張龍 ，王景峰，劉寶平，鄭鐵鋼

(1 河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口075000；2 中國(guó)人民解放軍第二五一醫(yī)院)

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骨肉瘤組織中XIAP和NF-κB的表達(dá)變化及意義

張龍1，王景峰1，劉寶平2，鄭鐵鋼2

(1 河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口075000；2 中國(guó)人民解放軍第二五一醫(yī)院)

目的 觀察X連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)和核因子κB(NF-κB)在骨肉瘤組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 收集36例骨肉瘤患者和20例骨軟骨瘤患者的瘤組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)組織中XIAP和NF-κB的表達(dá)，并分析二者與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用Spearman秩相關(guān)對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 骨肉瘤組織和骨軟骨瘤組織中XIAP的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.4%(25/36)和0(0/20)，NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.2%(26/36)和15.0%(3/20)。兩者比較，P均<0.01。XIAP和NF-κB的表達(dá)與骨肉瘤患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及病理分型無(wú)關(guān)(P均>0.05),而與Enneking分期、分化程度、軟組織侵犯及轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)；XIAP和NF-κB在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.396,P<0.05)。結(jié)論 XIAP和NF-κB在骨肉瘤組織中均表達(dá)升高，二者可能協(xié)同促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

骨肉瘤；骨軟骨瘤；X連鎖的凋亡抑制蛋白；核因子κB

骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，以高度惡性的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞具有直接形成骨質(zhì)或腫瘤樣類骨質(zhì)的能力。骨肉瘤好發(fā)于青少年，易侵及四肢長(zhǎng)管狀骨的干骺端，每年的發(fā)病率約為3/100萬(wàn)，是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤。骨肉瘤轉(zhuǎn)移率及病死率非常高，早期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差的重要因素。X連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)和核因子κB(NF-κB)在多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1～4]。目前，關(guān)于XIAP和NF-κB在骨肉瘤中表達(dá)及其意義的研究鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)了XIAP和NF-κB在骨肉瘤組織中的表達(dá)，并探討了其與骨肉瘤患者臨床病理資料的關(guān)系，分析了兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集中國(guó)人民解放軍第二五一醫(yī)院2005年1月～2016年1月手術(shù)穿刺或切除的骨肉瘤患者36例，男22例、女14例，年齡10～58歲、中位年齡27.0歲。另收集同期骨軟骨瘤患者20例，男12例、女8例,年齡9～57歲、中位年齡26.2歲。56例患者均經(jīng)過(guò)臨床、病理、影像學(xué)三者結(jié)合確診，均行手術(shù)治療，標(biāo)本采集前均未行任何放化療，術(shù)中留取瘤組織，并制成蠟塊。

1.2 組織中XIAP、NF-κB表達(dá)的檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法。組織標(biāo)本用10%甲醛浸泡，石蠟包埋，常規(guī)厚4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，滅活，微波熱抗原修復(fù)，滴加封閉液，滴加稀釋的濃縮型兔抗人XIAP(BIRC4)多克隆抗體和濃縮型兔抗人NF-κB p65(RELA)多克隆抗體(1∶50)(武漢博士德生物工程有限公司)，4 ℃冰箱過(guò)夜，室溫下復(fù)溫，滴加相應(yīng)的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(美國(guó)KPL公司);DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用武漢博士德生物工程有限公司提供的已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷方法 XIAP以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒作為陽(yáng)性，NF-κB以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性。染色標(biāo)本均由中國(guó)人民解放軍第二五一醫(yī)病理科兩位高年資病理醫(yī)師用雙盲法觀察結(jié)果。根據(jù)細(xì)胞著色程度評(píng)分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)得分相乘為最終結(jié)果：0為染色陰性，1～12為染色陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中XIAP和NF-κB的表達(dá)比較 XIAP陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒性著色。XIAP在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.4%(25/36)和0(0/20)，兩組比較，P<0.01。NF-κB陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒性著色。NF-κB在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.2%(26/36)和15.0%(3/20)，兩組比較，P<0.01。

2.2 骨內(nèi)瘤組織中XIAP和NF-κB表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 XIAP和NF-κB在骨肉瘤中的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及病理分型無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)，而與Enneking分期、分化程度、軟組織侵犯及轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 XIAP和NF-κB表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 骨肉瘤組織中XIAP和NF-κB的相關(guān)性 骨肉瘤組織中XIAP和NF-κB共同陽(yáng)性表達(dá)20例，共同陰性表達(dá)5例;XIAP陽(yáng)性表達(dá)、NF-κB陰性表達(dá)5例;XIAP陰性表達(dá)、NF-κB陽(yáng)性表達(dá)6例。XIAP和NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.396,P<0.05)。

3 討論

XIAP是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的一員，又稱hILP、MIHA或BIRC4。XIAP基因定位于X染色體q24-25上，編碼含有497個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量約為57 kD的蛋白質(zhì)。XIAP是IAPs家族中作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)控及血管生成等過(guò)程[5,6]。XIAP在人體的正常組織內(nèi)廣泛存在且表達(dá)極低，但在多種惡性腫瘤中的表達(dá)顯著增高。美國(guó)癌癥研究所對(duì)60種人類腫瘤細(xì)胞系的研究[7]結(jié)果表明，XIAP在多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中普遍高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力呈正相關(guān),提示其可能是評(píng)估腫瘤惡性程度及預(yù)后的一種有效指標(biāo)。劉志英等[3]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中XIAP蛋白過(guò)表達(dá)，Caspase-3蛋白低表達(dá)甚至缺失。過(guò)表達(dá)的XIAP蛋白抑制了Caspase-3蛋白表達(dá)，從而阻止了細(xì)胞凋亡，并促使乳腺細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。邢旻琰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，XIAP在骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯高于瘤旁正常組織，其表達(dá)與骨肉瘤患者的性別、年齡、腫瘤部位以及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，而與Enneking臨床分期及預(yù)后不良相關(guān),提示其對(duì)判斷骨肉瘤患者的預(yù)后有一定的參考價(jià)值。Qu等[9]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，XIAP在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于瘤旁非腫瘤組織，骨肉瘤組織中XIAP的表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤大小和轉(zhuǎn)移相關(guān)；XIAP-siRNA能下調(diào)沉默骨肉瘤MG63系中XIAP的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、提高骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素及順鉑的化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，XIAP在骨肉瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于骨軟骨瘤，其表達(dá)與骨肉瘤的Enneking分期、分化程度、軟組織侵犯及轉(zhuǎn)移相關(guān)，與文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道類似，提示XIAP可能參與了骨肉瘤的發(fā)展、分化，對(duì)骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

NF-κB是1986年Sen等首次從成熟B淋巴細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白，因其能與B細(xì)胞免疫球蛋白的κ輕鏈基因增強(qiáng)子B序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合而得名。NF-κB普遍存在于自然界大多數(shù)真核細(xì)胞中，且已被證實(shí)是一種具有多項(xiàng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，在眾多的病理生理過(guò)程中有著重要作用[10]。大量研究支持NF-κB在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且NF-κB在腫瘤的多個(gè)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。陳增銀等[4]報(bào)道，NF-κB p65在肝癌患者癌組織中表達(dá)明顯升高，且NF-κB p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)與肝癌患者病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，它可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Neil等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的疾病進(jìn)展與NF-κB的活化密切相關(guān)。付文娟等[12]報(bào)道顯示骨肉瘤組織NF-κB蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于骨軟骨瘤，且骨肉瘤中NF-κB蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡指數(shù)之間呈負(fù)相關(guān)，它參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程,可抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用。Tomonaga等[13]基于NF-κB活化研究表明，線性泛素化修飾介導(dǎo)的NF-κB活化在骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。Yan等[14]新研究證實(shí)，非折疊蛋反應(yīng)能活化NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而使骨肉瘤細(xì)胞耐受順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，NF-κB在骨肉瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率亦顯著高于骨軟骨瘤，并與骨肉瘤的Enneking分期、分化程度、軟組織侵犯及轉(zhuǎn)移相關(guān)，與文獻(xiàn)[12～14]報(bào)道基本一致，提示NF-κB參與了骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

本研究結(jié)果還顯示，XIAP和NF-κB在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示XIAP和NF-κB在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中可能起協(xié)同作用，其可能機(jī)制如下：XIAP是NF-κB的激活子，NF-κB的活化和釋放，導(dǎo)致相應(yīng)的抑制細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)[11,15]；NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，參與多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，XIAP是NF-κB應(yīng)答基因，NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡活性與其上調(diào)XIAP的表達(dá)有關(guān)[16]。其中涉及的具體機(jī)制尚不明確，有待更深一步的研究證實(shí)。

綜上所述，XIAP和NF-κB在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色，而且二者具有相互協(xié)同作用。XIAP與NF-κB有望成為判斷骨肉瘤惡性程度及預(yù)后的有效指標(biāo)。

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