翟玉娥，田清武，趙希芹，趙鵬，孫樹凱，岳康，翟木緒

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266555；2淄博市婦幼保健院)

·基礎(chǔ)研究·

絕經(jīng)后體脂異常分布對(duì)雌性SD大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子及TNF-α表達(dá)的影響

翟玉娥1，田清武1，趙希芹1，趙鵬1，孫樹凱1，岳康1，翟木緒2

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266555；2淄博市婦幼保健院)

目的 探討絕經(jīng)后體脂異常分布對(duì)雌性SD大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子(包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素)及TNF-α表達(dá)的影響。方法 選擇6周齡雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、去卵巢組和去卵巢高脂組(OVXH組)各10只，去卵巢組、OVXH組切除雙側(cè)卵巢制備去卵巢去勢(shì)(絕經(jīng))模型，假手術(shù)組僅摘除腹腔內(nèi)與卵巢體積相當(dāng)?shù)闹窘M織。術(shù)后1周，假手術(shù)組和去卵巢組給予普通飼料喂養(yǎng)，OVXH組給予高脂飼料喂養(yǎng)。連續(xù)干預(yù)12周后，麻醉大鼠迅速剝離內(nèi)臟脂肪組織，分別采用免疫組化染色法和RT-PCR法檢測(cè)各組脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，去卵巢組和OVXH組內(nèi)臟脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)降低，脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05或0.01)。與去卵巢組相比，OVXH組內(nèi)臟脂肪組織抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P均<0.05)。結(jié)論 去卵巢后體脂分布異常大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的表達(dá)顯著增強(qiáng)，瘦素表達(dá)顯著減弱，可能與絕經(jīng)后代謝綜合征的發(fā)病有關(guān)。

絕經(jīng)；代謝綜合征；脂肪組織；脂肪因子；胰島素抵抗；腫瘤壞死因子α

絕經(jīng)后女性存在脂肪組織再分布的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為體脂趨于上半身型分布。這種體脂再分布可導(dǎo)致絕經(jīng)后女性代謝綜合征和肥胖癥的發(fā)病率增高，其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)甚至高于同齡男性[1,2]，嚴(yán)重影響絕經(jīng)后女性的身心健康。研究證實(shí)，絕經(jīng)后女性雌激素的缺乏與其內(nèi)臟脂肪堆積密切相關(guān)[3,4]，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。2015年3～11月，我們對(duì)雌性SD大鼠去卵巢模擬絕經(jīng)后模型，然后給予高脂飲食模擬絕經(jīng)后體脂分布異常狀態(tài)，觀察大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子(包括脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素)及TNF-α的表達(dá)變化，探討絕經(jīng)后體脂異常分布狀態(tài)對(duì)絕經(jīng)后女性代謝綜合征的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 6周齡SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由青島藥品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，在室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)。高脂飼料配方為普通飼料68%、豬油10%、蛋黃粉10%、蔗糖10%、膽固醇2%[5]。TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)公司)；Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、Super Real熒光定量PCR(SYBR Green)試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)；兔抗鼠瘦素單克隆抗體、兔抗鼠脂聯(lián)素抗體、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；兔抗鼠抵抗素單克隆抗體(英國(guó)Biorbyt公司)；山羊抗兔二抗PV-6001、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；葡萄糖(FBS)、TC、TG、LDL-C、HDL-C(北京利德曼公司)；游離脂肪酸(NEFA，浙江東甌生物工程公司)。

1.2 模型構(gòu)建、分組及干預(yù)方法 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組10例、手術(shù)組20例。手術(shù)前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。手術(shù)組在無(wú)菌條件下經(jīng)腰背部雙側(cè)切口進(jìn)入腹腔，切除雙側(cè)卵巢后分層縫合切口，構(gòu)建去卵巢去勢(shì)(絕經(jīng))模型。假手術(shù)組打開腹腔后，摘除腹腔內(nèi)與卵巢體積相當(dāng)?shù)闹窘M織，縫合切口。術(shù)后1周美藍(lán)染色觀察陰道上皮細(xì)胞，如無(wú)動(dòng)情周期變化則確定去勢(shì)成功，術(shù)后1周開始干預(yù)。手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為去卵巢組、去卵巢+高脂飲食組(OVXH組)各10只。假手術(shù)組、去卵巢組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，OVXH組給予高脂飼料喂養(yǎng)模擬絕經(jīng)后體脂異常分布狀態(tài)，連續(xù)12周，每周稱體質(zhì)量1次，自由進(jìn)食和飲水。12周后OVXH組體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪指數(shù)均明顯高于去卵巢組，血清LDL-C和NEFA水平均明顯高于假手術(shù)組，確定存在絕經(jīng)后體脂異常分布狀態(tài)。

1.3 樣品采集 12周后，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉各組大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)，迅速剝離內(nèi)臟脂肪組織，速凍于液氮中，隔日移入-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取各組內(nèi)臟脂肪組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋制成蠟塊。常規(guī)石蠟切片，梯度脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，3%過(guò)氧化氫10 min滅活內(nèi)源性酶。山羊血清工作液封閉，分別加稀釋好的一抗瘦素(1∶300)、脂聯(lián)素(1∶300)、抵抗素(1∶200)、TNF-α(1∶300)37 ℃孵育1 h。PBS清洗后加二抗PV-6001，37 ℃30 min，PBS清洗后加DAB顯色1 min，清洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察，拍照，灰度分析采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件。

1.5 內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。提取內(nèi)臟脂肪組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)確定總RNA濃度及純度。嚴(yán)格按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明，合成cDNA第一鏈。瘦素引物序列：正義鏈5′-AGCAGCTGCAAGGTCCAAG-3′，反義鏈5′-CCGACTGCGTGTGTGAAATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度197 bp。脂聯(lián)素引物序列：正義鏈5′-ACAAGGCCGTTCTCTTCACC-3′，反義鏈5′-ACACTTGGAGCCAGACTTGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度111 bp。抵抗素引物序列：正義鏈5′-TCATGCCCAGAACCGAGTTG-3′，反義鏈5′-GGCTTCATCCATGGGACACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度148 bp。TNF-α引物序列：正義鏈5′-GCTCCCTCTCATCAGTTCCA-3′，反義鏈5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度102 bp。β-actin引物序列：正義鏈5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反義鏈5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度165 bp。取2 μL合成的cDNA產(chǎn)物及相應(yīng)的上下游引物加入SuperReal PreMix Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，總反應(yīng)體系為20 μL ，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以β-actin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參來(lái)校正目的基因的表達(dá)量，每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，取平均值，結(jié)果以2-ΔΔCT表示。RT-PCR引物序列由上海生工生物工程技術(shù)公司設(shè)計(jì)、合成。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α蛋白表達(dá)比較 瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α均在脂肪細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，棕黃色顆粒散在分布，細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)。與假手術(shù)組相比，去卵巢組和OVXH組內(nèi)臟脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)降低，脂聯(lián)素、抵抗素及TNF-α蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05或<0.01)。與去卵巢組相比，OVXH組內(nèi)臟脂肪組織抵抗素及TNF-α蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P均<0.05)。見表1。

表1 各組內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05，#P<0.01；與去卵巢組相比，△P<0.05。

2.2 各組內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α mRNA表達(dá)比較 去卵巢組和OVXH組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組(P<0.05或<0.01)，OVXH組內(nèi)臟脂肪組織抵抗素和TNF-α的mRNA表達(dá)水平均高于去卵巢組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組內(nèi)臟脂肪組織瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α mRNA表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05，△P<0.01；與去卵巢組相比，#P<0.05。

3 討論

絕經(jīng)后女性超重和肥胖特別是中心性肥胖的發(fā)病率顯著升高，這種絕經(jīng)后女性脂肪組織的再分布可促進(jìn)一系列代謝性疾病的發(fā)生，特別是使代謝綜合征患病率顯著增加[6]，與之相對(duì)應(yīng)的心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也顯著增高。絕經(jīng)后女性雌激素缺乏與絕經(jīng)后體脂增加、體脂分布密切相關(guān)[7]。有研究顯示，雌激素缺乏可通過(guò)影響糖脂代謝關(guān)鍵酶的活性，以及調(diào)控胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同環(huán)節(jié)，進(jìn)而誘導(dǎo)或加重胰島素抵抗[8～10]。此外，雌激素缺乏可直接或間接作用下丘腦，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控機(jī)體物質(zhì)和能量代謝[11]，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肥胖和代謝綜合征的易感性。胰島素抵抗是代謝綜合征發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，與代謝有關(guān)的炎癥因子增多是代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。脂肪組織作為一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，在胰島素抵抗、代謝綜合征的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。肥胖可造成脂肪組織及肝臟等臟器的脂肪堆積和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量的促炎因子和脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α、IL-6等，這些細(xì)胞因子可通過(guò)影響攝食中樞和調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素敏感性，干擾包括胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路在內(nèi)的多種代謝通路，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[12～16]。

瘦素主要由白色脂肪組織合成和分泌的，其最主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體的能量平衡。當(dāng)機(jī)體脂肪含量上升時(shí)，脂肪組織可分泌大量瘦素，激活下丘腦-神經(jīng)肽通路，進(jìn)而發(fā)揮減低食欲、增加耗能、降低體質(zhì)量的作用。研究顯示，雌激素可提高大鼠血液循環(huán)中瘦素和脂肪組織中瘦素的表達(dá)，從而起到抑制食欲，減少大鼠攝食量的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢組和OVXH組內(nèi)臟脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)降低，提示去卵巢后大鼠內(nèi)臟脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)明顯減弱，可能與去卵巢后造成的性激素水平降低有關(guān)，與Fungfuang等[18]研究一致。

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，參與了血脂、血糖代謝以及炎癥病理過(guò)程，在代謝綜合征及拮抗動(dòng)脈粥樣硬化方面有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性血清脂聯(lián)素水平顯著高于絕經(jīng)前女性，無(wú)論絕經(jīng)與否，肥胖者均具有較低的脂聯(lián)素水平，提示血清低脂聯(lián)素與代謝綜合征相關(guān)組分密切相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢組、OVXH組大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，且OVXH組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá)高于去卵巢組，去卵巢和高脂飲食誘導(dǎo)大鼠模型脂肪組織脂聯(lián)素呈高分泌模式，這與絕經(jīng)后女性血清低脂聯(lián)素水平不一致[19]，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

抵抗素是由白色脂肪特異分泌的一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)。抵抗素可通過(guò)作用于胰島素受體和胰島素受體底物、上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑降低組織對(duì)胰島素的敏感性，從而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[20]。絕經(jīng)后代謝綜合征女性抵抗素水平顯著增高，特別是與血脂異常和中心型肥胖密切相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢組、OVXH組大鼠內(nèi)臟脂肪組織抵抗素蛋白及mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，且OVXH組抵抗素蛋白及mRNA表達(dá)高于去卵巢組，提示去卵巢大鼠體脂分布異?？赏ㄟ^(guò)脂肪組織抵抗素的高表達(dá)，以降低組織胰島素敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗，參與代謝綜合征的發(fā)生。

TNF-α是一種多功能的細(xì)胞因子，它除了激活白細(xì)胞，介導(dǎo)內(nèi)毒素性休克、調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)外，脂肪組織TNF-α的高表達(dá)與胰島素抵抗、BMI密切相關(guān)。研究顯示，脂肪細(xì)胞分泌的TNF-α進(jìn)入血液后可以通過(guò)胰島素受體抑制酪氨酸激酶的活性，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，導(dǎo)致胰島素抵抗[22]。無(wú)論男女，代謝綜合征患者血清中TNF-α的水平明顯增高[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢組、OVXH組大鼠內(nèi)臟脂肪組織TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，且OVXH組內(nèi)臟脂肪組織TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)高于去卵巢組，提示去卵巢大鼠體脂分布異?？赏ㄟ^(guò)脂肪組織TNF-α高表達(dá)，誘導(dǎo)胰島素抵抗，參與代謝綜合征的發(fā)生。

綜上所述，去卵巢后雌性大鼠可出現(xiàn)體脂分布異常，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的表達(dá)顯著增強(qiáng)，瘦素表達(dá)顯著減弱，高脂飲食可進(jìn)一步增加對(duì)以上脂肪因子的影響，提示絕經(jīng)后的體脂分布異?？蓪?dǎo)致內(nèi)臟脂肪組織的脂肪因子及TNF-α表達(dá)異常，可能與絕經(jīng)后代謝綜合征的發(fā)病有關(guān)。

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山東省青島經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)重點(diǎn)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-1-83)。

翟木緒(E-mail: mxzhai@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.008

R589.2；R711.5

A

1002-266X(2016)46-0031-04

2016-03-27)