療肥胖及2型糖尿病等慢性疾病，但其受體激動劑因胃腸道、神經系統(tǒng)反應等副作用因素在血管并發(fā)癥的防治方面靶向性不夠，具有一定臨床應用的局限性。本研究已經通過內皮細胞凋亡和增殖修復實驗證實，增加胞內serp1表達可改善應激狀態(tài)下細胞活性及胞膜上GLP-1R表達；由于serp1與GLP-1R的結合主要發(fā)生在細胞膜上，外源藥物性（胞外）serp1的加入能否對氧化應激下內皮細胞凋亡率、GLP-1R表達量及其與之配體結合后下游信號通路的傳導產生影響，從國家倡導的“轉化醫(yī)學”的新理念出發(fā)，后續(xù)實驗將繼續(xù)對此假設進行探索、驗證，這將對內皮細胞GLP-1R表達下調的心血管疾病高危人群防治靶向藥物開發(fā)具有重要指導意義。

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（收稿日期：2016-06-30 本文編輯：任 念）